基于S－腺苷蛋氨酸类似物的免疫检测方法及应用于指导个体化用药

摘要

本发明提供了检测患者中的疾病的存在或不存在的方法，其中所述疾病是伴随着S-腺苷蛋氨酸(或S-腺苷甲硫氨酸)水平降低的情况：寻找被怀疑具有所述疾病或处于具有患所述疾病的风险的病人；从所述患者中获得生物样品；使用从S-腺苷蛋氨酸的半抗原类似物制备的抗体测定所述生物样品中S-腺苷蛋氨酸的水平；将该样品中S-腺苷蛋氨酸的水平与是否存在或不存在所怀疑的疾病或其严重程度相关联。本发明还提供了用于确定S-腺苷同型半胱氨酸(或称S-腺苷高半胱氨酸)的方法，以便计算出甲基化指数(SAM/SAH的比率)，该指数是表示一个人是否健康的指标。此外，本发明还包括用于确定S-腺苷蛋氨酸和S-腺苷同型半胱氨酸的试纸条的方法。

说明书

本发明专利申请延续临时美国专利US61/801，547题目为“S-腺苷蛋氨酸 的免疫检测用于个体化用药或者用于健康与癌症评估”，提交日期为2013年3 月15日.本专利申请将包括上述临时专利的全部内容。

发明领域

本发明涉及测定S-腺苷蛋氨酸在生物样品中的含量，S-腺苷蛋氨酸可作为许 多疾病的标志物。

本发明涉及使用由本发明中的抗原类似物制备的抗体的方法，测定S‐腺苷蛋 氨酸在生物样品中的含量，S‐腺苷蛋氨酸可作为许多疾病的标志物。

本发明涉及测定S-腺苷蛋氨酸在生物样品中的含量，S-腺苷蛋氨酸可作为许 多疾病的标志物，S-腺苷蛋氨酸的含量与疾病进展有关系，根据S-腺苷蛋氨酸的 水平制定合适的治疗方案。

本发明涉及诊断、筛查、早期检测癌症的方法，且可以用来监测肿瘤和其它 疾病的治疗效果和复发监测。

本发明还涉及一种开发靶向特异检测系统，该系统用来决定病人是否会对靶 向特异性药物有反应，具体的涉及一种经济的、在同时开发诊断试剂和治疗药物 时提供协同作用的系统。

本发明涉及发现、筛选、寻找、检出、开发和评估测定甲基化指数的方法， 甲基化指数可用于疾病进展、治疗和对治疗反应的监测指标。

本发明涉及使用甲基化指数(有些文献说成甲基化状态，即S-腺苷蛋氨酸/S- 腺苷同型半胱氨酸)作为标志物、方法、机制、试剂、系统与试剂盒用于检测 和诊断癌症和其它疾病，也用于监测癌症进展，检测各种癌症和其它疾病的治疗 效果。癌症进一步恶化发展一般认为与进行性整体DNA低甲基化，区域性CpG 过度甲基化和遗传物质不稳定性增强有关系。甲基化指数降低与整体DNA低甲 基化和遗传物质不稳定性增强有相关关系。因此，甲基化指数是辅助健康状况与 疾病进展和的较好的标志物。

发明的背景

S-腺苷甲硫氨酸或S-腺苷蛋氨酸(SAMe)几乎存在于体内所有的组织及体 液中。SAM对于转甲基作用这一过程至关重要，而甲基化几乎参与到生命的每 一方面。SAM是体内DNA、RNA、蛋白质、脂类及小分子甲基转移反应中的甲 基供体。正常的胚胎发育需要适当的DNA甲基化，有研究证明甲基转移酶缺失 可能导致死亡(Pegg,A.E.,Feith,D.J.,Fong,L.Y.,Coleman,C.S.,O’Brian,T.G.,and Shantz,L.M.,2003,Biochem.Soc.Trans.31,356-360)。许多肿瘤细胞中DNA的甲 基化呈现异常，DNA甲基化模式的改变甚至可诱发致肿瘤因子基因的表达或沉 默肿瘤抑制因子的基因，有研究表明，给与啮齿类动物缺乏甲基的食物将引发肝 癌。

SAMe具有转硫基作用。SAMe脱甲基后生成S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)， 随后SAH水解生成同型半胱氨酸，经转硫基作用后生成胱硫醚，随后进一步转 换为半胱氨酸并最终成为谷胱甘肽。谷胱甘肽是肝细胞的抗氧化剂，可作为解毒 剂。

SAMe的另一个重要功能是转氨丙基作用。SAM脱羧后将氨丙基转移给与 腐胺，生成亚精胺和精胺，这两种物质对细胞生长、分化以及DNA和RNA的 稳定至关重要。此外，该反应过程的副产物甲硫腺苷(MTA)是一种强效止痛 消炎药，这可能是SAMe对骨关节炎、类风湿性关节炎和纤维肌痛的临床治疗 有功效的原因。

SAMe是免疫体系中一种重要的物质，可维护细胞膜的正常功能，且有助 于大脑中血清素、褪黑激素及多巴胺的等化学物质的产生与分解。缺乏维生素 B12或叶酸铁可造成SAMe水平降低。SAMe还是一种抗氧化剂，可以保护机体 免受活性氧分子的损害，活性氧分子可能来自于机体自身或环境污染，被认为是 造成衰老及变性疾病的重要因素。一般认为SAMe可提高机体内其它氨基酸的 功能水平。

进一步的研究表明，SAMe经裂解酶裂解后转化为甲硫分子和高丝氨酸，它 是tRNA的氨基丁酸链供体，也是生物素生物合成的氨基酸链供体。脱羧后的 SAMe则是生物合成神经调节物质多胺，亚精胺和精胺的氨丙基供体(Zappiaetal (1979),BiomedicalandPharmacologcialrolesofAdenosylmethionineandthe CentralNervousSystem,page1,PergamonPress.N.Y.)。

SAMe在临床上可作为肝脏疾病(FriedelH,Goa,K.L.,andBenfieldP.,(1989), S-Adenosyl-l-methionine:areviewofitspharmacologicalpropertiesandtherapeutic potentialinliverdysfunctionandaffectivedisordersinrelationtoitsphysiological roleincellmetabolism.Drugs.38,389-416)、关节炎(DiPadovaC,(1987), Sadenosyl-l-methionineinthetreatmentofosteoarthritis:reviewoftheclinical studies.AmJ.Med.83,(Suppl.5),6-65)以及抑郁症(Kagan,B,SultzerD.L., RosenlichtNandGernerR.(1990),OralS-adenosylmethionineindepression:a randomized,doubleblind,placebo-controlledtrial.Am.J.Psychiatry147,591-595.) 的治疗药物。阿兹海默症患者脑脊髓液中的SAMe水平降低(Bottiglierietal, (1990),CerebrospinalfluidSadenosyl-l-methionineindepressionanddementia: effectsoftreatmentwithparenteralandoralS-adenosyl-l-methionine.J.Neurol. Neurosurg.Psychiatry53,1096-1098.)。初步的研究结果表明，给予SAMe可改善 阿兹海默症患者的认知能力(Bottiglierietal(1994),Theclinicalpotentialof admetionine(S-adenosyl-l-methioinine)inneurologicaldisorders.Drugs48, 137-152.)。阿兹海默症患者脑脊髓液中的SAMe水平急剧下降(Morrisonetal, (1996),BrainS-adenosylmethioninelevelsareseverelydecreasedinAlzheimer's disease,JournalofNeurochemistry,67,1328-1331.)，帕金森氏症患者血液中的 SAMe水平也显著下降(Chengetal,(1997),LevelsofL-methionine S-adenosyltransferaseactivityinerythrocytesandconcentrationsof S-adenosylmethionineandS-adenosylhomocysteineinwholebloodofpatientswith Parkinson'sdisease.ExperimentalNeurology145,580-585.)。

使用抗肿瘤药甲氨蝶呤的患者体内SAMe水平降低，该药物与SAMe一起使 用可减少其神经毒性(Bottiglierietal(1994),TheClinicalPotentialofAdemetionine (S-adenosylmethionine)inneurologicaldisorders,Drugs,48(2),137-152.)。

有研究报道艾滋病伴有痴呆症或痴呆/HIV病毒感染复合性脑病患者的脑脊 液中SAM-e水平，发现其SAM-e水平比无HIV感染的痴呆病人明显降低 (Keatingetal(1991),Evidenceofbrainmethyltransferaseinhibitionandearlybrain involvementinHIVpositivepatientsLancet:337:935-9.)。

DeLaCruz等人的研究表明，SAMe是一种有效的抗氧化剂，长期施用SAMe 可通过增强抗氧化防御功能改变大脑、肝脏及肾脏组织中的氧化状态(DeLa Cruzetal，EffectsofchronicadministrationofS-adenosyl-l-methionineonbrain oxidativestressinrats.Naunyn-Schmiedeberg'sArchivesPharmacol，2000，361： 47-52.)。

无肝脏疾病及有肝脏疾病的患者口服SAMe后，其肝脏中谷胱甘肽水平均有 上升(VendemialeGetal,(1989),EffectoforalS-adenosyl-l-methionineonhepatic glutathioneinpatientswithliverdisease.ScandJGastroenterol；24:407-15.)。在口服 SAMe后，肝内胆汁淤积患者的瘙痒症状及胆汁淤积有所改善(Giudicietal,The useofadmethionine(SAM-e)inthetreatmentofcholestaticliverdisorders. Metaanalysisofclinicaltrials.In:Matoetaleditors.MethionineMetabolism: MolecularMechanismandClinicalImplications.Madrid:CSICPress；1992pp 67-79.)。而原发性纤维肌痛患者在短期服用SAMe后其症状也有所改善(Tavoniet al,EvaluationofS-adenosylmethioineinPrimaryFibromaylgia.TheAmerican JournalofMedicine,Vol83(suppl5A),pp107-110,1987.)。此外SAMe还可用于 骨关节炎的治疗(KoenigB.Along-term(twoyears)clinicaltrialwith Sadenosylmethionineforthetreatmentofosteoarthritis.TheAmericanJournalof Medicine,Vol83(suppl5A),Nov.20,1987pp89-94)。

SAMe在细胞的基础代谢过程中发挥重要作用，因此在许多似乎不相关的领 域仍具有重要的临床意义，其中它在酒精性肝硬化的临床治疗方面的应用最引人 瞩目，因为酒精性肝硬化在医学上目前还无法治愈。Mato等人的研究表明口服 SAMe可将酒精性肝硬化的总死亡率和/或发展为肝移植的概率降低达29％，而 安慰剂治疗组仅12％(Matoetal(1999),S-adenosylmethionineinalcoholliver cirrhosis:arandomized,placebo-controlled,doubleblind,multi-centerclinicaltrial, JournalofHepatology,30,1081-1089.)。

SAMe不仅可以减弱肿瘤坏死因子-α所造成的损害，同时还可减少其分泌量， 因此在这种炎症因子增加时施用SAMe可获得很好的效果(WatsonWH,ZhaoY, ChawlaRK,(1999)BiochemJAug.15；342(Pt1):21-5.S15adenosylmethionine attenuatesthelipopolysaccharide-inducedexpressionofthegenefortumournecrosis factoralpha.)。还有研究表明，SAMe具有减弱强效免疫抑制剂环孢素A的毒性 的功能(GalanA,etal,CyclosporineAtoxicityandeffectofthe s-adenosylmethionine,ArsPharmaceutica,40:3；151-163,1999.)。

在体外培养人红细胞的过程中添加SAMe时，SAMe可穿透细胞膜并使细胞 内ATP增加从而使细胞形态得以恢复(Friedeletal,S-adenosyl-lmethionine:A reviewofitspharmacologicalpropertiesandtherapeuticpotentialinliverdysfunction andaffectivedisordersinrelationtoitsphysiologicalroleincellmetabolism,Drugs 38(3):389-416,1989)。

有研究表明SAMe有利于偏头痛的治疗(Friedeletal, S-adenosyl-lmethionine:Areviewofitspharmacologicalpropertiesandtherapeutic potentialinliverdysfunctionandaffectivedisordersinrelationtoitsphysiological roleincellmetabolism,Drugs38(3):389-416,1989)。

SAMe也用于治疗外周动脉闭塞性疾病患病人，发现它可以降低的血液粘稠 度，可能是通过影响红细胞的变形能力实现的。

用发酵法可获得纯度为60％～80％的SAMe，也就是说最终产物包含 60％～80％具有生物活性的(S,S)-SAMe，其余20～40％为不具生物活性 (R,S)-SAMe(Gross,A.,Geresh,S.,andWhitesides,Gm(1983)Appl.Biochem. Biotech.8,415.)。酶促合成方法得到的不具生物活性的同分异构物的比例超过 60％(Matos,JR,RauschelFM,Wong,CH.S-Adenosylmethionine:Studieson ChemicalandEnzymaticSynthesis.BiotechnologyandAppliedBiochemistry9, 39-52(1987)。利用对映体分离技术可以分离、纯化具有活性的SAMe。最新的 分离技术可以大规模地分离手性分子，且花费较小。此外，用特定的立体结构选 择法有望合成具有生物活性的对映体，但该技术目前尚未成熟(Matos,JR, RauschelFM,Wong,CH.S-Adenosylmethionine:StudiesonChemicaland EnzymaticSynthesis.BiotechnologyandAppliedBiochemistry9,39-52(1987； Hoffman,ChromatographicAnalysisoftheChiralandCovalentInstabilityof S-adenosyl-l-methionine,Biochemistry1986,254444-4449:SegalDandEichlerD, TheSpecificityofInteractionbetweenS-adenosyl-l-methionineandanucleolar 2-0-methyltransferase,ArchivesofBiochemistryandBiophysics,Vol.275,No.2, December,pp.334-343,1989)。

DelaHaba最先证明硫是手性分子，仅其中一个可合成并应用在生物领域 ((DelaHabaetalJ.Am.Chem.Soc.81,3975-3980,1959))。DNA和RNA的 甲基化对于细胞的正常生长至关重要，SAMe是该甲基化反应中唯一的甲基供 体，该过程由甲基转移酶催化。Segal和Eichler等的研究表明(S,S)-SAM-e与 酶的结合紧密度比无生物活性的(R,S)-SAM-e强10倍，从而证明了一种与硫手 性中心空间特异的结合的新方式。有报道表明，(R,S)-SAM-e与其它的甲基转移 酶结合的程度与(S,S)-SAM-e一致，因此(R,S)-SAM-e可充当该酶的竞争抑制剂 (SegalDandEichlerD,TheSpecificityofInteractionbetween S-adenosyl-l-methionineandanucleolar2-0-methyltransferase,Archivesof BiochemistryandBiophysics,Vol.275,No.2,Decemberpp.334-343,1989； BorchardtRTandWuYS,PotentialinhibitorsofS-adenosylmethionine-dependent methyltransferases.RoleoftheAsymmetricSulfoniumPoleintheEnzymaticbinding ofS-adenosyl-l-methionine,JournalofMedicinalChemistry,1976,Vol19,No.9, 1099-1103.)。

无论是在其光学纯的SAMe对映体形式或是与其它外消旋混合物，SAMe在 室温下的稳定性不佳，可能降解而产生不可取的产物。SAMe与其对映体呈现分 子内不稳定从而导致在高温及室温条件下分子失去稳定性或断裂。因此获得新的 SAMe的稳定盐成为许多专利的主题，为工业化生产SAMe提供基础。本发明得 以使用现有技术中已公开的稳定SAMe对映体的SAMe盐进行抗体鉴定和其它 方面的工作。

近年来，临床诊断等领域都有广泛的发展，既在于越来越多的可被简便而 准确测定的体液中的代谢物或外源性药物等分子，也在于检测方法方面的进展。 在过去的几十年中，许多物质如禁忌药物和其它生物分子的检测已是司空见惯。 基于抗原与抗体反应的免疫检测也被广泛地应用在这一方面。基于抗体的特异性 及高亲和力，免疫检测可以精确地定量检测生物液体中的极低浓度的物质。

因此，需要一种改进的检测方法，以定量甲基化指数，并把甲基化指数作为 生物指标，以检测、诊断癌症及其它疾病，并有助于监测病情发展、治疗效果和 预后。

图标说明

【图1】为ELISA测定两个抗SAM单克隆抗体效价的曲线。其中X-轴显示 OD450值，Y-轴显示纯化的腹水抗体在1μg/μl时的稀释倍数。

【图2】为不同的SAM类似物和SAM与抗SAM单克隆抗体的竞争交叉曲线。 ELISA方法测得SAM类似物(SAH、蛋氨酸、腺苷)与84号克隆的交叉反应不超 过1.25％。其中X-轴表示SAM和SAM类似物不同浓度值，以nM为单位，Y- 轴是竞争抑制比率。

【图3】为不同的SAM类似物和SAM与抗SAM单克隆抗体的竞争交叉曲线。 ELISA方法测得SAM类似物(SAH、蛋氨酸、腺苷)与118号克隆。其中X-轴表 示SAM和SAM类似物的不同浓度值，反应不超过1％。以nM为单位，Y-轴是 A/A0，即是有竞争抗原的孔和空白对照孔(零竞争孔)的OD450值的比。

【图4】为竞争性ELISA定量SAM的标准曲线。其中X-轴表示SAM浓度的对 数，Y-轴显示抑制反应的LOGIT值。

【图5】为本发明改进的新的SAM类似物的合成过程。

【图6】为蛋氨酸转硫代谢途径。缩写：THF：四氢叶酸；MS：蛋氨酸合成酶； BHMT：甜菜碱同型半胱氨酸甲基转移酶；MAT：蛋氨酸腺苷甲基转移酶； SAM：S-腺苷蛋氨酸；SAH：S-腺苷同型半胱氨酸；SAHH：S-腺苷同型半 胱氨酸水解酶；ADA：腺苷脱氨酶；AK：腺苷激酶；CBS：胱硫醚β-合成酶。 发明的综述：

本发明提供用于治疗哺乳动物类癌症的方法，包括以下步骤：(a)确定的 所述哺乳动物类患有癌症的生物样品中的甲基化指数；(b)测定所述哺乳动物 类的样品中甲基化指数；和(c)基于(b)的结果选择合适的癌症治疗方案治 疗所述哺乳动物类的癌症。

甲基化指数是通过下列步骤测得的：(i)采集样品；(ii)样品与抗S-腺苷蛋 氨酸特异性抗体混合；(iii)测定样品中的S-腺苷蛋氨酸与(ii)中抗体的结合 情况；(iv)定量(iii)中S-腺苷蛋氨酸抗体与S-腺苷蛋氨酸结合量，以算出样 品中S-腺苷蛋氨酸的浓度；(a2)用本发明建立的免疫测定方法测定体内S-腺苷 同型半胱氨酸含量；(a3)计算(a1)/(a2)比率即是样品的甲基化指数。

本发明还提供了确定癌症治疗方案用于治疗肿瘤患者的方法，包括：(a) 测定患者样品中的甲基化指数；(b)比较样品中和对照组中甲基化指数的水平， 以确定所测的甲基化指数是否有预测意义；和(c)根据(b)的结果决定合适的治疗 方案。根据甲基化指数的大小不仅指导治疗方案，而且可以提示病人对当前治疗 反应好还是反应不佳。

治疗人类抑郁症或心理疾病的方法由以下组成：用以下方法测定人类体 内S-腺苷蛋氨酸含量：(i)采集样品；(ii)样品与抗S-腺苷蛋氨酸特异性抗体 混合；(iii)测定样品中的S-腺苷蛋氨酸与(ii)中抗体的结合情况；(iv)定量(iii) 中S-腺苷蛋氨酸抗体与S-腺苷蛋氨酸结合量，以算出样品中S-腺苷蛋氨酸的浓 度；分析甲基化指数和抑郁症或心理性疾病的关系；根据(b)的相关结果决定合 适剂量的有效药物治疗抑郁症或心理性疾病。

一种用于在受试者中诊断精神性疾病或/和神经变性病症或预测受试者对于 精神性疾病或/和神经变性病症的易感性的方法，该方法包括：(a)获得一个或 多个来自受试者的生物样品；(b)测定样品中S-腺苷蛋氨酸水平或甲基化指数； 和(c)比较(b)中样品中的生物标志物(S-腺苷蛋氨酸水平或甲基化指数)的水 平与对照样品中相应的生物标志物的水平，其中如果来自受试者的样品的两个或 更多生物标志物的水平与对照的相比较明显异常，预计受试者将容易患精神性疾 病或神经退行性疾病。

一种检测在患者中疾病的存在或不存在的方法，其中所述的疾病是伴随着 S-腺苷蛋氨酸缺陷的各种疾病：选定怀疑患有所述疾病的患者或处于具有所述疾 病的风险的人；从所述患者或潜在患者中收集生物样品；使用从S-腺苷蛋氨酸 的半抗原类似物制备的抗体测定所述生物样品中S-腺苷蛋氨酸的水平；分析生 物样品中S-腺苷蛋氨酸的水平与所述疾病存在或不存的关系。

一种用于评估受试者是否需要进行用S-腺苷蛋氨酸的单独治疗或与其它化 疗剂合用的方法，包括以下步骤组合：(a)从怀疑需要这种治疗的受试者中收 集体液样品；(b)测定所述样品中S-腺苷蛋氨酸水平的量；(c)测量的S-腺 苷同型半胱氨酸的水平并计算的甲基化指数；(d)比较所述样品与的正常标准 的甲基化指数；和(e)如果所述样品的甲基化指数超出正常范围，提示需要S- 腺苷蛋氨酸治疗。

对于本发明的阐述

本发明提供了对患有多种疾病的的患者的检查、诊断、治疗和健康评估。他 们的健康状况可以通过精确地测定检测S-腺苷蛋氨酸和S-腺苷同型半胱氨酸的 浓度进行评估。准确测定上述分子将会算出甲基化指数，该指数可反映人体的健 康状况。

本发明的测定法使用特性抗S-腺苷蛋氨酸及其特定类似物。该抗体是通过 接种宿主动物获得的。所使用的免疫原包括免疫以下分子式的一系列化合物(S- 腺苷蛋氨酸半抗原一类)的直接或间接耦合物：

包括其对映体、非对映体、对映体富集的混合物、外消旋混合物、一个原 子富集的形式或其结晶形式、非结晶形式、无定形形式、其带电和不带电的形式、 溶剂化物、代谢物以及它们的盐；其中A是从下组中选出：

其中，M是选自N、N⁺、C、S、S⁺、Se、Se⁺和P的组成的组中；----表示 用于各如上所定义的基团的键合位置；

X独立地选自H、CH₃、CH₂OH、CH₂NH₂、OH、OCH₃、NH₂、SH、CHO 和CN组成的组中；

Z独立地选自CH₃、CH₂OH、CH₂NH₂、OH、OCH₃、NH₂、SH、CHO和 CN组成的组中；

B和C是独立地选自H、OH、NH₂、SH、F、Cl、Br和I组成的组中；

D独立地选自NH₂、OH、SH、F、Cl、Br和I组成的组中；

Y独立地选自H、CH₃、CH₂OH、CH₂NH₂、OH、OCH₃、NH₂、SH、CHO 和CN组成的组中；

W独立地选自H、COOH、CONH₂、COOCH₃、CN、CHO组成的组中及这 些官能衍生物；

然后收集宿主动物的血清。抗体制备细节请参见我们的另外一个美国专利 8344115，其全部内容通过引用结合于此，如同它被在此重复一样。

在另一个方面，本发明提供小鼠单克隆和兔多克隆抗体，包括天然的、重组 的、人源化及嵌合的抗S-腺苷蛋氨酸抗体和抗S-腺苷同型半胱氨酸抗体，制备 方法见美国专利8344115中所描述。

本发明还提供了使用抗SAM和SAH单克隆抗体的免疫测定方法，以定量 甲基化指数和SAM，明确SAM和甲基化指数，对于指导和选择使用SAM的治 疗方案和评估病人的健康状态等。

本发明还进一步提供使用该甲基化指数作为人群普查标记物，提示个体的 一般健康状态。

本发明进一步提供了快速、可靠和廉价的免疫测定方法来测量尿或血清/血 浆样品中SAM和SAH水平，全血半定量快速检测试纸条及小型设备在开发中。 在本发明的一个实施方案中，膜是预浸用抗SAM(或抗SAH)抗体-染料(胶体 金)偶联物。第二抗体被固定在对照区。抗SAM(或抗SAH)抗体被固定在试 验区。样品沿着膜迁移流动时，样品中的抗原与胶体金偶联的抗体形成抗原-抗 体复合物。如果SAM(或SAH)存在，抗原-抗体复合物形成，并会被在这两个 测试和控制区的抗体捕获，因此粉红色(胶体金)条带就会在这两个区域形成。 如果SAM(或SAH)抗原不存在，抗体-染料(或胶体金)结合物通过对照区二 抗体被捕获，从而粉色带只见于对照区，这表明试验条件本身是正确地，结果是 可靠和有效的。标准品和样品的同时测试，比较测试区的和对照区的信号(阳性 带颜色和宽度)强度，来大致确定SAM(或SAH)含量的高低，一种半定量的 SAM(或SAH)的测试方法。

如上述同样机制的竞争性免疫测定方法，试验区固定有SAM(或SAH)抗 原。样本中的SAM(或SAH)与固定在测试区膜上的SAM(或SAH)竞争性 地结合数量有限的抗体-染料(胶体金)偶联物。来自标本中的SAM(或SAH) 越多，膜上SAM(或SAH)与抗体偶联物结合的越少，粉色线会月浅。如果样 品中没有SAM(或SAH)或者极低的，测试区和控制区会同时出现两个较强的 带(或线)。

半定量快速检测试纸条是消费者或患者在服用SAM-e作为治疗药物前，治 疗过程中，以及决定何时停药时使用较为理想的检测方法。

本发明还提供用于哺乳动物类疾病个性化用药的方法。该方法包括测量患者 体液中的甲基化指数，基于所测的甲基化指数水平，提出一个可能有效的治疗方 案。

本发明还提供一种用于监测癌症患者的治疗功效的方法，诊断时测定第一个 时间点的甲基化指数；治疗患者疗程完成后测定第二个时间点的甲基化指数水 平；比较第二个时间点的第一个时间点的受试者的甲基化指数变化，以确定癌 症治疗的效果，甲基化指数提高预示治疗效果好。

在另一个方面，本发明提供用于治疗哺乳动物类癌症患者的方法，该方法包 括以下步骤的方法：(a)测定述哺乳动物类癌症的样品的甲基化指数；(b)分 析所测得到的甲基化指数与相应的癌症进度发展的关系；(c)基于(b)的结果 选择合适的癌症治疗方案治疗所述哺乳动物类患有的癌症。该方法包括收集来自 I期、II、III期或IV期癌症患者血液样品，并分别测定SAM和SAH的水平， 然后计算出甲基化指数，探求甲基化指数与癌症阶段(或分期)的关联关系，然 后选择适当的治疗方案用于治疗所述哺乳动物。

本发明也在确定DNA甲基转移酶抑制剂对于治疗癌症到底是否有效，有多 大效果的问题具有非常好的评估价值。甲基化指数是评估DNA甲基转移酶 (DNMT)抑制剂在特定组织和器官内如何发挥作用，发挥作用的程度和特异性 方面的最好的工具或手段。因此，用本发明提供的免疫方法简单方便地测定甲基 化指数，可以评估DNA甲基转移酶抑制剂功效。

本发明还提供：

1、指导用S-腺苷蛋氨酸进行的治疗

SAMe治疗的有效的疾病包括轻度到中度的抑郁症，骨关节炎(比非类固醇 消炎药更好)，纤维肌痛。SAMe治疗效果一般的情况也有所报道。最有可能的 原因是与其它多数疾病的治疗情形类似，即某些患者，则不适合使用的SAMe 而另一些病人是SAMe治疗的很好候选对象。为了找出病人是否是使用某些药 物的最佳候选，有些必要的检测需要做。申请人已经发现，最好是在治疗疾病之 前，测定血液或尿液样品中SAM的水平。

以SAMe为辅助治疗的各种疾病，例如肝脏疾病，维生素B12或叶酸缺乏， 癌症，用左旋多巴(L-多巴)治疗帕金森氏症患者。原因是这些疾病可引起体内 的SAM水平明显降低肯定的SAM的水平是否实际上是减少了，最好的方式是 直接测量血浆的SAM水平。有的时候SAM水平可以因治疗和疾病本身等情况 有所降低。因此，监测的SAM水平对于改善整体的治疗效果非常重要的，无论 治疗药物中是否有SAMe。在以适当的治疗方案治疗抑郁症，骨关节炎，纤维肌 痛，帕金森氏，阿尔茨海默氏病，痴呆，肝脏疾病，滑囊炎，肌腱炎，慢性腰背 痛，多发性硬化症，脊髓损伤，偏头痛，铅中毒，以及延缓衰老等，当SAM水 平低于一定的阈值时，补充合适剂量的SAMe将有利于整体治疗。当治疗还没 有开始，如果检测到SAM不足，先静脉注射SAMe，以上疾病的症状会迅速缓 解。

另一方面，由于药物或食物与SAMe的相互作用的信息报道与研究非常有 限，加上SAMe也不是没有的显著精神和心血管方面的不良影响和风险这一事 实，正确的做法是，在没有条件听取医生的建议(Fetrow,C.W.etal. "EfficacyofthedietarysupplementSadenosyl-L-methionine." AnnalsofPharmacotherapy35no.11(November2001):1414-1425) 的情况下，应该积极指导消费者，以避免这种未受监控地服用作为膳食补充剂 SAMe出现不期望发生的结果。SAMe与其它抗抑郁的处方同时服用会引起五羟 色胺综合征，这是相当危险的。SAM的免疫测定方法，是让临床实验室和患者 自己能够快速知道体内SAM水平的最佳途径。该免疫分析灵敏、简单、快速、 不需要昂贵的设备。不同时间测定的结果之间是可比的。此外，正常血浆的SAM 浓度似乎因以下因素而有所不同：性别、个体的体重、种族、饮食、健康状况、 是否服用药物等等。因此，监测个体的SAM水平且与该个体的其它时间或正常 对照下SAM水平相比较，对于正确地指导个体化使用SAMe，以达到最佳的治疗 结果起到至关重要的作用。

2、疾病发生和预后与甲基化指数的关联

甲基化指数定义为SAM与SAH的浓度比。在某些情况下，用甲基化指数 比SAM水平尤其重要而准确。原因包括：(1)SAM是在甲基转移酶(COMT) 作用后SAM甲基化反应的直接末端产物。(2)SAM水平随种族、性别、体重 和饮食而变化。甲基化指数可以减少这些因素引起的差异。

癌症被认为具有遗传和表观遗传双重起因。DNA甲基化是最重要的表观遗 传修饰之一。越来越多的研究发现一度被忽视的表观遗传学对许许多多的生命现 象都有影响，这说明甲基化对癌症的影响只能会是更加深远。在癌症发生的不同 阶段，癌细胞中DNA甲基化水平是不同的。异常DNA甲基化在癌症中普遍存 在，表现为基因组范围总体低甲基化和区域性高甲基化的特定模式。总体DNA 低甲基化与原癌基因，例如c-JUN，c-MYC，和c-Ha-Ras的激活相关联，并导 致基因组的不稳定性。位于肿瘤抑制基因启动子区域的CpG岛的高甲基化导致 转录静化和基因组不稳定。CpG岛高甲基化是引起基因失活突变的另外和/或补 充机制，现今被认为是癌症发生的重要因素。肿瘤抑制基因(例如p53基因)启 动子区域CpG岛高甲基化引起的基因失活还与癌症的发展和不良预后相关。研 究结果表明针对甲基化模式或状况的治疗和预防性使用药物或营养添加剂在人 类肝细胞癌(HCC)中的意义，开辟了使用分子靶点，包括在此研究中发现的靶 点，对有效抑制肝细胞癌的发生和发展有重大意义(DiegoF.Calvisiet al.“MechanisticandPrognosticSignificanceofAberrantMethylationinthe MolecularPathogenesisofHumanHepatocellularCarcinoma.”JClinInvest. 2007；117(9):2713–2722.)。

去甲基化制剂可降低DNA甲基化的水平，是一种颇具前景的化学治疗药， 目前已被用于治疗癌症的研究(EstellerM.“DNAmethylationandcancertherapy: newdevelopmentsandexpectations.”CurrOpinOncol.2005Jan；17(1):55-60.2005 Jan；17(1):55-60.)。

在本发明中，癌症或肿瘤包含了所有的在病人体内恶性生长的新生物，包括 原发肿瘤和任何转移肿瘤。癌症可以分为液体肿瘤或实体肿瘤。液体肿瘤包括血 液来源的肿瘤，如骨髓瘤(例如多发性骨髓瘤)、白血病(例如华氏综合症、慢 性淋巴细胞白血病和其它白血病)、淋巴瘤(如B细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤)。 实体肿瘤可能出现在器官中，包括肺癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、结肠癌、 肾癌及肝癌等。在本文中，癌细胞包含了肿瘤细胞，指的是具有异常的细胞分裂 速率(速率增加)的细胞。癌细胞包含但不仅限于肉瘤，还包括鳞状细胞癌、基 底细胞癌、汗腺癌、皮脂腺癌、恶性腺瘤、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓 样癌、未分化型癌、支气管癌、黑素瘤、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、肝外胆 管癌、乳头状癌、移行细胞癌、绒毛膜癌、胚胎性癌、乳腺癌、胃肠癌、结肠癌、 膀胱癌、前列腺癌以及头部和颈部的鳞状细胞癌等；肉瘤包括纤维肉瘤、粘液肉 瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨源性肉瘤、脊索肉瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴 管肉瘤、滑膜肉瘤、间皮肉瘤等；血液肿瘤包括骨髓瘤、白血病(例如急性骨髓 性白血病、慢性淋巴细胞白血病、粒细胞性白血病、单核细胞白血病和淋巴细胞 性白血病)和淋巴癌(如滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴 瘤、恶性淋巴瘤、浆细胞瘤、网状细胞肉瘤和霍奇金病)；神经系统肿瘤则包括 神经胶质瘤、脑膜瘤、成神经管细胞瘤、神经鞘瘤或室管膜瘤等。

3、胚胎发育与人的全面健康与甲基化指数的关联

SAM和SAH的水平可能通过影响DNA的甲基化水平(这种作用反过来将 引起基因激活的特定改变)来控制体细胞胚胎发生。SAM水平上升可能是胚胎 形成和发育成完整的胚胎的先决条件(MunksgaardD,etal.“Somaticembryo developmentincarrotisassociatedwithanincreaseinlevelsof S-adenosylmethionine,S-adenosylhomocysteineandDNAmethylation.”Physiologia Plantarum,Volume93,Issue1,Articlefirstpublishedonline:9OCT2008)。

4、一般人的健康评估和筛选与甲基化指数的关联

甲基转移酶(MT)在人类疾病的形成过程中起重要作用。多巴胺(DA)多 巴胺是由患者体内多巴胺过多造成。比如，有关精神分裂症起因的多巴胺(DA) 假说多巴胺(DA)是说精神分裂症是由患者体内多巴胺过多造成。儿茶酚氧位甲 基转移酶(COMT)可降解中枢神经系统中的儿茶酚胺类神经递质(包括多巴胺类)， COMT为一些精神分裂症的诊断治疗奠定了基础(RensonJetal“Actionofthe inhibitorsofcatecholortho-methyltransferaseontheadrenalcatecholaminesinthe rat.”ArchIntPhysiolBiochim.1960May；68:534-7.)。人体内有超过30种不同的 甲基转移酶，其底物都是对人体功能至关重要的多种物质。

甲基化指数被作为人类总体健康、“活力”或“健康”的一个重要指标。

此外，血浆中正常的SAM浓度因人而异，主要取决于性别(一般来说男性 高于女性)，个体体重，还可能种族和饮食等等。SAM和SAH在代谢上关联紧 密，因此SAH浓度受到以上各因素的影响与SAM相似，用两种物质(SAM和 SAH)的比值应该很有可以排除或减轻这些因素的影响。

SAH和SAM与心血管疾病、抑郁症、癌症以及与老化相关的疾病如阿 兹海默症等的关联是有据可查的。甲基化对于胎儿的发育、分化、蛋白质表达的 表观遗传调控(主要通过DNA，RNA和组蛋白的甲基化)十分关键。SAM和 甲基化指数的高低是衡量人体“活力”的指标或“健康”的标志。

本发明的重大意义在于其提供了：

1、直接、准确地定量所有各种生物样品甲基化指数的方法。

2、在所有的实验室中都可以做到的直接、准确地定量甲基化指数的方法。

3、直接、准确地定量甲基化指数的方法，用于评估整体的健康状况，肿瘤 (癌症)预测和预后，所有疾病的治疗(用S-腺苷蛋氨酸的治疗或其它治疗) 效果的评估。

4、直接、准确地定量生物样品甲基化指数的方法在肿瘤鉴别诊断中的应用。

5、直接、准确地定量生物样品甲基化指数的方法在癌症化疗耐受(效果) 中的应用。

6、直接、准确地定量生物样品甲基化指数的方法在胚胎形成，分化及衰老 研究中的应用。

7、用试纸条或其它介质的半定量和定性免疫方法测定甲基化指数，以方便 消费者用于上述1-6方面。

8、用试纸条或其它介质的半定量和定性测定S-腺苷蛋氨酸，以方便消费者 监测S-腺苷蛋氨酸作为处方和非处方药物治疗一些疾病状态。

9、用试纸条或其它介质的半定量和定性测定S-腺苷蛋氨酸，以方便消费者 用于尿液和血样品。

10、定量和定性测定S-腺苷蛋氨酸，用于指导并监测S-腺苷蛋氨酸作为药 物的治疗情况。

本发明也提供用S-腺苷蛋氨酸和包括S-腺苷蛋氨酸的综合治疗分析及方 案。本发明尤其提供了合成Aza-S-腺苷蛋氨酸半抗原的重要改进。详细阐述见下 合成方案1和图5。

合成方案1

收集了病人血浆样品，用含有本发明中半抗原制备的抗体的酶联免疫吸附实 验(ELISA)方法测定了S-腺苷蛋氨酸(SAM)和S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)含量。 ELISA形式包括以下几种：

形式1：(1)样品或标准品，(2)抗体，(3)半抗原-酶偶联物，(4)二抗包 被的试纸条或酶联板，二抗举例：羊抗鼠抗体或羊抗兔抗体，(5)洗涤液，(6) 酶底物，(7)终止液(如果使用“终点”模式，终止液可有可无；如果使用 “速率”模式，不需要终止液)

形式2：(1)样品或标准品，(2)抗体，(3)二抗-酶偶联物，(4)半抗原- 载体蛋白包被的试纸条或酶联板，(5)洗涤液，(6)酶底物，(7)终止液(如 果使用“终点”模式终止液可有可无；如果使用“速率”模式，不需要终止 液)

形式3：(1)针对2个决定簇的2个配对抗体，(2)样品或标准品，(3)在(1) 中的一个抗体与酶偶联，(4)洗涤液，(5)酶底物，(6)终止液(如果使用“终 点”模式终止液可有可无；如果使用“速率”模式，不需要终止液)

本发明同时阐明基于免疫学方法(ELISA等)的测定SAM的检测试剂盒(包含抗 SAM的抗体)。ELISA试剂盒可以是以上任何一种形式。例如，ELISA试剂盒可 以包括以下成分：(a)二抗吸附在固相介质上，(b)包被(固化)半抗原及类似物， 免疫原或其它含有免疫原的类似的蛋白，(c)以固体或溶解形式的酶底物，(d) 示踪物标记半抗原或类似物(示踪物或酶偶联物)，(e)缓冲液和洗液，(f)附加 成分，主要用于防止非特异性吸附或结合或聚集。(g)加样枪、孵育器、标准品、 标准曲线、结果读数仪。

SAM和SAH含量测定以后，甲基化指数即可以算出(SAM/SAH)，用于 评估个体的健康状况。从11里健康人的测定结果看，健康正常人SAM水平为 147±16nM，SAH水品为29±11nM，甲基化指数为5±1。癌症病人平均SAM 为103±52nM，动脉粥样硬化病人平均SAM为113±15nM，以含有兔单抗 测定SAH试剂盒初步测定动脉粥样硬化病人血浆中SAH明显升高，SAM/SAH 则明显降低。肝脏病人平均SAM为45±8nM(从26例样品)，比正常人的SAM 水平明显降低。SAM和SAH的比值，及甲基化指数比SAM或SAH能够更精确 地反映一般健康状况，疾病状态，发展和预后。一般认为健康人的甲基化指数应 该大于4(该值与检测方法有关，这个值是由高压液相和质谱的方法算出来的) 在病理状况下，由于SAM水平降低，同时SAH水平升高，甲基化指数小于4， 甚至小于1。降低的甲基化指数反过来会影响体内重要物质如DNA，RNA，多 肽，激素，神经递质等的甲基化过程，从而导致身体病变的发生或恶化。

甲基化指数也可以用来决定化疗方案。甲基化指数明显降低的肿瘤病人可 以使用较积极的方案。甲基化指数可以用来根据癌症阶段和每个病人的具体情况 选择合适的治疗方案，显示甲基化指数在个体化治疗和用药中的应用价值。

实施例简述

以下实施例旨在展示上述提及的部分检测方法，化合物和抗体的应用个例 (所有涉及的数字均有变动范围且受具体实验条件所限，此为生物学领域实验受 多方面影响的常理)和治疗方案，不应该认为有可能限制本发明的范畴。

实施例1

制备抗S-腺苷蛋氨酸和S-腺苷同型半胱氨酸单抗隆和多克隆抗体

试剂：

AdaM：Azaadenosyl二氨基蛋氨酸，

ASAM：Aza-SAM，或者氮-腺苷蛋氨酸

BgG：牛γ球蛋白

BSA：牛血清白蛋白

BTG：牛thyrogloblulin

CSAM：碳-腺苷蛋氨酸或者6-甲基6-去氨西奈芬净

daH：去氨-5-腺苷同型半胱氨酸

daHSO：daH磺酸盐

DCC：二环己基碳二亚胺

DMF：二甲基甲酰胺

EDAC：乙基碳二亚胺盐酸盐

ELISA：酶联免疫吸附检测

GAMplate/strip：羊抗鼠免疫球蛋白包被吸附板或者条

GARplate/strip：羊抗兔免疫球蛋白包被吸附板或者条

HRP：辣根过氧化物酶

IB：孵育缓冲液

KLH：血蓝蛋白

NHS：N-羟基琥珀酰亚胺

PBS：磷酸盐缓冲盐水

RT：保留时间(高效液相色谱)，或室温

SAH：S-腺苷同型半胱氨酸

SAM：S-腺苷蛋氨酸

1、制备AdaM-NHS：把21.7mg(0.107mmole)的DCC和7.2mg(0.061 mmole)NHS加入到装有AdaM(15.1mg，ca.0.041mmole)e的瓶子中过夜，残 留固体真空干燥3-4小时，在氮气环境中加入大约105毫升干燥的DMF，然后 将瓶子密封。该溶液在室温环境下搅拌过夜。薄层色谱分析显示有NHS酯形成。

2、准备AdaM-BSA：称取59.8mgBSA加入圆底烧瓶中，加入5毫升新鲜 制备的100mm的磷酸钠缓冲溶液，pH值为8.25。在4度水浴中剧烈搅拌，将上 述方法制备的NHS每隔几分钟缓慢加入10μL。共加入150μL后，混合物变为色。 再加一毫升的DMSO溶液助溶。另外加50μL的NHS到DMF中，溶液再次变 色。采用水浴超声处理5分钟后分5次各加入10μL的NHS。DMF中共加入150μL 的NHS后，超声混合20分钟。为了确保无游离半抗原，用PBS缓冲液透析(1.5 升×4)2天以上。最终体积约36毫升，估算BSA浓度为1.66mg/mL。

3、准备AdaM-KLH：利用上述方法，称出17.5毫克KLH，15.1毫克AdaM。 透析后的最终体积为29.5毫升，浓度为0.6毫克/毫升。

4、准备AdaM-PLL：称取4.72mgAdaM溶于1mLDMF中，再加入6.5毫 克EDC.HCl和4.0mg的NHS，密封搅拌混合均匀，置于暗处室温过夜。称取1.5 mg的PLL溶于pH8.2的1mL10mMPBS中，随后将活化的AdaM缓慢的加入 到PLL缓冲液中，暗处混合搅拌过夜。混合物用10mmpH7.3的PBS透析48 小时，透析后的最终体积为3.5毫升，浓度为1.4毫克/毫升。

5、准备SAH-BSA：称取SAH(Sigma)3.8mg溶于1.5mLDMF中，再加 入10毫克EDC.HCl和4.5mg的NHS，密封搅拌混合均匀，置于暗处室温24小 时。称取12.9毫克BSA溶于2mLpH7.810mm的PBS中。将SAH溶液缓慢 加入到BSA溶液中混合，4度暗处混合搅拌过夜。反应混合物用10mmpH7.3 的PBS透析72小时。透析后的最终体积为8.4毫升，浓度为1.4毫克/毫升。

6、准备SAH-PLL：称取1.5mg的SAH溶于1mLDMF，再加入4毫克 EDC·HCl和2mg的NHS，密封搅拌混合均匀，置于暗处室温过夜。称取1.5mg 的PLL溶于4.7mL50mMpH9.6PBS中，随后将活化的SAH缓慢的加入到PLL 缓冲液中，暗处混合搅拌过夜。混合物用10mmpH7.3的PBS透析48小时，透 析后的最终体积为7.0毫升，浓度为0.93毫克/毫升。

7、制备单克隆抗体SAM和SAH的一般流程：

基于Kolher和Milstein的方法(自然，1975，第256期，495-497页)，目前 常见的方法是用小鼠制备单克隆抗体。

用Balb/c小鼠做单克隆抗体的免疫和腹水生产，多次皮下注射免疫原(总 体积为1mL)初始注射用完全弗氏佐剂和AdaM-BSA或AdaM-KLH按照1:1的 比例完全混合并在PBS中充分乳化。随后的注射用弗氏不完全佐剂。

定期收集免疫动物的血液离心分离细胞。将获得的抗血清进行检测评估， 以确定免疫反应和抗体效价。根据应用程序，抗体可直接使用。在必要时，可以 进一步纯化免疫球蛋白，用硫酸铵或硫酸钠或蛋白A的柱层析。

可以通过注射到宿主体内获得腹水，然后通过蛋白质的亲和柱纯化腹水得 到单克隆抗体。也可以通过体外培养的方法制备杂交瘤细胞制备单克隆抗体。

融合前三天小鼠静脉注射免疫原做最后加强。收获小鼠脾脏后用弗式压碎 器磨碎。脾细胞与骨髓瘤NS-1细胞按5：1的比例融合。融合后的细胞悬液， 再接种在96孔板中。杂交瘤细胞在含18％胎牛血清的RPMI1640中生长，加入 HAT和HT进行补充筛选。用AdaM-PLL筛选出的阳性克隆进行进一步培养。 最后的选出有阳性有交叉的克隆。选定的克隆，注入小鼠腹腔生产腹水。

通过多次筛选，我们确定了具有更好的特异性并且与其他类似物的交叉较 小的几个克隆，对2株单克隆抗体的效价进行了测试，结果显示在图1：

8、兔多克隆抗体SAM与SAH：

用新西兰白兔做多克隆抗体生产，多次皮下注射免疫原(总体积为1mL) 免疫过程如生产单克隆抗体的免疫小鼠过程。对于抗-SAM和抗-SAH的兔抗血 清的检测效价均为1:12000。

实施例2

抗体的特异性

为进一步测试这些克隆的特异性，84号克隆的交叉反应很低，仅1.25％(见 图2)。交叉反应中使用的三种SAM类似物为S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)、 蛋氨酸和腺苷。在竞争ELISA中类似物的剂量高于SAM剂量约80倍。10μM SAH、蛋氨酸、和腺苷时，竞争反应没有出现。当SAM加入量远低于类似物时， 从图2可以见到清晰的抑制反应，抑制率超过了40％，然而三种类似物却没有抑 制现象。

118号克隆与SAH、蛋氨酸和腺苷的交叉反应也是很低(图3)。竞争ELISA 中，SAM、SAH、蛋氨酸和腺苷使用剂量与实例2中相同。结果显示，游离的 SAM显著的抑制抗SAM单克隆抗体118号与包被在ELSIA板微孔中的AdaM 的结合，然而SAH、蛋氨酸和腺苷却没有抑制。

实施例3

竞争ELSIA法

试剂：

IB：10mM磷酸缓冲液、150mMNaCl，0.2％BSA，0.1％吐温-20，0.1％ Proclin，pH7.4

样本：(a)SAM甲苯磺酸盐硫酸氢盐(Sigma)(b)SAH盐(分子量406.39) (c)腺苷(Sigma)(d)甲硫氨酸(Sigma)。HRP标记羊抗鼠IgG(H+L)二抗 (EarthOx，SanFrancisco，CA)。HRP底物：单组份底物溶液NeA-blue四 甲基联苯胺底物。抗原稀释液：0.5％BSA的IB。包被缓冲液：50mM碳酸盐缓 冲液pH9.6。洗液：PBSpH7.5，0.1％吐温-20。

(1)、AdaM-BSA包被于ELSIA板，封闭后甩干，然后与SAM、SAH、甲 硫氨酸和腺苷竞争。类似物溶于40μL抗原稀释液，再加入44μL0.025μg/mL纯 化的抗SAM单克隆抗体和16μLIB+Tris(100mMpH8.5)缓冲液，于37℃一起孵 育1-2小时。

(2)、用PBST洗板三次，甩干。

(3)、每孔加入100μL合适浓度的HRP标记羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育20 分钟。

(4)、洗板三次甩干。

(5)、每孔加入100μLHRP底物，孵育10-15分钟。

(6)、每孔加入50μL2NH₂SO₄终止反应。

(7)、酶标仪读取OD₄₅₀值。

为测量生物样本中SAM含量，开发了竞争ELISA法。

SAM、SAH竞争ELISA法标准曲线如图4所示。

LOGIT＝ln[(A/A0)/(1-A/A0)]，其中A为样本或者标准品OD450值，A0为 抗原为0时的OD₄₅₀值。LOGIT负值表示A/A0低于50％，抑制率(1-A/A0)高 于50％。

精确称量12.6mg标准品，溶于少量的DMF溶液，然后在0.1mMHCl中完 全溶解，于250mL容量瓶中定容。以此于100mL容量瓶中各自配制the5μg/mL. 2.5μg/mL，1.25μg/mL，0.625μg/mL，0.3125μg/mLand0.15625μg/mL标准品 溶液。

实施例4

制备了HRP-偶联的抗SAM单克隆抗体克隆84，另外一个抗SAM的单克 隆抗体与84抗体配对，有可能建立夹心ELISA以便定量SAM。

实施例5

血样品收集步骤

所有正常和病人样品收集前均获得知情同意。采集静脉血到EDTA抗凝 管，摇匀后马上放到含有冰水混合物的容器中。在采血后的30分钟内，做以 下步骤：预先将离心机冷却到4摄氏度，将采血管直接放到合适的转头中， 以2000g离心30分钟。迅速将血浆全部转移到Eppendorf管中，每100μL血 浆加入10μL1N醋酸。样品或者立即测定SAM和SAH或者标记，分装，置 于-20℃或-70℃冻存待以后测定。移除血浆后剩余的全血细胞分装冻存用于 测定SAM，SAH或DNA，有些样品，专门分出白细胞层，冻存以便将来从 白细胞中提取DNA。

实施例6

11例20-50岁的身材正常的亚裔男性和女性血样品，按以上竞争性ELISA 方法测定SAM和SAH含量。平均SAM水平为147±16nM，SAH水品为29± 11nM，甲基化指数为5±1。将会有更多血浆样品用于SAM和SAH的免疫测 定，以观察不同种族，年龄，性别，体重，饮食，生活方式对SAM和SAH的 影响。随着大规模的针对SAM/SAH的流行病学研究的开展，与不同疾病状态 下SAM/SAH的比较，用甲基化指数作为一般健康指征将会更加明确。

实施例7

以直接法竞争ELISA测定住院准备化疗的病人的血样品SAM和SAH含量。 12例癌症病人平均SAM为103±52nM，平均SAH为250±90nM，平均甲基 化指数为0.5。更多的诊断信息明确，症状，资政分期，病情进展，治疗，复 发，预后明确的临床样品的分析工作正在进行，以期得到完整的甲基化指数与癌 症各个方面的关系的资料来进一步验证。多种癌症化疗前后样品已经收集。测定 人血白细胞的DNA甲基化程度。癌症病人的DNA甲基化异常和甲基化指数或 整体DNA甲基化程度的关系也将为健康状况和治疗方案有指导作用。

实施例8

动脉粥样硬化和心脏病患者(重症监护病人)的血浆样品也用我们建立的竞 争性ELISA来分析SAM和SAH含量，商业ELISA试剂盒测定同型半胱氨酸 (HCY)含量。10例动脉粥样硬化病人样品平均SAM为113±15nM，SAH含 量为680±258nM，以含有兔单克隆抗SAH抗体(ab111903，abcam，Cambridge， MA，USA)建立的SAH试剂盒初步测定心脏突发病人血浆中SAH明显升高。更 多的数据证明SAM/SAH在动脉粥样硬化病(包括冠状动脉，脑血管和外周血管) 中明显降低。甲基化指数和被认为与心血管疾病死亡率有正相关的同型半胱氨酸 含量的关系很明确(因为SAH是HCY的来源)。SAM/SAH可能比HCY更好， 能更直接地反映心脏病的发作和评估治疗有效性的指标。

实施例9

肝脏疾病比如传染性肝炎(有些伴有胆管狭窄)，肝硬化，肝纤维化等的血 浆样品也用我们建立的竞争性ELISA来分析SAM和SAH含量。26例病人样品 平均SAM为45±8nM，远比正常人的SAM水平低；但是SAH水平则明显高 于正常人，为342±129nM，甲基化指数平均值大约为0.13.

实施例10

抑郁症病人的血液样品也用来测定SAM含量。预计这类病人样品由湘雅第 二附属医院精神健康研究所(无明显器质性病变的抑郁症)和宁波第第二医院神 经内科和康复科(有明显器质性病变的抑郁症)提供。尤其要比较用SAM-e或 其它药物治疗前后样品中SAM和SAH含量。10例样品中SAM水平为20±18 nM，SAH为340±180nM.甲基化指数平均约为0.064。SAM和甲基化指数是指 导个体化用药治疗抑郁症的有益的武器(指标)，并对预后有指导意义。定性和 半定量SAM试纸条将对于抑郁症病人是否使用SAM或其它抗抑郁药物治疗， 使用多少剂量等，提供了简单方便的评判方法。这将帮助病人合理地选择对自己 有利的药物与剂量。

实施例11

巴金森氏病人的血液样品也用来测定SAM含量。样品由宁波第二医院神经 内科和康复科确诊后提供。同样用本发明中建立的竞争性ELISA方法测定血浆 样品中SAM和SAH水平。

实施例12

风湿性关节炎和多发性硬化病人的血液样品也用来测定SAM含量。样品由 宁波第二医院康复科确诊为骨关节炎和多发性硬化后提供。同样用本发明中建立 的竞争性ELISA方法测定血浆样品中SAM和SAH水平。研究发现，SAM水 平和甲基化指数在骨关节炎和多发性硬化病人中有明显改变。骨关节炎和多发性 硬化病人的SAM和SAH水平在服用SAM或其它有效治疗药物前后进行比较会 有变化。SAM和甲基化指数也将会是骨关节炎和多发性硬化病个体化用药和知 道预后的有效指征。定性和半定量SAM试纸条将对于这些病人是否使用SAM 或其它治疗骨关节炎和多发性硬化病药物进行治疗，使用多少剂量等，提供了简 单方便的评判方法。这将帮助病人合理地选择对自己有利的药物与剂量。

实施例13

实施例子6-12中样品的甲基化指数测定方法如下：用本发明中建立的免疫 测定方法如竞争性ELISA方法同时测定SAM和SAH的含量，计算SAM和SAH 的比值，就是甲基化指数。甲基化指数应该比单一的SAM或SAH或HCY指标 更能精确地更有说服力地评估健康状况，疾病状态，病情发展和预后。一般认为 正常人甲基化指数大于4。在病理情况下，会小于4，甚至小于1，原因是在病 理状况下SAM水平减低同时SAH水平升高。降低的甲基化指数反过来同时会 进一步影响DNA，RNA，多肽，激素，神经递质等重要生命分子的甲基化过程 的正常进行。所以把甲基化指数调整到正常范围内对人体健康有益。

实施例14

化合物1：2’,3’-O-异丙叉腺苷(25克，82毫摩尔，反应式1)和除水干燥 的吡啶(200mL)一起倒入500毫升单口圆底烧瓶中，在氮气的保护下使用磁子 强力搅拌。圆底烧瓶在热烘干器上加热并强力搅拌使腺苷溶解，5分钟后所用固 体物完全溶解。将混合物溶液放置在冰水浴中20分钟左右。对甲苯磺酰氯固体 分8次在一个小时左右加完，以防止反应明显放热。混合物在0℃保持反应5天， 使用薄层色谱检测反应完全后，往产物中加入100mL纯水和300mL乙酸乙酯。 混合物转移到分液漏斗中，加入100mL的3摩尔每升的盐酸，分离出来的有机 层分五次每次使用200mL纯水冲洗，以除掉有机层中过量的吡啶盐酸盐。有机 层使用减压蒸馏旋干，再使用100mL的二氯甲烷溶解，然后缓慢的加入1.12L 庚烷并不停的搅拌，通过分液漏斗分离出31.1克的白色沉淀，使用质谱和核磁 共振谱确定其结构。

实施例15

化合物2：化合物1(32.2克，70毫摩尔)放入300mL带密封的磁性搅拌 装置中，然后加入200mL含有2M的甲胺四氢呋喃溶液，然后将反应装置密封。 反应装置浸入到50摄氏度的油浴中反应两天并不停搅拌，然后将反应装置带出 油浴，最后放置在冰水浴中反应30分钟。打开密封盖，使用氮气将多余的甲胺 吹干。将产物使用旋转蒸发器旋干。使用5％甲醇二氯甲烷溶液过色谱柱纯化产 物，收集到3.51可得化合物2，使用核磁共振确定其结构。

实施例16

化合物3：5.0克(15.6毫摩尔)氨基化合物2放置在500mL的单口瓶中， 往单口瓶中加入150mL干燥的乙腈和2.1克(16.38毫摩尔)的二异丙基乙胺， 在35℃搅拌30分钟，再加入2.55克溴丁烷，然后加入288mg碘化四丁铵，混 合物在40℃反应5天。反应产物使用减压蒸馏浓缩，浓缩物使用5％的甲醇二氯 甲烷溶液过层析柱，收集到5.36克产物，产率为82％。

实施例17

化合物4：甲酯化合物3(7.76克，18.4mmol)放入250mL的圆底烧瓶中， 往圆底烧瓶中加入15mL甲醇和15mL纯水，搅拌10分钟。加入1.55克固体氢 氧化锂搅拌反应2小时(直到薄层色谱和液相色谱检测反应完全)。粗品浓缩后 进行下一步，无需进一步纯化。

实施例18

化合物5：约7克的粗锂盐4溶解于150毫升3摩尔每升的盐酸，在室温下 搅拌反应4小时(直到原料完全消失在TLC和LCMS)。粗的混合物经过滤后，然 后在压力下浓缩干燥。粗渣使用5次，每次120克的40％甲醇水洗脱液过柱纯化。 将纯化的组分汇集，然后集中在高真空下，在40℃下干燥。该产品是一种棕色 的油状物质。产品通过高效液相色谱、质谱和核磁共振谱确认。4.8克99.55％产 品转入9瓶以1：1甲醇和水的混合物分装，每一瓶样品集中在40℃高真空下 干燥完全。

所有在本申请中引用的专利，专利申请和期刊出版物，包括其中引用的参考 资料，在此通过引用的方式全部并入本发明。

虽然本发明的许多实施方案包括目前优选的实施方案被简单描述如上，许多 其它稍有变化的类似的实施方案实属在本公开的阐述和以下权利要求之范围内。 因此，该所提供的优选实施方案和实施例的细节不被解释为限制性的。应当理解 的是，这里使用的术语仅仅是描述而不是限制性的，并且各种类似的变体和许多 等效物或概念将不脱离其宗旨或离开所要求保护的发明的范围。

实施例19

测定了一期癌症病人的SAM和SAH水平，对于甲基化指数小于2(比正常 平均值小一倍左右)，建议给化疗的病人SAM-e进行辅助治疗。

实施例20

可以测定病人尿液或者血液(如果尿液中有些特别的成分影响测定结果使得 结果偏低等)中的甲基化指数是个体化治疗抑郁症病人的好办法。SAM治疗方 案可以包括如下：

每天服用SAM-e800-1600毫克SAMe的经口服6周。SAMe通过静脉注射或给 予肌肉注射，剂量范围从200至400mg/天至多8周。口服1000-1600毫克/天15 天至6周。静脉注射150-400毫克/每天持续3-4周的剂量是最常见的。400mg的 S-腺苷-L-甲硫氨酸-1,4-丁二磺酸稳定盐(诺尔制药公司，米兰，意大利)每日 肌肉注射。75-200毫克SAMe肌肉注射14-30天。200-400毫克/250毫升生理盐 水，前三天静脉注射的治疗，随后以400毫克/日的SAMe治疗4-14天。

使用在本发明中开发的甲基化指数ELISA试剂盒，对服用高剂量(>400mg/ 天)的SAM-e的病人每3-5天测量的甲基化指数，以便有效地及时地调整SAM-e 的剂量。如果甲基化指数增加太快，比如在任何两次测定之间差别超过5倍或 甲基化指数为一个特定数字如0.5(同时患者明显伴有与SAM-e使用相关联的临 床症状时)，建议减少用量，特别是对于有高血压或其它心血管疾病的患者。高 危人群最好每日测试甲基化指数或每天使用SAM和SAH快速检测试纸条以定 性或半定量检测在血液或尿中SAM和SAH水平，以确保SAM-e用药的安全性， 以避免任何可能的副作用。

对于那些每日口服SAM-e低于400毫克的情况，也建议测定甲基化指数， 或者至少在需要的时候测定，或者每周测定一次，以便明确SAM的用量是否合 适，以及何时停止服药。

除非甲基化指标恢复正常并稳定一两个星期，不要停止服药SAM-e。

对于甲基化指数正常或接近正常的抑郁症患者，不要将SAM-e作为首选治 疗用药或方法。相反，使用其他类型的抗抑郁药品。但是，甲基化指数仍然可能 是一个很好的指标来监测药物治疗的有效性等。定期进行检测甲基化指数仍然是 重要的，以确定何时可以停止药物治疗。

实施例21

可以测定病人尿液或者血液(如果尿液中有些特别的成分影响测定结果使得 结果偏低等)中的甲基化指数是个体化治疗肝脏和/或胆管狭窄病人的好办法。 SAM治疗方案可以包括如下：

对于成年人，根据肝脏和/或胆管狭窄或其它疾病的严重性，可以使用如下 方案：

每天口服SAM-e1600毫克SAM-e约2周。SAM-e通过静脉注注射，剂量 1000mg/天约4周。

治疗妊娠期间胆管阻塞问题，缓慢地静脉输注500毫克的2次 /天，持续14天，然后每天2次口服SAM-e500毫克SAM-e知道分娩完毕。另 外，每天口服600毫克的也可以用来处理妊娠性胆汁淤积的问题。每 天口服SAM-e1800毫克和beta-mimetics。每天口服2次SAM-e500毫 克/次。其它SAM-e使用方法：1000毫克每日肌肉注射直到分娩；200毫克/天静 脉注射持续20天；400毫克/次，2次/天静脉注射知道分娩；800毫克/天静脉 滴注3小时，持续20天。800mg的S-腺苷-L-甲硫氨酸-1,4-丁二磺酸稳定盐(诺 尔(Knoll)制药公司，米兰，意大利)每日静脉注射。

使用在本发明中开发的甲基化指数ELISA试剂盒，对服用高剂量(>600mg/ 天)的SAM-e的病人每3天测量的甲基化指数，以便有效地及时地调整SAM-e 的剂量。如果甲基化指数增加太快，比如在任何两次测定之间差别超过5倍或甲 基化指数为一个特定数字(同时患者明显伴有与SAM-e使用相关联的临床症状 时)，建议减少用量，特别是对于有高血压或其它心血管疾病的患者。高危人群 最好每日测试甲基化指数或每天使用SAM和SAH快速检测试纸条以定性或半 定量检测在血液或尿中SAM和SAH水平，以确保SAM-e用药的安全性，以避 免任何可能的副作用。

对于那些每日口服SAM-e低于600毫克的情况，也建议测定甲基化指数， 或者至少在需要的时候测定，或者每周测定一次，以便明确SAM的用量是否合 适，以及何时停止服药。

除非甲基化指标恢复正常并稳定一两个星期，不要停止服药SAM-e。

所有在本申请中引用的专利，专利申请和期刊出版物，包括其中引用的参考 资料，在此通过引用的方式全部并入本发明。

虽然本发明的许多实施方案包括目前优选的实施方案被简单描述如上，许多 其它稍有变化的类似的实施方案实属在本公开的阐述和以下权利要求之范围内。 因此，该所提供的优选实施方案和实施例的细节不被解释为限制性的。应当理解 的是，这里使用的术语仅仅是描述而不是限制性的，并且各种类似的变体和许多 等效物或概念将不脱离其宗旨或离开所要求保护的发明的范围。