地衣芽孢杆菌及微生物菌剂和它们在发酵床养殖中的应用

摘要

本发明提供了一种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，该地衣芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.11235。本发明还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂含有如上所述的地衣芽孢杆菌作为有效成分。本发明还提供了如上所述的地衣芽孢杆菌和如上所述的微生物菌剂在发酵床养殖中的应用。通过上述技术方案，本发明可以更加有效地去除禽畜养殖的臭味。

说明书

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，具体地，涉及一种地衣芽孢杆菌、一种 微生物菌剂和它们在发酵床养殖中的应用。

背景技术

近年来，我国禽畜养殖业发展迅猛，并逐渐趋于规模化、集约化，但由 于国内畜禽养殖场的排污设施和粪尿处理措施从技术和规模上都远远落后 于发达国家，从养殖场排出的废水、废气、垃圾等对周边地区的空气、土壤 及水体都造成了严重的污染，其中尤以禽畜养殖场恶臭气体对禽畜和周围人 群的感官和健康影响最为显著。畜禽养殖场恶臭气体成分复杂，传统处理恶 臭气体的方法是勤打扫，多通风，用水冲，这种方法浪费了大量的水资源， 同时使养殖场内湿度增大，易导致禽畜患病。

采用发酵床养殖技术是解决禽畜养殖粪便污染的新方法。发酵床养殖技 术的原理是利用微生物菌剂，按一定比例与锯末、秸秆、稻壳等垫料混合， 微生物以禽畜粪便为营养进行繁殖，使禽畜粪便中的有机物得到充分的分解 和转化，从而使臭味消失，而微生物的生长和繁殖同时给禽畜提供了菌体蛋 白等营养物质，从而形成一个无污染、无排放、无臭气的养殖系统。

目前国内发酵床养殖模式已经在猪等养殖生产中推广应用，但是现有发 酵床菌种还存在分解粪便效率低，菌种工作寿命短、易死亡等问题，对于养 殖场恶臭气体中主要的氨气和硫化氢气体的分解去除效果较差，除臭效果不 明显。

发明内容

为了克服现有发酵床菌种所存在的分解粪便效率低等缺陷，本发明提供 了一种分解粪便效率更高的地衣芽孢杆菌。

本发明的发明人分离了一株地衣芽孢杆菌，发现其可以高效地将铵态氮 转化为亚硝态氮从而减少氨氮的产生，同时还具有优异的产酸性能，可以维 持菌种自身生长环境的酸性条件，由此得到了本发明。

本发明提供一种地衣芽孢杆菌，该地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis) 的保藏编号为CGMCCNo.11235。

本发明还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂含有菌体和培养基，所 述菌体含有保藏编号为CGMCCNo.11235的地衣芽孢杆菌。

本发明还提供了如上所述的地衣芽孢杆菌和如上所述的微生物菌剂在 发酵床养殖中的应用。

通过上述技术方案，本发明可以维持菌种生长的低pH环境，延长菌种 的工作寿命，同时更加高效地降解禽畜粪便中的氨氮，从而减轻养殖场臭气。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

生物材料保藏

本发明的地衣芽孢杆菌是本发明的发明人从北京延庆采集的牛粪鸡粪 堆肥产物样品中分离的纯培养物，其保藏编号为CGMCCNo.11235，保藏日 期为2015年8月13日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物中心，地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研 究所，分类命名为地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描 述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明提供了一种地衣芽孢杆菌，该地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的保藏编号为CGMCCNo.11235。

本发明还提供了一种微生物菌剂，该微生物菌剂含有菌体和培养基，所 述菌体含有保藏编号为CGMCCNo.11235的地衣芽孢杆菌。

其中，微生物菌剂中含有的菌体的量可以在很大范围内改变，例如每克 微生物菌剂中，保藏编号为CGMCCNo.11235的地衣芽孢杆菌的活菌数可以 为10⁸-10¹¹cfu，优选情况下，每克微生物菌剂中，保藏编号为CGMCC No.11235的地衣芽孢杆菌的活菌数可以为10⁹-10¹⁰cfu。

根据本发明，所述培养基的种类可以在很大范围内改变，可以为各种能 够用于培养地衣芽孢杆菌的培养基，例如，可以为牛肉膏蛋白胨培养基、营 养肉汤培养基、LB培养基等常用培养基作上述培养基能够商购得到或者根 据“微生物培养基手册”(MicrobiologyCultureMediaManual)的记载制备得 到。例如，培养基可以为牛肉膏蛋白胨培养基，其含有1-5g/L的牛肉膏、 5-20g/L的蛋白胨和3-8g/L的氯化钠。

其中，上述各种培养基可以按照常规的灭菌方法进行灭菌后备用，例如 在115-125℃和1.5-2个标准大气压的条件下灭菌10-30分钟。

其中，所述微生物菌剂的制备方法可以包括：将保藏编号为CGMCC No.11235的地衣芽胞杆菌接种于培养基中进行培养。优选情况下，通过培养 使得到的每克所述微生物菌剂中，保藏编号为CGMCCNo.11235的地衣芽胞 杆菌的活菌数可以为10⁷-10¹¹cfu，更优选为10⁹-10¹⁰cfu。在培养的过程中， 可以通过常规的方法，例如血球板计数法或OD值观察法得到活菌的浓度。

培养后的菌液可以直接作为微生物菌剂使用，优选情况下，菌液通过包 括无菌过滤、冷冻干燥等步骤进一步加工为更方便贮藏的剂型的微生物菌剂 使用。其中，菌种的培养条件没有特别的限制，可以为地衣芽孢杆菌培养过 程中常用条件，例如采用摇床震荡培养，培养温度可以为28-37℃，培养时 间可以为1-3天。

本发明还提供了如上所述的地衣芽孢杆菌和如上所述的微生物菌剂在 发酵床养殖中应用于垫料预发酵。

根据本发明，地衣芽孢杆菌和微生物菌剂在发酵床养殖技术中的应用方 法没有特别的要求，可以为发酵床养殖中菌剂的一般应用方法，例如，将垫 料与菌剂按比例混合均匀，调整水分后将搅拌均匀的垫料堆积发酵。

根据本发明，发酵床含有垫料与微生物菌剂，其中，垫料与微生物菌剂 的重量比可以在很大范围内变化，优选情况下，微生物菌剂与垫料的重量可 以比为1：(900-1200)。

根据本发明，垫料与菌剂的混合方式没有特别的要求，可以将垫料按比 例堆积好，再将菌剂均匀地撒在垫料上，充分混合直至完全混匀。垫料调整 水分的方式也没有特别的要求，例如，可以在垫料与菌剂混匀的过程中加水， 同时充分混合均匀。

根据本发明，垫料的含水率没有特别的要求，可以为常规发酵床养殖技 术中垫料的含水率。优选情况下，垫料的含水量可以为40-50重量％，含水 量在此范围内的垫料的测试方法可以为手抓垫料可成团，松手即散，手上有 水的感觉但指缝无水渗出。

根据本发明，垫料种类没有特别的要求，可以为发酵床养殖技术中常用 的垫料种类，优选情况下，垫料可以为选自锯末、稻壳和麸皮中的一种或几 种。

其中，作为本发明的一种优选实施方式，垫料可以为锯末，稻壳和麸皮 的混合物，相对于100重量份的锯末，稻壳的用量可以为60-70重量份，麸 皮的用量可以为5-10重量份。如上所述微生物菌剂可以先与麸皮混合均匀， 二者混合物再与锯末和稻壳的混合物充分混匀，同时加水调整垫料含水量至 40-50重量％。在该优选方式中，一方面能够让地衣芽孢杆菌在发酵过程中 快速生长，另一方面获得的发酵床垫料用于养殖禽畜可以更有效地去除养殖 臭味。

根据本发明，垫料混合均匀并调节含水量后可以堆积发酵，其中，垫料 堆的大小没有特别的要求，只要满足其内部温度可以使微生物菌剂正常发酵 即可，优选情况下，垫料堆体积可以在10m³以上，垫料堆高1.5m以上。为 了增加垫料堆发酵过程中的保温效果，可以在垫料堆上覆盖草垫或编织袋。

根据本发明，上述发酵床养殖可以包括发酵床养猪、发酵床养鸡、发酵 床养鸭和发酵床养羊中的至少一种。

以下结合实施例进一步详细说明本发明：

实施例1

本实施例用于说明本发明的地衣芽孢杆菌的培养及微生物菌剂的制备。

将保藏编号为CGMCCNo.11235的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)接种到LB培养基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物 和10g/L的NaCl)中，在30℃和200转/分振荡下培养。所得的菌液即为本 实施例的微生物菌剂，每克该微生物菌剂中，活菌数为10⁹cfu。

实施例2

本实施例用于说明本发明的地衣芽孢杆菌的培养及微生物菌剂的制备。

将保藏编号为CGMCCNo.11235的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)接种到牛肉膏蛋白胨培养基(含20g/L的蛋白胨、5g/L的牛 肉膏和5g/L的NaCl)中，在37℃和180转/分振荡下培养得到菌液。所得的 菌液经无菌过滤，冷冻干燥后即得到本实施例的微生物菌剂，每克该微生物 菌剂中，活菌数为10¹⁰cfu。

实施例3

本实施例用于说明本发明的地衣芽孢杆菌的培养及微生物菌剂的制备。

将保藏编号为CGMCCNo.11235的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)接种到营养肉汤培养基(含10g/L的蛋白胨、3g/L的牛肉膏 粉和5g/L的NaCl)中，在35℃和160转/分振荡下培养得到菌液。所得的菌 液经无菌过滤，冷冻干燥后即得到本实施例的微生物菌剂，每克该微生物菌 剂中，活菌数为6×10⁹cfu。

对比例1

将购自ATCC的商品号为14580^TM的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)接种到LB培养基(含10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物 和10g/L的NaCl)中，在35℃和120转/分振荡下培养得到菌液。所得的菌 液经无菌过滤，冷冻干燥后即得到本实施例的微生物菌剂，每克该微生物菌 剂中，活菌数为5×10⁹cfu。

对比例2

本对比例用于说明与本发明不同的微生物菌剂及其制备方法。(1)在 100重量份的营养肉汁培养基(蛋白胨的含量为0.8重量％、NaCl的含量 为0.4重量％、牛肉膏的含量为0.45重量％、余量为无菌水，pH为7.0) 中接种4重量份的地衣芽孢杆菌的菌株(ACCC10146，购自中国农业微生 物菌种保藏中心)，37℃发酵培养，在发酵过程中进行取样并通过显微镜直 接计数法进行观察，直至地衣芽孢杆菌的活菌数为0.8×10¹⁰个/克；(2)在 100重量份的营养肉汁培养基中接种2重量份的枯草芽孢杆菌的菌株 (ACCC10629，购自中国农业微生物菌种保藏中心)，37℃发酵培养，在发酵 过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至枯草芽孢杆菌的活 菌数为0.8×10¹⁰个/克的培养基，其中，所述肉汁培养基中，蛋白胨的含量为 1重量％、NaCl的含量为0.25重量％、牛肉膏的含量为0.45重量％、余 量为无菌水，pH为7.0。(3)在100重量份的营养肉汁培养基中接种3重量 份的短小芽孢杆菌的菌株(ACCC10113，购自中国农业微生物菌种保藏中 心)，37℃发酵培养，在发酵过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行 观察，直至短小芽孢杆菌的活菌数为0.8×10¹⁰个/克，其中，所述肉汁培养 基中，蛋白胨的含量为0.5重量％、NaCl的含量为0.5重量％、牛肉膏的含 量为0.3重量％、余量为无菌水，pH为7.0。(4)在100重量份的YPG培养 基中接种4重量份的凝结芽孢杆菌的菌株(ACCC10229，购自中国农业微 生物菌种保藏中心)，37℃发酵培养，在发酵过程中进行取样并通过显微镜 直接计数法进行观察，直至凝结芽孢杆菌的活菌数为0.8×10¹⁰个/克，其中， 所述YPG培养基中，蛋白胨的含量为0.8重量％、葡萄糖的含量为0.3重量％、 酵母膏的含量为0.8重量％、余量为无菌水，该培养基的pH为7.2。(5)在 100重量份的麦芽汁培养基(上海晶纯试剂有限公司)中接种3重量份的酿酒 酵母菌株(ACCC20237，购自中国农业微生物菌种保藏中心)，30℃发酵培 养，在发酵过程中进行取样并通过显微镜直接计数法进行观察，直至酿酒酵 母的活菌数为0.8×10¹⁰个/克的培养基。(6)在100重量份的高氏合成一号培 养基中接种4重量份的泾阳链霉菌的菌株(ACCC40126，购自中国农业微 生物菌种保藏中心)，30℃发酵，在发酵过程中进行取样并通过显微镜直接 计数法进行观察，直至泾阳链霉菌的活菌数为0.8×10¹⁰个/克，其中，所述高 氏一号培养基中，以该培养基的总重量为基准，可溶性淀粉的含量为2重 量％、KNO₃的含量为0.2重量％、K₂HPO₄的含量为0.7重量％、NaCl的 含量为0.03重量％、余量为无菌水，该培养基的pH为7.2。(7)将步骤(1) 至(6)中得到的地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、凝结芽孢杆 菌、酿酒酵母和泾阳链霉菌按照比例进行混合，使得到的微生物菌剂中，以 得到的微生物菌剂的总活菌数为基准，地衣芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的 15重量％、枯草芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的15％、短小芽孢杆菌的活 菌数为总活菌数的20％、凝结芽孢杆菌的活菌数为总活菌数的20％、酿酒 酵母的活菌数为总活菌数的15％、泾阳链霉菌的活菌数为总活菌数的15％。

实施例4

本实施例用于说明本发明所述的微生物菌剂用于发酵床养殖中垫料预 发酵的方法。本实施例使用与实施例3相同的微生物菌剂。

取100重量份的松木锯末和66重量份的稻壳，洒入20重量份水，混合 均匀并堆好，将6重量份的麸皮和0.17重量份的菌剂混合均匀后，均匀撒在 堆积好的锯末和稻壳上，将所有原料充分混合至完全均匀，同时调整水分至 垫料含水量为45％，混好的垫料按每堆10m³,高1.5m堆积，垫料上覆盖草 垫保温发酵，当垫料温度＞55℃，摊开后即可使用。

实施例5

本实施例用于说明本发明所述的微生物菌剂用于发酵床养殖中垫料预 发酵的方法。本实施例使用与实施例2相同的微生物菌剂。

取100重量份的松木锯末和60重量份的稻壳，洒入20重量份水，混合 均匀并堆好，将10重量份的麸皮和0.14重量份的菌剂混合均匀后，均匀撒 在堆积好的锯末和稻壳上，将所有原料充分混合至完全均匀，同时调整水分 至垫料含水量为40％，混好的垫料按每堆10m³,高1.5m堆积，垫料上覆盖 草垫保温发酵，当垫料温度＞55℃，摊开后即可使用。

实施例6

本实施例用于说明本发明所述的微生物菌剂用于发酵床养殖中垫料预 发酵的方法。本实施例使用与实施例1相同的微生物菌剂。

取100重量份的松木锯末和70重量份的稻壳，洒入20重量份水，混合 均匀并堆好，将0.21重量份的菌剂混合均匀后，均匀撒在堆积好的锯末和稻 壳上，将所有原料充分混合至完全均匀，同时调整水分至垫料含水量为50％， 混好的垫料按每堆10m³,高1.5m堆积，垫料上覆盖草垫保温发酵，当垫料 温度＞55℃，摊开后即可使用。

对比例3

采用实施例4中的垫料预发酵方法，所不同的是，使用与对比例1相同 的微生物菌剂。

对比例4

本对比例用于说明与本发明不同的垫料发酵方法，使用与对比例2相同 的微生物菌剂。

(1)按照下述重量比例制备垫料：稻秆的用量为20重量％，稻壳的用 量为30重量％，木屑的用量为40重量％，米糠的用量为10重量％。(2)使 用对比例2制得的微生物菌剂对所述垫料进行接种，相对于100重量份的 基料，微生物菌剂的接种量为3重量份。(3)对接种后的垫料进行发酵，发 酵温度为50℃，发酵时间为2天。(4)将发酵后的垫料在猪舍内进行堆料， 堆料的高度为55公分，堆料中温度维持在35-60℃，该垫料的使用时间为 150天，猪舍的温度维持在15-35℃。

测试实施例1

本测试实施例测定实施例1-3和对比例1-2的微生物菌剂的降解氨氮的 能力。

分别配制无菌牛肉膏蛋白胨培养基，250mL的锥形瓶中装入100mL 培养基，分别加入实施例1-3和对比例1的微生物菌剂0.05g，置于37℃培 养24h。

配制氨氧化菌培养基((NH₄)₂SO₄2g/L，NaCl0.3g/L，FeSO₄·7H₂O0.03 g/L，MgSO₄·7H₂O0.03g/L，K₂HPO₄1g/L，NaHCO₃1.6g/L，琼脂粉18g/L， 使用1N氢氧化钠溶液调整pH至7.2)，每瓶100mL，接入1mL上述各 菌液。培养4天后，检测培养基中氨氮的浓度，结果列于表1。

表1

根据表1的数据可见，本发明的保藏编号为CGMCCNo.11235的地衣 芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)及其菌剂相对于其他微生物及菌剂具有突 出的降解氨氮的能力。

测试实施例2

本测试实施例测定实施例1-3和对比例1-2的微生物菌剂的产酸能力。

分别配制无菌牛肉膏蛋白胨培养基，250mL的锥形瓶中装入100mL 培养基，分别加入实施例1-3和对比例1的微生物菌剂0.05g，置于37℃培 养24h。

配制产酸菌培养基(葡萄糖6g/L，酵母膏1g/L，蛋白胨1g/L,MgSO₄ 0.05g/L，CaCO₃1g/L,溴甲酚紫0.04g/L)，将产酸菌培养基8mL置于玻璃 试管(18mm*180mm)中，灭菌好备用。接入1mL上述各菌液，置于37℃、 170r/min震荡培养。培养24h后观察是否使溴甲酚紫变色，并测量每个样 品试管中的pH值，结果列于表2。

表2

菌剂 是否变色 pH 实施例1 是 5.12 实施例2 是 5.01 实施例3 是 4.93 对比例1 否 7.09 对比例2 否 6.83

根据表2的数据可见，本发明的保藏编号为CGMCCNo.11235的地衣 芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)及其菌剂相对于其他微生物及菌剂具有较 强的产酸能力，可以维持微生物生长所需的酸性环境。

测试实施例3

本测试实施例测定实施例4-6和对比例3-4垫料预发酵方法中发酵床的 性能。测试垫料的pH值、温度和细菌总数，结果分别列于表3，表4和表5 中。pH值的测试方法为：取相当于2g鲜样的风干样品，加50mL蒸馏水， 在摇床振荡混匀20min，静置2h，测定上清液的pH值；温度的测定方法为 在料堆距离地面1米高处，从斜坡表面向料堆中心垂直插入温度计，在深度 为30cm、60cm和90cm处用长柄金属温度计测定温度，取平均值；细菌总 数的测定方法为稀释涂布平板法。

表3

根据表3的数据可见，本发明的菌剂可以缓冲调节发酵垫料的pH值， 使其维持在相对中性的条件，这有利于益生菌的繁殖生长，在畜禽舍内使用 时有利于畜禽粪便的快速消解。

表4

根据表4的数据可以看出，本发明的菌剂添加到发酵床垫料中，发酵升 温速度快，发酵第三天即可进入高温期，这说明该菌剂发酵速度快，效率高。 从实施例4-5与实施例6的数据对比可以看出，优选的发酵床垫料为锯末、 稻壳和麸皮共同使用制备发酵床的情况下，菌剂的发酵速度更快。

表5

根据表5的数据可见，与对比例3-4相比，实施例4-6所使用的微生物 菌剂中可培养细菌总数较高，而且其中菌剂中含有的保藏编号为CGMCC No.11235的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)的数量占优势，而且菌剂 中的地衣芽孢杆菌的增长速度很快，垫料中的杂菌逐渐变少。这是由于在＞ 55℃时大部分的霉菌类被杀灭，另外有不少细菌杂菌也不耐高温，但菌剂中 的地衣芽孢杆菌在高温条件下可休眠，当高温期过后，便成为垫料中的主要 菌种。从实施例4-5与实施例6的数据对比可以看出，优选的发酵床垫料为 锯末、稻壳和麸皮共同使用制备发酵床的情况下，垫料中的菌剂菌数量更多， 增长速度也更快。

测试实施例4

本测试实施例测定实施例4-6和对比例3-4的垫料预发酵方法用于发酵 床养殖技术的效果。

选择相同日龄，体重相近(约10kg)的杜×长×大三元杂交猪仔100头， 根据体重及性别比例相近的原则平均分为5组，分别采用与实施例4-6和对 比例3-4相同的微生物菌剂和垫料预发酵方法制备发酵床。

上述5组猪仔饲喂70天，测试并统计猪舍环境状况和猪的生长性能， 结果如表6所示。

表6

组别 圈舍状况 猪生长情况 实施例4 无明显臭味 毛色光亮，猪体洁净 实施例5 无明显臭味 毛色光亮，猪体洁净 实施例6 无明显臭味 毛色光亮，猪体洁净 对比例3 恶臭 毛色暗淡，猪体较脏 对比例4 有臭味 毛色暗淡，猪体较脏

根据表6的数据可以看出，实施例4-6的圈舍环境明显比对比例3-4好， 说明应用本发明的微生物菌剂可以高效地消除养殖恶臭，改善养殖圈舍的环 境，降低臭味向环境排放。

表7

组别 初重量/kg 末重量/kg 日增重/kg 料肉比 实施例4 10.56±1.45 52.47±5.09 0.60±0.03 2.34 实施例5 10.37±1.53 51.67±4.15 0.59±0.04 2.38 实施例6 10.41±1.48 51.01±4.15 0.58±0.04 2.41 对比例3 10.44±1.22 44.57±4.23 0.49±0.04 2.88 对比例4 10.48±1.22 47.70±4.23 0.53±0.04 2.64

根据表7的数据可以看出，实施例4-6中养殖猪的日增重和料肉比等各 方面生长性能明显优于对比例3-4中的养殖猪，这是由于本发明的微生物菌 剂应用于发酵床养殖后，消除了养殖圈舍臭气，使养殖猪的生长环境大为改 善，促进了养殖猪的生长，提高了养殖的效益。从实施例4-5与实施例6的 数据对比可以看出，优选的发酵床垫料为锯末、稻壳和麸皮共同使用制备发 酵床的情况下，养殖猪的生长性能更为优异。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实 施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方 案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特 征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必 要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其 不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。