一种改性柚皮固定化糖化酶的方法

摘要

本发明公开了一种改性柚皮固定化糖化酶的方法。该方法包括：(1)将切成丁状的柚皮进行酸处理和碱处理，以除去柚皮中的果胶、木质素和半纤维素等组分，得到预处理柚皮；(2)预处理后的柚皮用琥珀酸酐进行改性，在柚皮纤维上引入羧基，得到改性柚皮载体；(3)以改性柚皮为固定化载体，在酸性条件下对糖化酶进行吸附交联固定化，将游离的糖化酶固定在改性柚皮上；(4)通过调节游离酶浓度、固定化温度、吸附时间、戊二醛浓度等一系列因素优化改性柚皮固定化糖化酶实验工艺。本发明的优点为将柚皮变废为宝，达到了糖化酶重复使用的效果，工艺简单，产物易于分离，可操作性高，对环境的污染小，具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及固定化酶技术领域，尤其涉及一种固定化糖化酶的方法。

背景技术

糖化酶又称葡萄糖淀粉酶，学名α-1，4葡萄糖水解酶，主要分布在霉菌中，是一种外切酶，除了能 从淀粉链的非还原性端水解α-1，4葡萄糖苷键，也能缓慢水解α-1，6葡萄糖苷键，在制糖、酿酒、发 酵方面广泛应用，是一种十分重要的酶制剂，工业生产上都以微生物发酵法大规模生产糖化酶。

酶固定化技术是采用吸附、交联、包埋或共价结合的方式将游离酶固定在载体上，从而提高酶的稳 定性和重复使用性，便于生产的连续化、自动化，降低酶的使用成本。目前糖化酶的固定化应用较多的 方法有海藻酸铝吸附固定、具磁响应的聚乙二醇吸附-交联固定、聚乙烯醇复合凝胶固定、磁性壳聚糖固 定、糊精包埋固定等多种方法。然而这些固定化方法步骤大多较为复杂，固定化载体需经复杂的处理后 才能获取，且固定化过程中使用的试剂对人体存在一定的伤害，从而限制了其应用。

柚皮一方面具有丰富的多孔结构，利于形成空间，另一方面富含纤维素，含有大量的羟基、多酚基 团，通过不同的机制如静电吸附、络合、氢键等方式，具有交强的吸附性能，此外，基于柚子皮的可食 用性，利用柚皮改性后吸附固定化糖化酶具有较强的可行性和应用性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种简单、行之有效的固定化糖化酶的方法，通过分析固定化底物浓度、溶 液pH、吸附时间、吸附温度、戊二醛浓度、对固定化糖化酶活力及酶活回收率的影响，确定最佳固定化 条件，并对固定化糖化酶的重复使用次数进行研究，为固定化糖化酶及糖化酶的应用奠定理论基础。另 一方面利用柚皮的多纤维疏松结构对其进行改性，使得利用柚皮这种天然原料固定化糖化酶成为可能。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一种改性柚皮固定化糖化酶的方法，包括以下步骤：

步骤一、游离酶制备：

将粉末状糖化酶用乙酸-乙酸钠缓冲液溶解混匀后，纱布过滤，取滤液即为游离糖化酶溶液；

步骤二、固定化载体制备：

1)、取干燥的柚皮内层白色部分，切成丁状；2)、将柚皮按1:10(w/v)加入到pH4的蒸馏水中， 持续搅拌3.5h，结束后抽滤，滤渣用蒸馏水洗至中性；将滤渣按固液比1:10加入到质量分数为3％的氢 氧化钠溶液中，持续搅拌3.5h，结束后抽滤，滤渣用蒸馏水洗至中性，再用无水乙醇洗涤数次，60℃干 燥；3)、将干燥的柚皮加入琥珀酸酐，吡啶回流24h，结束后用2M的盐酸溶液洗脱，再用蒸馏水洗涤 数次，干燥得到改性柚皮载体，作为后续的固定化载体；

步骤三、固定化酶的制备：

将游离糖化酶与步骤二中制得的改性柚皮载体混匀直接固定化，再用戊二醛交联固定化糖化酶，待固 定化完全后，采用纱布过滤，改性柚皮载体用缓冲液或蒸馏水洗涤数次直至表面无残留游离糖化酶为止， 即得改性柚皮固定化糖化酶。

作为实施例的优选方式，所述步骤一中乙酸-乙酸钠缓冲液的pH为5.0，浓度为0.2mol/L，体积为 10mL；溶解的糖化酶采用4层纱布过滤。

作为实施例的优选方式，所述步骤二中柚皮大小为2mm×2mm×2mm的立方体。

作为实施例的优选方式，所述步骤三中将浓度为20U/mL的游离糖化酶与改性柚皮载体按20:1的比 例混匀，于25℃直接吸附游离的糖化酶，吸附时间为1.5h，再用10mL浓度为1％的戊二醛溶液交联固 定化糖化酶20min；待固定化完全后，纱布过滤，改性柚皮载体用pH4.6浓度为0.2mol/L的乙酸-乙酸 钠缓冲液或蒸馏水洗涤数次直至表面无残留游离糖化酶为止，即得改性柚皮固定化糖化酶。

作为实施例的优选方式，所述步骤三中固定化糖化酶重复使用4次后残余酶活力为38％。

本发明的有益效果为将柚皮变废为宝，达到了糖化酶重复使用的效果，工艺简单，产物易于分离， 可操作性高，对环境的污染小，具有良好的应用前景。

附图说明

图1游离酶浓度对改性柚皮载体固定糖化酶活力的影响；

图2不同pH对改性柚皮载体固定糖化酶活力的影响；

图3不同吸附温度对改性柚皮载体固定糖化酶活力的影响；

图4不同吸附时间对改性柚皮载体固定糖化酶活力的影响；

图5不同戊二醛浓度对改性柚皮载体固定糖化酶活力的影响；

图6改性柚皮载体固定糖化酶的重复利用性。

具体实施方式

下面结合附图与具体实施例进一步说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围并不局限于此。

实施例中采用的检测方法：

游离糖化酶活力测定：取400μL浓度为2％的可溶性淀粉溶液，加入100μL游离糖化酶溶液，于 40℃条件下反应20min，反应结束后加入0.5mL的DNS溶液，立即沸水浴显色5min，冷却后加蒸馏水 10mL，测540nm处的吸光度，根据以葡萄糖绘制的标准曲线计算反应液中还原糖的生成量。上述条件 下，每小时水解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖作为一个酶活力单位(U)。

固定化糖化酶活力测定：取改性柚皮固定化糖化酶0.5g，于10mL浓度为2％的可溶性淀粉溶液中， 在40℃pH4.6条件下反应20min，采用游离酶的测定方法测定固定化酶反应过程中还原糖的生成量。

酶活回收率(％)＝固定化酶总活力/加入游离酶总活力×100％。

实施例1：改性柚皮载体的制备

取干燥的柚皮内层白色部分，切成丁状，按1:10(w/v)加入到pH4的蒸馏水中，持续搅拌3.5h， 结束后抽滤，滤渣用蒸馏水洗至中性，按固液比1:10加入到3％的氢氧化钠溶液中，持续搅拌3.5h，结 束后抽滤，再用蒸馏水洗至中性，无水乙醇洗涤数次，60℃干燥；将干燥的柚皮加入琥珀酸酐，吡啶回 流24h，结束后用2M的盐酸溶液洗脱，再用蒸馏水洗涤数次，干燥得到改性柚皮载体，作为后续的固 定化载体。

实施例2：游离酶浓度对改性柚皮载体固定糖化酶活力的影响

将粉状的糖化酶用pH为4.6的乙酸-乙酸钠缓冲液溶解后，采用纱布过滤制成游离糖化酶溶液，取 0.5g改性柚皮载体，加入到10mL浓度分别为10～30U/mL的游离酶溶液中，于室温条件下吸附2h， 固定化结束后用0.02M的乙酸-乙酸钠缓冲液冲洗数次，洗尽表面残留的游离酶。加入10mL2％的可溶 性淀粉，40℃水解反应20min，测定固定化酶总活力及酶活回收率。根据图1结果所示，确定较优固定 化酶浓度为20U/mL。

实施例3：不同pH对改性柚皮载体固定糖化酶活力的影响

将粉状的糖化酶用pH为3.5～5.5的乙酸-乙酸钠缓冲液溶解后，纱布过滤制成游离糖化酶溶液，取 0.5g改性柚皮载体，加入到10mL浓度为20U/mL的游离酶溶液中，于室温条件下吸附2h，固定化结 束后采用0.02M的乙酸-乙酸钠缓冲液冲洗数次，洗尽表面残留的游离酶。加入10mL2％的可溶性淀粉， 40℃水解反应20min，测定固定化酶总活力及酶活回收率。根据图2结果所示，确定较优底物溶液pH 为5.0.

实施例4：不同吸附温度对改性柚皮载体固定糖化酶活力的影响

将粉状的糖化酶用pH为5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液溶解后，纱布过滤制成游离糖化酶溶液，取0.5g 改性柚皮载体，加入到10mL浓度为20U/mL的游离酶溶液中，分别在4℃、25℃、40℃、60℃条件下 吸附2h，固定化结束后采用0.02M的乙酸-乙酸钠缓冲液冲洗数次，洗尽表面残留的游离酶。加入10mL 2％的可溶性淀粉，40℃水解反应20min，测定固定化酶总活力及酶活回收率。根据图3结果所示，确定 较优吸附固定化温度为25℃。

实施例5：不同吸附时间对改性柚皮载体固定糖化酶活力的影响

将粉状的糖化酶用pH为5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液溶解后，纱布过滤制成游离糖化酶溶液，取0.5g 改性柚皮载体，加入到10mL浓度为20U/mL的游离酶溶液中，于25℃条件下分别吸附0.5～3.0h，固 定化结束后采用0.02M的乙酸-乙酸钠缓冲液冲洗数次，洗尽表面残留的游离酶。加入10mL2％的可溶 性淀粉，40℃水解反应20min，测定固定化酶总活力及酶活回收率。根据图4结果所示，在吸附1.5h 后固定化酶活力已基本达到稳定。

实施例6：不同戊二醛浓度对改性柚皮载体固定糖化酶活力的影响

将粉状的糖化酶用pH为5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液溶解后，纱布过滤制成游离糖化酶溶液，取0.5g 改性柚皮载体，加入到10mL浓度为20U/mL的游离酶溶液中，于25℃条件下吸附1.5h，过滤掉剩余 游离酶后，加入10mL浓度为0.5％～2.5％的戊二醛溶液，交联20min，交联结束后采用0.02M的乙酸- 乙酸钠缓冲液冲洗数次，洗尽表面残留的戊二醛溶液。加入10mL2％的可溶性淀粉，40℃水解反应20 min，测定固定化酶总活力及酶活回收率。根据图5结果所示，戊二醛浓度为1％时固定化酶活力相对较 高。

实施例7：改性柚皮载体固定糖化酶的重复利用性

将粉状的糖化酶用pH为5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液溶解后，纱布过滤制成游离糖化酶溶液，取0.5g 改性柚皮载体，加入到10mL浓度为20U/mL的游离酶溶液中，于25℃条件下吸附1.5h，过滤掉剩余 游离酶后，加入10mL浓度为0.5％～2.5％的戊二醛溶液，交联20min，交联结束后采用0.02M的乙酸- 乙酸钠缓冲液冲洗数次，洗尽表面残留的戊二醛溶液。加入10mL2％的可溶性淀粉，40℃水解反应20 min，同样步骤测酶活力，以测定其酶活回收率。根据图6结果所示，重复使用4次后，酶活回收率为 38％。

本领域的普通技术人员从本发明公开内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护 范围。