miR-34a生物纳米材料的构建方法及放射增敏应用

摘要

本发明属于生物纳米材料及医学放射治疗领域，具体涉及miR‑34a生物纳米材料的构建方法及放射增敏应用，包括miR‑34a表达载体的构建与转染和miR‑34a外泌体的分离。miR‑34a外泌体生物纳米材料能够高效将miR‑34a释放进入到细胞内。miR‑34a外泌体生物纳米材料中的miR‑34a在各种环境中非常稳定。便于生产、储存、使用。miR‑34a外泌体生物纳米材料低毒。miR‑34a外泌体本身具有在细胞、组织中传递信号的功能，能够在体内外释放miR‑34a，可改善实体瘤的释放效率，并可用于肿瘤的放射治疗。

说明书

技术领域

本发明属于生物纳米材料及医学放射治疗领域，具体涉及miR-34a生物纳米材料的构建方法及放射增敏应用。

背景技术

miRNA在基因后转录调控中具有非常重要的作用。众多的miRNA中，miR-34a是电离辐射、原癌基因胁迫下p53直接转录调节的小RNA分子。其细胞生物学功能多种多样。上调表达miR-34a能够诱导各类肿瘤细胞的凋亡；还可阻滞细胞于G1或G2期；miR-34a还能够抑制肿瘤细胞的转移；诱导细胞的衰老、阻止上皮间质细胞的转化、抑制肿瘤的血管生成和生长。最为重要的发现是miR-34a不仅通过靶向抑制LyGDI信号通路，还可抑制RAD51的表达影响DNA损伤修复而增强细胞的放射敏感性。我们以及他人的研究表明其在改善肿瘤疗效已展示出极具应用前景的价值。

目前，miR-34a在细胞、体内的释放的方法主要有：1构建各类miR-34a的表达载体或合成成熟的miR-34a序列，利用脂质体转染将miR-34a释放进入细胞内实现其抑制肿瘤生长、促进凋亡的作用。该方法是目前的主要技术，其缺点在于转染的效率较低。稳定性差，每次转染的效率比较随机以及在不同细胞的转染效率之间存在差异。此外，脂质体转染试剂的毒性非常大，难以用于体内释放。2利用各种病毒载体将miR-34a释放进入细胞，其解决了转染效率的问题，但病毒载体对人类基因组的安全问题一直未有明确的答案，限制了其体内的应用。3上述两种释放技术均难以在实体瘤细胞释放目的基因。在此背景下，我们需要稳定、高效、低毒的miR-34a体内外释放新技术。

发明内容

本发明的一个目的在于提供稳定、高效、低毒的miR-34a生物纳米材料的构建方法。

为了实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案为：miR-34a生物纳米材料的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)miR-34a表达载体的构建与转染：

a.合成miR-34a前体的寡聚核苷酸序列

miR-34a前体的寡聚核苷酸正向引物S1 5′′-TGCTGCGTCACCTCTTAGGCTTGGA-3′′；

miR-34a前体的寡聚核苷酸反向引物S2 5′′-CCTG CATTGGTGTCGTTGTGCTCTC-3′；

b.退火产生miR-34a前体双链寡聚核苷酸；

c.将miR-34a前体双链寡聚核苷酸克隆到pcDNA^TM6.2GW/miR载体中；

d.转化含有miR-34a前体双链寡聚核苷酸的载体并扩增、纯化目标载体质粒；

e.目标载体质粒转染3SB淋巴瘤细胞并培养；

所述的目标载体质粒是指纯化得到的插入miR-34a前体双链寡聚核苷酸的表达载体。

(2)miR-34a外泌体的分离：

收集上述转染3SB细胞培养液，应用差异离心技术提取细胞培养液中的外泌体。

步骤(2)的具体过程为：收集3SB细胞培养液，在离心力600*g下、4℃离心20分钟，取上清在离心力10000*g下、4℃离心30分钟，再用0.22μm滤膜过滤，取上清在离心力150000*g下、4℃离心8小时，用4℃的PBS溶液洗涤沉淀，得到miR-34a外泌体。

miR-34a外泌体的粒径范围为50-250nm，其中90％的外泌体粒径在50-100nm之间，粒子数量在2×10¹¹/ml至6×10¹¹/ml。

在pH值在3-8范围内，4℃条件下，外泌体中miR-34a非常稳定；在4℃以及pH值7.4条件下，2周以内外泌体中miR-34a未见变化；室温25℃以及生理37℃条件下，1周时间内，miR-34a未见变化，而2周时间miR-34a略微降低，最大降解率小于10％。

本发明的另一个目的在于提供miR-34a生物纳米材料在促使miR-34a释放到细胞内的应用。

本发明的又一个目的在于提供miR-34a生物纳米材料作为放射治疗增敏剂的应用。

外泌体是各种细胞分泌的40-100纳米的微小囊泡物，存在于血液、乳汁、体液、尿液以及肿瘤形成的腹水、粘液中，细胞利用它可与周围基质细胞以及远端组织中的细胞进行蛋白、核酸交换，其主要功能为细胞间的通讯功能。可用于疾病的疾诊断以及药物的体内释放。在分子组成上，外泌体由双层脂质膜包裹的不含细胞器的细胞质成份构成，包含各种蛋白质和RNA(包括miRNA)成份。因此，我们利用外泌体本身就是细胞的内源性纳米生物物质，能够包裹miRNA，并具有在不同组织、细胞间进行信号转导的功能，通过构建表达miR-34a载体，在3SB淋巴细胞表达并获得miR-34a外泌体，建立基于miR-34a外泌体的生物新材料用于高效释放miR-34a和放射增敏技术。

本发明与现有技术相比，具有以下有益效果：

miR-34a外泌体生物纳米材料能够高效将miR-34a释放进入到细胞内。

miR-34a外泌体生物纳米材料中的miR-34a在各种环境中非常稳定。便于生产、储存、使用。

miR-34a外泌体生物纳米材料低毒。

miR-34a外泌体本身具有在细胞、组织中传递信号的功能，能够在体内外释放miR-34a，可改善实体瘤的释放效率，并可用于肿瘤的放射治疗。

附图说明

图1a和图1b为miR-34a表达载体的构建与转染表达的示意图；

图2差异离心技术提取细胞培养液中外泌体的示意图；

图3 miR-34a外泌体纳米材料的特征分析示意图；

图4 miR-34a外泌体生物纳米材料的稳定性分析示意图；

图5 miR-34a外泌体在细胞内的分布与放射增敏作用示意图；

图6 miR-34a外泌体的体内放射增敏作用示意图。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步地说明。

1.miR-34a表达载体的构建与转染(具体过程参见图1a和图1b)

1.1miR-34a前体单链寡聚DNA的设计：

根据miR-34a的前体序列，设计合成miR-34a前体的寡聚核苷酸序列。在miR-34a前体的寡聚核苷酸正向序列5′端分别加上TGCTG结构序列；并在反向序列5′端加入CCTG，3′′端加入C。

miR-34a的前体DNA序列：

miR-34a前体的正向序列5′-CGTCACCTCTTAGGCTTGGA-3′

miR-34a前体的反向序列5′-CATTGGTGTCGTTGTGCTCT-3′

合成miR-34a前体的寡聚核苷酸序列

miR-34a前体的寡聚核苷酸正向引物S1 5′-TGCTG CGTCACCTCTTAGGCTTGGA-3′

miR-34a前体的寡聚核苷酸反向引物S2 5′-CCTG CATTGGTGTCGTTGTGCTCT C-3′1.2退火产生miR-34a前体双链寡聚核苷酸:

1.2.1产生miR-34a前体寡聚核苷酸双链的反应体系

1.2.2用振荡器混合均与并95℃加热4分钟。

1.2.3取出样品试管并放置在室温下冷却5-10分钟。

1.2.4轻微震荡并离心5秒使其至试管底部。

1.2.5用不含DNA/RNA酶的双蒸水将混合的miR-34a前体双链寡聚核苷酸首先稀释100倍，再用1X退火缓冲液将其进一步稀释50倍，使其终浓度为10nM。

1.3克隆miR-34a前体双链寡聚核苷酸到pcDNA^TM6.2GW/miR载体中：

1.3.1克隆miR-34a前体双链寡聚核苷酸的反应体系

1.3.2充分混合均匀后，在室温条件下孵育5分钟。

1.3.3然后放置于冰上，用于下面大肠杆菌的转化。

1.4载体的转化

1.4.1加入2μl连接液于50μl新制备的大肠杆菌TOP10感受态细胞中，并轻轻混匀。

1.4.2在冰上孵育5-30分钟。

1.4.3 42℃热激30秒(请勿摇动)，迅速置于冰上。

1.4.5加入250μl室温下的S.O.C培养基。

1.4.4在37℃条件下震荡培养1小时。

1.4.5取20-200μl上述的S.O.C培养液，涂于事先预热的含50μg/ml的奇放线菌素(spectinomycin)的LB琼脂糖培养基的细菌培养板上，37℃培养过夜筛选克隆。

1.4.6用purelink^TMHipure试剂盒纯化质粒载体。

1.5转染3SB淋巴瘤细胞：

1.5.1细胞培养：在10厘米的细胞培养皿中，加入10ml Gibco公司的培养液DMEM,外加150μmol/L的L型天门冬氨酸以及10％牛血清。3SB淋巴瘤细胞的接种数量为10⁶个/ml，悬浮培养温度的控制在37℃并保持5％的CO₂。在细胞数量达到10⁷个/ml,用于细胞转染。

1.5.2miR-34a质粒DNA的稀释：10厘米细胞培养皿培养的3SB淋巴瘤细胞(10⁷个/ml)的转染。用0.5ml无血清的Opti-MEM培养液稀释12.5μg的pcDNA^TM6.2GW/miR-34a质粒DNA。

1.5.3在0.5ml含有上述质粒DNA的Opti-MEM稀释液中加入30-45μl的Lipofectamine^TMLTX>TM转染试剂，并轻轻震荡3-5秒，在室温下放置25分钟。让pcDNA^TM6.2GW/miR-34a质粒DNA与Lipofectamine^TMLTX形成稳定的复合物。

1.5.4在10厘米细胞培养皿中，逐滴加入0.5ml的pcDNA^TM6.2GW/miR-34a-Lipofectamine^TMLTX的复合物,然后，前后左右轻微摇匀。

1.5.5将转染后的3SB淋巴瘤细胞置于37℃并保持5％的CO₂的培养箱中，收集培养48-72小时后的细胞液。

构建miR-34a表达载体的使用的试剂与成份见表1。

表1构建miR-34a表达载体的使用的试剂与成份

2.miR-34a外泌体的分离技术

收集上述转染3SB细胞培养液500ml，应用差异离心技术提取细胞培养液中的外泌体。提取流程如下(图2)。收集细胞培养液，在离心力600*g下、4℃离心20分钟，取上清在离心力10000*g下、4℃离心30分钟，再用0.22μm滤膜过滤，取上清在离心力150000*g下、4℃离心8小时，用4℃的PBS溶液洗涤沉淀，得到外泌体。所述的PBS溶液为pH7.4的浓度为1M的PBS的磷酸缓冲液。

3.miR-34a外泌体纳米材料的鉴定分析

上述超速离心法获得的离心沉淀物，用pH7.4磷酸缓冲液(PBS)200μl溶解。取3μl用于电镜分析所获得外泌体的形态以及大小。形态学观察发现外泌体为直径40-250nm的球状体(图3A)。进一步我们用Nano Tracker分析了外泌体粒径的分布以及浓度，外泌体分布范围在50-250nm之间，其中90％的外泌体粒径在50-100nm之间，粒子数量在2×10¹¹/ml至6×10¹¹/ml(图3B)。蛋白印记

法分析外泌体的标志性蛋白，证实获得的生物材料含有外泌体标志性蛋白CD63(图3C)。再者，转染的细胞以及转染细胞获得的外泌体中，miR-34a的表达水平分别高于对照细胞28.9倍和17.8倍(图3D)。这些数据表明通过载体构建，转染表达、超速离心技术所获得的miR-34a外泌体是成功的。

图3A电镜观察miR-34a外泌体的形态。图3B Nano Tracker分析miR-34a外泌体的粒径分布以及浓度(数量/单位，个数/ml)。图3C蛋白印记法分析外泌体标志性蛋白的表达。图3D在对照、转染细胞以及外泌体中miR-34a的表达水平。

4miR-34a外泌体生物纳米材料的稳定性

通常情况下，RNA分子非常容易发生降解。而外泌体中miR-34a的稳定性将影响其功能以及在细胞内的释放效率。因此，我们用RT－PCR技术分析了miR-34a外泌体中miR-34a随磷酸缓冲液pH，温度、时间以及表面活性剂(十二烷基磺酸钠)后的变化(RNA酶A作为对照)。试验结果表明，在pH值在3-8范围内，4℃外条件下，泌体中miR-34a非常稳定(图4A)。在4℃以及pH值7.4条件下，2周以内外泌体中miR-34a未见变化(图4B)。室温25℃以及生理37℃条件下，1周时间内，miR-34a未见变化，而2周时间miR-34a略微降低，最大降解率小于10％。表面活性剂对外泌体中miR-34a的影响非常显著，4℃以及pH值7.4外条件下，加入o.1mmol十二烷基磺酸钠,1小时的miR-34a水平下降50％(图4A)。表明外泌体中的miR-34a在正常的生理环境中非常稳定。

图4A实时定量PCR分析外泌体中miR-34a随PBS缓冲溶液pH的变化。图4B实时定量PCR分析外泌体中miR-34a随时间(0-14天)的变化。图4C实时定量PCR分析外泌体中miR-34a随温度的变化

5miR-34a外泌体生物纳米材料的放射增敏作用

上述获得的miR-34a外泌体用PKH67荧光染料进行染色，并在6孔板中接种10⁵个肺肿瘤A549细胞，待细胞生长至80％时，每孔加入10μg>0值1.09±0.05Gy)和30nM的miR-34a合成序列的脂质体转染的D₀值(D₀值1.13±0.10Gy)显著低于单独照射组(D₀值1.502±0.17Gy)以及转染对照miRNA组(D₀值1.507±0.09Gy)，P<0.05(图5C)。表明miR-34a外泌体可增强肺癌肿瘤细胞的放射敏感性。进一步我们用细胞流式技术(AnnexinV和PI双染色)分析了10μg的miR-34a外泌体、30nM合成的miR-34a单独处理以及联合2GyX射线照射后，48小时A549细胞的凋亡率。结果表明10μg的miR-34a外泌体联合2GyX射线照射(凋亡率50.0±4.6％)显著高于miR-34a外泌体单独处理组(35.3±2.8％)，P<0.05。30nM合成的miR-34a联合2GyX射线照射(凋亡率43.2±2.4％)显著高于miR-34a单独处理组(31.3±4.5％)，P<0.05(图5D)。这些结果表明miR-34a外泌体能够高效将miR-34a载带进入细胞内，并通过诱导细胞凋亡机制，从而增强肺癌肿瘤细胞的放射敏感性。

图5A荧光显微镜观察miR-34a外泌体在细胞内的分布。10μg PKH67染色标记miR-34a外泌体后处理A549，DAPI染色细胞核。图5B 10μg的miR-34a外泌体作用于A549细胞12小时后细胞内活性自由基的变化。10μM的DCFH-DA检测活性氧自由基,Hoechst染色观察细胞核。图5C克隆形成试验分析miR-34a外泌体以及合成miR-34a的放射增敏作用。D10μg的miR-34a外泌体以及合成miR-34a单独处理以及联合2GyX射线照射诱导的细胞凋亡。AnnexinV和PI双染色，细胞流式技术分析细胞的凋亡率。

6miR-34a外泌体生物纳米材料的体内放射增敏作用

为进一步更加直观地观察miR-34a外泌体在细胞内的释放效率，我们构建了带有GFP绿色荧光蛋白标记的pcDNA 3.1GFP融合的miR-34a表达载体，同样转入3SB细胞，并用同样的技术获得miR-34a外泌体。用荧光显微镜观察了GFP融合的miR-34a表达载体和miR-34a外泌体在细胞内的释放效率。结果表明miR-34a外泌体在A549细胞中具有非常高的释放效率(图6A)。

进一步验证miR-34a外泌体的体内放射增敏作用。利用异源性裸鼠接种试验，在裸鼠体内接种1X10⁵个A549细胞的两周后，用免疫组化Ki67染色分析肿瘤结节细胞的增殖情况，发现与对照组比较，miR-34a外泌体的处理组减少了73％的Ki67染色(P<0.001)，miR-34a外泌体联合2GyX射线照射减少了91％(P<0.002)(图6B)。表明miR-34a外泌体显著地抑制了A549肿瘤细胞的增殖能力，而且，miR-34a外泌体在体内同样具有增强放射敏感性的作用。

同样，我们在裸鼠体内接种1X10⁵个A549细胞的两周后，通过尾部静脉将miR-34a外泌体注射BALB/c雄性裸鼠。分别给予2Gy的X射线照射。观察BALB/c雄性裸鼠的生存周期，结果发现接种对照A549细胞的裸鼠生存周期为32±3.5天，而接受miR-34a外泌体注射的裸鼠的生存期为60±4.1天(p＝0.0095),miR-34a外泌体注射联合X射线照射裸鼠的生存周期为70±3.4天(P＝0.0075)。miR-34a外泌体组和联合X射线照射组与对照组比较，荷瘤裸鼠的生存周期分别延长了1.88和2.19倍(图6C)。证实miR-34a外泌体在体内同样具有增强电离辐射敏感性的作用。

图6A用pcDNA3.1GFP融合的miR-34a载体观察分析miR-34a外泌体的释放效率。图6B Ki67染色免疫组化分析miR-34a外泌体以及联合2GyX射线照射A549细胞在裸鼠体内的增殖。图6C分析miR-34a外泌体以及联合2GyX射线照射接种A549细胞的裸鼠体生存率。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和等同形式的替换，这些改进和等同替换得到的技术方案也应属于本发明的保护范围。