一种基于核酸适配体和纳米模拟酶检测卡那霉素残留的电化学检测方法

摘要

一种基于核酸适配体和纳米模拟酶检测卡那霉素残留的电化学检测方法，属于分析化学技术领域。本发明利用酪氨酸还原氯金酸合成金纳米颗粒，催化过氧化氢与还原态的硫堇发生反应生成氧化态的硫堇，后者可通过差分脉冲伏安法进行检测。用卡那霉素特异性适配体对金纳米颗粒进行修饰，该适配体吸附于金纳米颗粒表面而抑制了其过氧化物酶活性。当目标物卡那霉素存在时，能将适配体从金纳米颗粒表面竞争置换下来形成复合物，从而恢复其过氧化物酶活性。利用差分脉冲伏安法检测氧化态硫堇的还原峰电流值和抗生素浓度之间的关系可实现对卡那霉素的检测。本发明提供的方法具有良好的重复性、稳定性和高灵敏度，可用于食品样品中卡那霉素残留的有效检测。

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于核酸适配体和纳米模拟酶检测卡那霉素残留的电化学检测方法，属于分析化学技术领域。

背景技术

卡那霉素（kanamycin）是一种广谱型氨基糖甙类抗生素，分子式C₁₈H₃₈N₄O₁₅S，分子量582.58。卡那霉素主要由灰色链霉菌或小单胞菌发酵液中提取或以天然品为原料半合成提取。卡那霉素硫酸盐作为一种水溶性的抗生素，对许多革兰氏阴性细菌包括沙门氏菌、肺结核杆菌和某些革兰氏阳性菌有疗效，因其价格低廉，用药方便，抗菌谱广被广泛用作人畜共用药，效果优良。在农业，畜牧业，水产业中卡那霉素不仅可以治疗各种感染类疾病，同时还可以促进畜禽生长，提高经济效益。但是不合理使用卡那霉素会导致动物源性食品中卡那霉素的残留，通过生物循环系统进入人体，引起人体不同程度的损害，伴随而来的是对公众健康和环境的潜在危害。各国政府机构根据其经济发展水平对动物源性食品中抗生素残留的最大允许残留限量（MRL）做了明确规定，目前我国规定牛乳中卡那霉素的MRL≤200μg·kg^-1。

传统的卡那霉素残留检测方法有微生物检测法和仪器检测法，后者包括气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）、液-质联用法（HPLC-MS）、液相色谱-串极质谱法（HPLC-MS/MS）、紫外分光光度计法（UV）、酶联免疫分析法（ELISA）等。微生物检测法应用较为广泛，其优点是费用低，一般实验室都能操作，但测定时间长，结果误差较大，操作复杂，不能适应特异性、定量检测的需求。仪器检验方法是利用卡那霉素结构和理化性质来进行分离和定性定量测定，其准确性好，但往往设备昂贵，对实验人员也有较高的要求，对样品的预处理要求较高，分析费时而不易推广。因而，建立操作简单便携，特异性好，灵敏度高的卡那霉素检测方法，对加强动物源食品中卡那霉素残留的监控，保障食品安全具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是将纳米生物技术、核酸适配体及电化学检测等诸多技术的优势联合起来，建立一种简便快速而又具有极高灵敏度的卡那霉素残留分析方法。

本发明的技术方案，一种基于核酸适配体和金纳米颗粒模拟酶的卡那霉素残留的检测方法，将金纳米颗粒与卡那霉素特异性适配体孵育，适配体ssDNA附着在金纳米颗粒表面，从而使得其过氧化物酶活性受到抑制，当加入含有卡那霉素的样品溶液时，卡那霉素与其适配体亲和力大于适配体和金纳米颗粒的结合力，卡那霉素与其适配体特异性竞争结合形成复合物，使得金纳米颗粒表面重新暴露，从而恢复相应的过氧化物酶活性，催化反应体系中的过氧化氢和还原态(red)硫堇发生反应生成氧化态(ox)硫堇；具体反应式如下：

纳米模拟酶：H₂O₂+硫堇(red)→H₂O+硫堇(ox)(1)

电极反应：硫堇(ox)+2e^-+2H⁺→硫堇(red)(2)

通过差分脉冲伏安法对氧化态的硫堇进行测定，所得峰电流与卡那霉素浓度间存在线性关系，从而可以对卡那霉素进行定量分析，具体原理如图1所示。

一种基于核酸适配体和纳米模拟酶检测卡那霉素残留的电化学检测方法，包括以下步骤：利用酪氨酸作为还原剂和捕获剂制备金纳米颗粒模拟酶，采用卡那霉素特异性适配体修饰获得功能化金纳米颗粒；再将含不同浓度的卡那霉素的样品与功能化金纳米颗粒混合，竞争吸附在金纳米颗粒表面的适配体，最后构建纳米模拟酶反应体系并通过电化学信号的测定，绘制得到峰电流与卡那霉素浓度间的线性曲线，再以同样的步骤和试剂对卡那霉素残留实现检测。

具体步骤如下：

（1）金纳米颗粒模拟酶的制备：利用酪氨酸作为还原剂和捕获剂制备而成金纳米颗粒模拟酶：将含有0.1~0.5mM酪氨酸和0.1~0.5mMKOH的300mL超纯水溶液煮沸3~5min，立即加入1.02mL质量体积比为1%~3%的氯金酸溶液并在沸水浴中保温5~10min；继续在沸水浴中持续沸腾至溶液体积减少至30mL，得到不同粒径的金纳米颗粒溶液；将上述金纳米颗粒溶液提前在沸水中处理过的截留分子量为12kDa的透析袋中透析除去多余的KOH，金属离子及酪氨酸，得到金纳米颗粒模拟酶，置于4℃冰箱中保存备用；

（2）功能化金纳米颗粒的制备：

a、适配体的预处理：

卡那霉素适配体的序列为：5’-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3’；

将上述适配体稀释到600nM，在95℃保温10~15min使适配体变性后，立即将其转移到冰浴中5~10min，最后恢复至室温备用；

b、孵育：将上述处理过的适配体溶液与步骤（1）制备得到的等体积的金纳米颗粒模拟酶溶液在室温下孵育20~30min，适配体即通过含氮碱基稳定附着在金纳米颗粒表面；

c、后处理：将步骤b所得混合溶液在4℃，8000rpm条件下离心10min，以除去未结合的适配体，并重悬于等体积的pH4.0，0.2mMHAc-NaAc缓冲液中，得到功能化的金纳米颗粒溶液；

（3）卡那霉素样品与功能化金纳米颗粒的置换反应以及金纳米模拟酶的催化反应：往1mL步骤（2）所得功能化的金纳米颗粒溶液中加入pH3~6，0.2mMHAc-NaAc的缓冲液4mL，然后将不同浓度的卡那霉素待测样品加入到上述体系中；加入0.998M，20μL的底物过氧化氢，购买得到的还原态的硫堇粉末用超纯水配制成的2mM的硫堇溶液50μL，在25~60℃水浴中反应20min；

（4）电化学测定：

d、电极预处理：；用0.5μm及0.05μm的氧化铝粉末在抛光布上先后打磨金电极表面；然后对金电极进行40Hz超声清洗，依次用超纯水、无水乙醇、超纯水分别超声处理3~5min，最后一次用超纯水清洗后，氮气吹干金电极表面；将金电极作为工作电极，珀丝电极作为对电极，Ag/AgCl作为参比电极以构建三电极体系；将电极置于0.5mol/L的H₂SO₄溶液中在-0.2~1.5V电位范围内以100mV/s的扫描速度循环扫描，于0.8V的峰值不再增加即为清洗完成；用超纯水冲洗金电极表面3次，氮气吹干，使金电极表面光滑干净完成电极的预处理；

e、测定：采用差分脉冲伏安法进行电化学检测，将步骤d所述预处理后的金电极置于步骤（3）所述的反应体系中，记录不同卡那霉素浓度下纳米模拟酶催化产生氧化态硫堇的电流值，建立峰电流与卡那霉素浓度间的线性关系，从而实现对卡那霉素的检测；

（5）样品检测：采用差分脉冲伏安法对反应体系中的氧化态硫堇进行电化学检测：该方法具体参数设置为：电压范围0.3V~-0.3V，电压增量4mV，振幅50mV，脉冲宽度0.05s，采样宽度0.0167s，脉冲周期0.05s，静置时间2s；取待检测的样品，以步骤（1）-（4）同样的步骤和试剂对其进行检测，通过电流值得到待测样品中的卡那霉素浓度。

所述样品为牛奶或蜂蜜样品。

本发明的有益效果：①高灵敏度、高特异性，对动物源性食品中卡那霉素残留检测具有重要意义；②通过合理的设计，将纳米生物技术、电化学生物传感检测等多领域的优势联合起来，利用纳米颗粒易于制备、修饰，能起到很好的信号放大作用以及适配体的构象变化等实现信号转换和放大；③检测原理的通用性使该方法还适合基于不同的适配体实现对不同目标物的检测。

附图说明

图1基于核酸适配体及金纳米颗粒模拟酶的卡那霉素检测原理图。

图2差分脉冲伏安法检测标准样品峰电流值与卡那霉素浓度关系标准曲线图。

图3差分脉冲伏安法检测标准样品DPV电流-电势曲线图。

图4蜂蜜样品中卡那霉素检测峰电流值与卡那霉素浓度关系的标准曲线图。

图5差分脉冲伏安法检测蜂蜜样品DPV电流-电势曲线图。

具体实施方式

以下实施例中卡那霉素适配体的序列经查阅文献后得到；还原态的硫堇粉末购自市场。

实施例1.卡那霉素标准溶液峰电流值-浓度标准曲线的绘制

具体步骤如下：

（1）金纳米颗粒模拟酶的制备：利用酪氨酸作为还原剂和捕获剂制备而成金纳米颗粒模拟酶，将含有0.1mM酪氨酸和0.1mMKOH的300mL超纯水溶液煮沸3-5min，立即加入1.02mL质量体积比为1%的氯金酸溶液并在沸水浴中保温5min；继续在沸水浴中持续沸腾至溶液体积减少至30mL，得到金纳米颗粒溶液；将上述金纳米颗粒溶液提前在沸水中处理过的截留分子量为12kDa的透析袋中透析除去多余的KOH，金属离子及酪氨酸，得到金纳米颗粒模拟酶，置于4℃冰箱中保存备用；

（2）功能化金纳米颗粒的制备：

a、适配体的预处理：

卡那霉素适配体的序列为：5’-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3’；

将上述适配体稀释到600nM，在95℃保温10min使适配体变性后，立即其转移到冰浴中5min，最后恢复至室温备用；

b、孵育：将上述处理过的适配体溶液与步骤（1）制备得到的等体积的金纳米颗粒模拟酶溶液在室温下孵育30min，适配体即通过含氮碱基稳定附着在金纳米颗粒表面；

c、后处理：将步骤b所得混合溶液在4℃，8000rpm条件下离心10min，以除去未结合的适配体，并重悬于等体积的pH4.0，0.2mMHAc-NaAc缓冲液中，得到功能化的金纳米颗粒溶液；

（3）卡那霉素样品与功能化金纳米颗粒的置换反应以及金纳米模拟酶的催化反应：往1mL步骤（2）所得功能化的金纳米颗粒溶液中加入pH4.0，0.2mMHAc-NaAc的缓冲液4mL，然后将不同浓度（具体为0.1,1,3,5,10,20,40,60,80,100,200,400,600nM）的卡那霉素待测样品加入到上述体系中；加入0.998M，20μL的底物过氧化氢和购买得到的还原态的硫堇粉末，用超纯水配制成的2mM的硫堇溶液50μL，在40℃水浴中反应20min；

（4）电化学测定：

d、电极预处理：；用0.5μm及0.05μm的氧化铝粉末在抛光布上先后打磨金电极表面；然后对金电极进行40Hz超声清洗，依次用超纯水、无水乙醇、超纯水分别超声处理5min，最后一次用超纯水清洗后，氮气吹干金电极表面；将金电极作为工作电极，珀丝电极作为对电极，Ag/AgCl作为参比电极以构建三电极体系；将电极置于0.5mol/L的H₂SO₄溶液中在-0.2~1.5V电位范围内以100mV/s的扫描速度循环扫描，于0.8V的峰值不再增加即为清洗完成；用超纯水冲洗金电极表面3次，氮气吹干，使金电极表面光滑干净完成电极的预处理；

e、测定：采用差分脉冲伏安法进行电化学检测，将步骤d所述预处理后的金电极置于步骤（3）所述的反应体系中，记录不同卡那霉素浓度下纳米模拟酶催化产生氧化态硫堇的电流值，用差分脉冲伏安法进行检测，具体如图3所示。以峰电流值对卡那霉素浓度作图，得到如图2所示关系曲线。

在卡那霉素浓度为0.1-800nM范围内，峰电流值随卡那霉素浓度增加而增大。其中在0.1-60nM浓度范围内，峰电流值与卡那霉素浓度存在线性关系，线性回归方程为y=1.2757+0.02141x，R²=0.99429，式中y为峰电流值（μA），x为卡那霉素的浓度（nM）。

实施例2.蜂蜜样品中卡那霉素残留的检测

此处采用往蜂蜜中添加标准浓度卡那霉素制备人工污染蜂蜜的方式，获得含0-600nM卡那霉素残留的蜂蜜样品。

按照实施例1中标准品检测的步骤对洋槐蜂蜜中人工污染的卡那霉素进行检测。

得到如图5所示差分脉冲伏安法检测蜂蜜样品DPV电流-电势曲线图，以及图4所示峰电流值与蜂蜜样品中卡那霉素浓度的变化关系曲线。

在卡那霉素浓度为1-60nM范围内，峰电流值与浓度存在线性关系，线性回归方程分别为：y=1.41579+0.0182x，R²=0.9978，式中y为峰电流值（μA），x为蜂蜜样品中含卡那霉素的浓度（nM）。从线性范围和线性方程可知，蜂蜜中基质对卡那霉素的检测影响较小。根据实验室研究进展，该方法对于实际样品中如:经过预处理的牛奶，对卡那霉素残留的检测具有较强的应用价值。