一种瑞加诺生有关物质的高效液相色谱分析方法

摘要

本发明公开了一种瑞加诺生有关物质的高效液相色谱分析方法，该方法采用反相色谱柱及紫外检测器，以1‑烷基磺酸钠溶液‑甲醇为流动相，进行梯度洗脱。本方法可同时分析瑞加诺生原料及制剂中的所有已知杂质，并且可通过加校正因子的主成分自身对照法有效控制各已知杂质的含量，各杂质峰之间及主峰与相邻杂质峰之间的分离度均大于1.5，主峰与各杂质峰的峰纯度均大于1.0。本发明为瑞加诺生原料及制剂的质量控制提供了简易和可靠的分析方法。

说明书

技术领域

本发明属于药物分析领域，具体涉及一种瑞加诺生有关物质的高效液相色谱分析方法。

背景技术

瑞加诺生（Regadenoson），化学名称1-(6-氨基-9-((2S,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟甲基)四氢呋喃环-基)-9H-嘌呤-2-基)-N-甲基-1H-吡唑-4-甲酰胺一水合物，结构式如下所示，

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瑞加诺生（Regadenoson，商品名Lexiscan）是CV Therapeutics公司开发的一种选择性腺苷受体激动剂，可使冠状动脉产生舒张。这款药物用于不能接受运动压力测试患者的放射性核素心肌灌注显像。临床医师也超适用症将其用于CT影像。

瑞加诺生杂质较多，从来源看，瑞加诺生的杂质主要来源于合成过程中引入的反应原料、合成中间体、反应副产物及降解杂质，瑞加诺生制剂的杂质来源于原料引入杂质、工艺杂质及降解杂质。

目前瑞加诺生原料及其制剂的分析方法主要依赖于精密的仪器和复杂的研究。美国、欧洲、日本等国药典中未收载瑞加诺生质量标准，对于瑞加诺生有关物质或质量研究的文献较少。文献“中国医药工业杂志，2015，46（7）：683-686”报道了两种诺加诺生的有关物质，文中记为有关物质A和有关物质B，如下所示，

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该篇文献报道的有关物质数量有限，且不全面。本发明人通过重复试验条件后发现，其公开的液相条件和分析方法只能局限于检到瑞加诺生质量分析中的极个别杂质。也即本发明所述杂质在上述条件下无法有效地分离分析，更无法准确定量测定这些潜在的杂质，给瑞加诺生的用药安全带来很大风险。

发明内容

本发明的目的在于提供一种瑞加诺生有关物质的高效液相色谱分析方法。

针对现有文献对瑞加诺生原料及制剂杂质研究的缺失，发明人通过工艺试制、强制降解试验对瑞加诺生杂质进行富集、分离提纯，具体操作可采用本领域技术人员熟知的富集杂质和分离提纯的方法，例如，增加有机反应的投料量，浓缩收集母液，进行柱层析、重结晶等纯化方式获得的高纯度杂质。

本发明所用瑞加诺生α异构体杂质对照品可以通过增加瑞加诺生合成过程中相关反应的投料量，浓缩收集母液，进行柱层析纯化后得到的高纯度的α异构体杂质。

本发明人总共鉴定了7个主要杂质，并且对杂质进行了溯源归属，包括瑞加诺生合成起始物料（杂质A）、、合成中间体（杂质D、杂质F）、瑞加诺生合成副产物（杂质G、杂质H、杂质I、杂质J），结构分别如下所示，

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其中，文献“中国医药工业杂志，2015，46（7）：683-686”有关物质A就是本发明中的杂质G，有关物质B就是杂质J。本发明首次公开了瑞加诺生的α异构体杂质，即杂质H。现有技术中从未获得过该杂质，更加未出现关于该α异构体杂质的质量分析的文献报道。

发明人曾试图通过等度洗脱分离各杂质，但在保证各杂质达到基线分离的情况下色谱保留时间大于2.5h，耗时，不实用。因此，改用梯度洗脱法，经对流动相组成及比例的优化筛选，最终确定本发明的分析方法。同时按中国药典2015版二部通则0512（高效液相色谱法）及通则9101（药品质量标准分析方法验证指导原则）的定义及验证方法，进行专属性验证。结果表明该方法可同时分析瑞加诺生原料及制剂中的所有杂质，并且可通过加校正因子的主成分自身对照法有效控制各杂质含量，各杂质峰之间及主峰与相邻杂质峰之间的分离度均大于1.5，主峰与各杂质峰峰纯度均为1.0。

所述“峰纯度”是指采用配有相应分析软件的光二极管阵列检测器，采集、记录、分析经色谱柱分离组份的光谱数据，自动生成的表征特定分离组份对应的光谱特征一致性的加权值。

本发明报道了一种瑞加诺生有关物质的高效液相色谱分析方法，采用反相色谱柱及紫外检测器，是以1-烷基磺酸钠溶液-甲醇为流动相，进行梯度洗脱，达到分离分析瑞加诺生各有关物质的目的。

本发明首先涉及应用于分离检测瑞加诺生及其有关物质的试剂组合物，该试剂组合物由如下试剂组成：“试剂A”是加有1-烷基磺酸钠的磷酸盐缓冲体系，所述1-烷基磺酸钠的浓度为1mmol/L-20mmol/L；缓冲体系中磷酸的浓度为0.015-0.055mol/L，用氢氧化钠调节pH为3.9-4.5；“试剂B”是甲醇或乙腈中的一种；其中，所述“1-烷基磺酸钠”选自1-戊烷磺酸钠、1-己烷磺酸钠、1-庚烷磺酸钠中的一种或多种。

本发明的试剂组合物，优选地，“试剂A”中，所述“1-烷基磺酸钠”选自1-戊烷磺酸钠或者1-己烷磺酸钠，且浓度为5mmol/L-15mmol/L；缓冲体系中磷酸浓度为0.02-0.04mol/L，用氢氧化钠调节pH为4.0-4.3；“试剂B”是甲醇。

最重要地，本发明提供一种检测瑞加诺生原料药或注射液中有关物质的高效液相色谱分析方法，利用上述的试剂组合物作为流动相，包含如下步骤：

（1）色谱条件设置：采用反相C18柱，柱温设置在20-50℃；以“试剂A”为流动相A，以“试剂B”为流动相B，进行梯度洗脱；流速为0.5-2.0ml/min；检测波长为240-260nm；洗脱液由流动相A和流动相B构成；

（2）供试品溶液制备：取瑞加诺生原料药或注射液适量，配制成浓度为0.01-1.0mg/ml的瑞加诺生溶液；

（3）对照溶液制备：精密量取供试品溶液1ml，置100ml量瓶中，用洗脱液稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；

（4）系统适应性溶液制备：分别取瑞加诺生对照品、杂质D对照品、杂质G对照品、杂质A对照品、杂质I对照品、杂质H对照品、杂质J对照品、杂质F对照品各适量，加甲醇溶解，并用稀释剂制成每1ml中各含约0.4μg的溶液，作为系统适应性溶液；

（5）检测：精密量取系统适应性溶液20μl，注入液相色谱仪，各杂质峰之间的分离度应符合要求；再精密量取对照溶液和供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；

其中，各杂质的化学结构如下所示，

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本发明的高效液相色谱分析方法，进一步优选地，步骤（1）中反相C18柱为AgilentC18（250×4.6mm，5μm）、Welch Xtimate C18（250×4.6mm，5μm）、Waters C18（250×4.6mm，5μm）中的一种。

本发明的高效液相色谱分析方法，进一步优选地，步骤（1）中反相C18柱为AgilentC18（250×4.6mm，5μm）。

本发明的高效液相色谱分析方法，进一步优选地，步骤（2）中流动相A为1mmol/L-20mmol/L的1-戊烷磺酸钠溶液；流动相B为甲醇。

本发明的高效液相色谱分析方法，进一步优选地，步骤（2）中流动相A为1-戊烷磺酸钠的磷酸盐缓冲体系，所述1-戊烷磺酸钠的浓度为15mmol/L；缓冲体系中磷酸的浓度为0.02mol/L，用氢氧化钠调节pH为4.2；流动相B为甲醇。

本发明的高效液相色谱分析方法，进一步优选地，步骤（1）中梯度洗脱程序为：0min-40min流动相A占洗脱液的体积百分比由90%逐步递减至55%，40min-50min流动相A占洗脱液的体积百分比由55%逐步递减至40%，50min-50.01min流动相A占洗脱液的体积百分比由40%直接转换为90%，50.01min-60min流动相A占洗脱液的体积百分比90%。

本发明的高效液相色谱分析方法，进一步优选地，步骤（1）中流速为1.0ml/min，检测波长为247nm，柱温为35℃。

特别优选地，本发明提供了一种高效液相分析方法，该方法可以检测瑞加诺生原料药或者瑞加诺生注射液中的有关物质，且注射液规格为0.4mg/5mL；

检测瑞加诺生原料药的有关物质的分析方法具体包含如下步骤：

（a）色谱条件设置：采用反相C18柱为Agilent C18（250×4.6mm，5μm），柱温35℃；流动相A为1-戊烷磺酸钠的磷酸盐缓冲体系，所述1-戊烷磺酸钠的浓度为15mmol/L，缓冲体系中磷酸的浓度为0.02mol/L，用氢氧化钠调节pH为4.2；流动相B为甲醇，进行梯度洗脱；流速为1.0ml/min；检测波长为247nm；洗脱液由流动相A和流动相B构成，洗脱程序如下，

；

（b）供试品溶液制备：取瑞加诺生原料药约10mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇8ml使之溶解，并用水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；

（c）对照溶液制备：精密量取1ml，置100ml量瓶中，用洗脱液稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；

（d）系统适应性溶液制备：分别取瑞加诺生对照品、杂质D对照品、杂质G对照品、杂质A对照品、杂质I对照品、杂质H对照品、杂质J对照品、杂质F对照品各适量，加甲醇溶解，并用稀释剂制成每1ml中各含约0.4μg的溶液，作为系统适应性溶液；

（e）检测：精密量取系统适应性溶液20μl，注入液相色谱仪，各杂质峰之间的分离度应符合要求；再精密量取对照溶液和供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图；

或者，检测瑞加诺生注射液的有关物质的分析方法具体包含如下步骤：

（I）色谱条件设置：采用反相C18柱为Agilent C18（250×4.6mm，5μm），柱温35℃；流动相A为1-戊烷磺酸钠的磷酸盐缓冲体系，所述1-戊烷磺酸钠的浓度为15mmol/L，缓冲体系中磷酸的浓度为0.02mol/L，用氢氧化钠调节pH为4.2；流动相B为甲醇，进行梯度洗脱；流速为1.0ml/min；检测波长为247nm；洗脱液由流动相A和流动相B构成，洗脱程序如下，

；

（II）供试品溶液制备：取瑞加诺生注射液，浓度为0.4mg/5mL，作为供试品溶液；

（III）对照溶液制备：精密量取1ml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；

（IV）系统适应性溶液制备：分别取瑞加诺生对照品、杂质D对照品、杂质G对照品、杂质A对照品、杂质I对照品、杂质H对照品、杂质J对照品、杂质F对照品各适量，加甲醇溶解，并用稀释剂制成每1ml中各含约0.4μg的溶液，作为系统适应性溶液；

（V）检测：精密量取系统适应性溶液20μl，注入液相色谱仪，各杂质峰之间的分离度应符合要求；再精密量取对照溶液和供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。

采用本发明方法可有效地控制瑞加诺生原料及制剂中的有关物质，7个杂质加上瑞加诺生本身，均能在一张图谱上分析出来，各杂质峰之间及主峰与相邻杂质峰之间的分离度均大于1.5，主峰与各杂质峰峰纯度均为1.0。系统适应性的典型色谱图见附图1，计算结果见表1。

采用本发明方法能够分析瑞加诺生在各种复杂环境下的降解杂质，方法专属性强。按中国药典2015版通则0512及通则9101（药品质量标准分析方法验证指导原则）的定义及验证方法，将瑞加诺生分别用酸、碱、高温、氧化、光照破坏，制得破坏样品，按本发明方法分别采集各破坏样品色谱图，分析过程见实施例4，典型色谱图见附图4-9。结果表明该方法能够分析经酸、碱、高温、氧化、光照破坏的样品，主峰与各杂质峰均能达到基线分离，主峰纯度均为1.0。

采用本发明方法能对各杂质进行定量分析。按中国药典2015版通则0512及通则9101（药品质量标准分析方法验证指导原则）的定义及验证方法，采用杂质对照法对瑞加诺生7个杂质的检测限、定量限进行检测，结果表明该方法对各杂质的响应值高，能有效控制各杂质，结果见表2。

本发明取得的有益的技术效果在于：

（1）本发明首次对瑞加诺生原料药及注射液杂质进行溯源归属，鉴定了7个有关物质，为瑞加诺生原料及其制剂有关物质研究提供了可靠的杂质谱参考，具有较大的积极进步效果和实际应用价值。

（2）现有技术中没有关于瑞加诺生α异构体杂质的报道和分离分析方法。本发明首次揭示了该α异构体杂质的液相色谱特性，并且能够在同一张色谱图完整显现。同时，本发明的液相方法可以将未见报道的瑞加诺生α异构体杂质与其他有关物质有效分离并准确分析，提高了瑞加诺生的质量标准，进一步降低发生不良反应的概率，保障了人民群众的用药安全。

附图说明

图1是瑞加诺生与7个杂质的混合进样，所得系统适应性试验图谱。

图2是实施例3中条件1的系统适用性试验图谱。

图3是实施例3中条件2的系统适用性试验图谱。

图4是实施例2酸破坏色谱图。

图5是实施例2碱破坏色谱图。

图6是实施例2高温破坏色谱图。

图7是实施例2氧化破坏色谱图。

图8是实施例2光照破坏色谱图。

图9是实施例2未破坏样品色谱图。

具体实施方式

实施例1 瑞加诺生原料药中有关物质的高效液相色谱分析方法

检测瑞加诺生原料药中有关物质的高效液相色谱分析方法，具体包含如下步骤：

（a）色谱条件设置：采用反相C18柱为Agilent C18（250×4.6mm，5μm），柱温35℃；流动相A为1-戊烷磺酸钠的磷酸盐缓冲体系，所述1-戊烷磺酸钠的浓度为15mmol/L，缓冲体系中磷酸的浓度为0.02mol/L，用氢氧化钠调节pH为4.2；流动相B为甲醇，进行梯度洗脱；流速为1.0ml/min；检测波长为247nm；洗脱液由流动相A和流动相B构成，洗脱程序如下，

；

（b）供试品溶液制备：取瑞加诺生原料药约10mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇8ml使之溶解，并用水稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液；

（c）对照溶液制备：精密量取1ml，置100ml量瓶中，用洗脱液稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；

（d）系统适应性溶液制备：分别取瑞加诺生对照品、杂质D对照品、杂质G对照品、杂质A对照品、杂质I对照品、杂质H对照品、杂质J对照品、杂质F对照品各适量，加甲醇溶解，并用稀释剂制成每1ml中各含约0.4μg的溶液，作为系统适应性溶液；

（e）检测：精密量取系统适应性溶液20μl，注入液相色谱仪，各杂质峰之间的分离度均应符合要求；再精密量取对照溶液和供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，其中，各杂质的化学结构如下所示，

。

根据上述加校正因子的自身对照法，计算瑞加诺生原料药中各有关物质的含量。

瑞加诺生3批中试样品有关物质检查，试验结果见表3所示。

实施例2 瑞加诺生注射液中有关物质的高效液相色谱分析方法

检测瑞加诺生注射液中有关物质的高效液相色谱分析方法，具体包含如下步骤：

（I）色谱条件设置：采用反相C18柱为Agilent C18（250×4.6mm，5μm），柱温35℃；流动相A为1-戊烷磺酸钠的磷酸盐缓冲体系，所述1-戊烷磺酸钠的浓度为15mmol/L，缓冲体系中磷酸的浓度为0.02mol/L，用氢氧化钠调节pH为4.2；流动相B为甲醇，进行梯度洗脱；流速为1.0ml/min；检测波长为247nm；洗脱液由流动相A和流动相B构成，洗脱程序如下，

；

（II）供试品溶液制备：取瑞加诺生注射液，浓度为0.4mg/5mL，作为供试品溶液；

（III）对照溶液制备：精密量取1ml，置100ml量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；

（IV）系统适应性溶液制备：分别取瑞加诺生对照品、杂质D对照品、杂质G对照品、杂质A对照品、杂质I对照品、杂质H对照品、杂质J对照品、杂质F对照品各适量，加甲醇溶解，并用洗脱液制成每1ml中各含约0.4μg的溶液，作为系统适应性溶液；

（V）检测：精密量取系统适应性溶液20μl，注入液相色谱仪，各杂质峰之间的分离度均应符合要求；再精密量取对照溶液和供试品溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，其中，各杂质的化学结构如下所示，

。

根据上述加校正因子的自身对照法，计算瑞加诺生注射液中各有关物质的含量。

瑞加诺生注射液3批中试样品有关物质检查，试验结果见表4。

实施例3 流动相条件的筛选和摸索

取瑞加诺生对照品，以及杂质A、杂质D、杂质F、杂质G、杂质H、杂质I和杂质J各适量，配制成一定浓度的溶液，作为系统适应性溶液进行考察。量取系统适应性溶液适量，注入高效液相色谱仪，现将主要试验结果汇总见附图2-3和附图1。

注1程序如下，

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实施例4 强制降解试验

流动相A为1-戊烷磺酸钠的磷酸盐缓冲体系，所述1-戊烷磺酸钠的浓度为15mmol/L，缓冲体系中磷酸的浓度为0.02mol/L，用氢氧化钠调节pH为4.2；流动相B为甲醇，进行梯度洗脱；流速为1.0ml/min；检测波长为247nm；柱温35℃。洗脱液由流动相A和流动相B构成，按如下的梯度洗脱程序进行考察，色谱柱是Agilent C18（250×4.6mm，5μm），

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以瑞加诺生注射液为考察对象，配置一系列强制降解试验样品。

酸破坏：取本品注射液6ml，置10ml两瓶中，加5mol/L盐酸溶液1ml，水浴加热2h，取出，放冷，加5mol/L氢氧化钠溶液1ml中和，加本品稀释至刻度，摇匀，作为酸破坏溶液。

碱破坏：取本品注射液6ml，置10ml量瓶中，加5mol/L氢氧化钠溶液1ml，水浴加热2h，取出，放冷，加5mol/L盐酸溶液1ml中和，加本品稀释至刻度，摇匀，作为碱破坏溶液。

高温破坏：取本品注射液，置水浴中加热2h，取出，放冷，作为高温破坏溶液。

氧化破坏：取本品注射液6ml，置10ml量瓶中，加30%过氧化氢溶液1ml，水浴加热2h，取出，放冷，加本品稀释至刻度，摇匀，作为氧化破坏样品。

光破坏：取本品注射液，置4500±500Lx的强光下照射24h后，取出，作为光照破坏溶液。

未破坏：取本品注射液。

按照上述液相条件，取上述各样品溶液，分别进样20μl，分别记录色谱图。

典型色谱图见图4-9。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用以限定本发明的实质技术内容，本发明的实质技术内容是广义地定义于申请的权利要求范围汇总，任何他人完成的技术实体或方法，若是与申请的权利要求范围所定义的完全相同，也或是一种等效的变更，均将被视为涵盖于本权利要求范围之中。