基于辅因子调控的s-腺苷蛋氨酸合成研究

摘要

S-腺苷蛋氨酸(SAM)是一种在生物中广泛存在并具有重要生理功能的小分子物质。临床上将SAM用于关节炎、肝病、抑郁症等疾病的治疗，效果显著。目前SAM主要通过微生物发酵制备，但存在产量低，前体L-蛋氨酸和ATP供应不足等问题。
　　研究者试图通过代谢工程改造以提高菌株生产SAM的能力，然而SAM在微生物中的代谢途径冗长复杂，而且不是终端代谢产物，仅针对主代谢途径中涉及到的基因进行分子操作，并不能大幅度提高SAM产量。作为胞内重要微环境的辅因子ATP/ADP、NADH/NAD+、NADPH/NADP+参与了细胞内大量的反应过程，将物质代谢途径联成复杂的网络体系，最终导致物质代谢流的分配受到辅因子形式和浓度的牵制。因此，通过辅因子工程手段调控胞内代谢物的合成具有极大的潜力。
　　本论文以解析辅因子对于SAM合成的调控机理为目的，通过代谢工程策略改造大肠杆菌(Escherichia coli)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)胞内辅因子形式和浓度，综合运用荧光定量PCR和LC/MS/MS方法分析并总结辅因子对于产物合成的生理机制以及能量代谢和其他物质代谢的规律，为高产SAM的菌株的代谢工程改造提供理论基础。主要研究工作如下:
　　1.建立基于合成的sRNA技术用于E.coli体系胞内辅因子调控的系统，通过干扰基因转录水平调控胞内辅因子水平。构建靶向红色荧光蛋白的sRNA结合流式细胞仪和荧光定量PCR，证实了该策略可有效调控胞内基因转录表达，弱化效率可达85％。应用该策略调控副产物竞争消耗ATP和NADPH的代谢途径相关基因，构建了相应的合成sRNA: anti-proB,anti-glnA,anti-argB,anti-aroE,anti-argC,anti-proA，anti-ilvC和anti-proC。通过荧光定量PCR结果表明目标基因的转录水平都有不同程度的降低。与对照菌相比，带有合成sRNA的重组菌胞内ATP水平和NADPH水平均有所提高，胞内SAM产量提高约1倍。
　　2.在E.coli中通过分别引入NADH激酶(pos5p)以及转氢酶(PntAB)和NAD激酶(YfjB)联用构建两种NADPH再生系统。分析NADPH浓度、NADPH/NADP+比率变化对于胞内物质代谢的扰动及产物SAM合成的关系，发现通过NADPH再生系统提高NADPH水平及NADPH/NADP+比率可以有效地促进胞内SAM的合成。其中基于NADH激酶再生系统使得胞内SAM产量提高13倍，产量达5.30mg/L。
　　3.由于S.cerevisiae中的NADPH在线粒体和细胞质中的代谢相对独立，因此在E.coli的研究基础上，以S.cerevisiae BY4741单倍体模式菌株为研究对象，研究了不同亚细胞结构内NADPH对于产物合成的影响。通过激光共聚焦显微镜证实了成功在S.cerevisiae线粒体中表达了NADH激酶(pos5编码)，在细胞质中表达了不带信号肽的NADH激酶(pos5△17编码)。实验发现细胞质中NADPH再生的菌株NBYSM-1合成SAM的能力以及NADH/NAD+比率、ATP水平均要明显高于线粒体中NADPH再生的菌株NBYSM-2，NADPH/NADP+比率低于NBYSM-2。说明NADPH对于菌株合成SAM产量有促进作用，ATP对SAM的合成影响更为重要。
　　4.以S.cerevisiae为研究宿主，在过表达sam2的基础上，构建了多种不同形式的ATP调控系统，pRS425-PHXT7-noxE-THXT7，pRS425-PHXT7-vhb-THXT7,pRS425-PHXT7-ptxD-THXT7和pRS425-PHXT7-fdh1-THXT7。结果表明S-腺苷蛋氨酸合成酶活性对于SAM的合成影响极为重要，过表达sam2的菌株胞内SAM产量提高一倍。vhb和ptxD对于胞内SAM的合成有较为显著的促进作用，其中菌株ABYSM-2发酵28 h胞内SAM浓度最高，与对照相比提高67％，可达54.92 mg/L。借助液质结合代谢组分析，发现重组菌株和对照菌株的代谢物差异较大，其中氨基酸途径差异明显，可能是影响SAM合成的重要因素。通过qPCR数据表明NADH水平和ATP水平提高会显著抑制糖酵解及TCA途径关键酶的基因转录水平，其中tdh1，pyk2和idh1受NADH影响较大。其中磷酸戊糖代谢途径的zwf1在ATP水平提高的菌株中没有受到影响，但是受到NADH影响而降低了转录水平。这也导致了碳物质重新分布，从而影响胞内SAM的合成能力。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 S-腺苷蛋氨酸简介

1．1．1 S-腺苷蛋氨酸的理化性质

1．1．2 S-腺苷蛋氨酸的生理功能

1．2 S-腺苷蛋氨酸的生产方法

1．2．1 酶催化法合成S-腺苷蛋氨酸

1．2．2 全细胞催化法合成S-腺苷蛋氨酸

1．2．3 微生物发酵法生产S-腺苷蛋氨酸

1．3 S-腺苷蛋氨酸高产菌株的改造

1．3．1 S-腺苷蛋氨酸高产菌株的传统选育

1．3．2 S-腺苷蛋氨酸合成酶的选择及改造

1．3．3 S-腺苷蛋氨酸合成途径的优化

1．3．4 菌株合成ATP能力的改善

1．4 辅因子调控的研究现状

1．4．1 辅因子工程简介

1．4．2 辅因子NAD(P)H调控的研究现状

1．4．3 辅因子ATP调控的研究现状

1．5 论文主要研究内容

1．5．1 微生物法制备S-腺苷蛋氨酸存在的问题

1．5．2 辅因子调控S-腺苷蛋氨酸合成过程存在的问题

1．5．3 主要研究内容

第二章 NADPH调控大肠杆菌合成S-腺苷蛋氨酸的研究

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 菌株和质粒

2．2．2 引物

2．2．3 酶及试剂盒

2．2．4 实验仪器及常用试剂

2．3 分子生物学操作方法

2．3．1 基因组提取

2．3．2 大肠杆菌质粒提取

2．3．3 目的基因的扩增

2．3．4 琼脂糖凝胶电泳及DNA回收

2．3．5 酶切及连接

2．3．6 大肠杆菌的化学转化

2．3．7 菌落PCR

2．3．8 大肠杆菌的电转化

2．3．9 SDS-PAGE电泳

2．3．10 细菌RNA的提取

2．3．11 cDNA的制备

2．3．12 荧光定量PCR

2．4 发酵方法

2．4．1 菌种保藏

2．4．2 培养条件

2．5 分析方法

2．5．1 生物量测定

2．5．2 荧光强度测定

2．5．3 S-腺苷蛋氨酸的萃取及含量测定

2．5．4 谷胱甘肽的提取及含量测定

2．5．5 其他代谢物测定

2．5．6 ATP和ADP的含量测定

2．5．7 NAO(H)和NADP(H)的含量测定

2．6 实验结果与讨论

2．6．1 基于人工合成sRNA系统的构建

2．6．2 基于人工合成sRNA系统的弱化效果评价

2．6．3 基于人工合成sRNA调控副产物代谢途径相关基因

2．6．4 基于合成sRNA系统调控胞内NADPH水平

2．6．5 NADPH再生系统对S-腺苷蛋氨酸合成的影响

2．6．6 NADPH调控胞内S-腺苷蛋氨酸合成的机理研究

2．7 本章小结

第三章 基于人工合成的sRNA策略及核糖开关ydaO模块调控大肠杆菌胞内ATP水平的研究

3．1 引言

3．2 实验材料与方法

3．2．1 菌株和质粒

3．2．2 引物

3．2．3 枯草芽孢杆菌基因组提取

3．2．4 磷钼酸比色法测定胞内ATP含量

3．3 结果分析与讨论

3．3．1 ATP依赖的副产物代谢途径相关基因的sRNA弱化系统构建

3．3．2 合成的sRNA系统对于细胞生长和S-腺苷蛋氨酸合成的影响

3．3．3 合成的sRNA策略扰动ATP水平并且重新定向碳代谢分布

3．3．4 ATP水平变化对于谷胱甘肽合成的影响

3．3．5 ydaO模块动态调控ATP的原理及设计

3．3．6 ydaO模块动态调控ATP相关质粒的构建

3．3．7 ydaO模块在大肠杆菌胞内表达的验证

3．3．8 核糖开关ydaO对于大肠杆菌胞内合成S-腺苷蛋氨酸的调控作用

3．4 本章小结

第四章 酿酒酵母细胞质和线粒体中NADPH的调控作用

4．1 引言

4．2 实验材料与方法

4．2．1 菌株和质粒

4．2．2 引物

4．2．3 菌种保藏及培养条件

4．2．4 酿酒酵母的化学转化

4．2．5 重组酿酒酵母菌落PCR

4．3 结果分析与讨论

4．3．1 酿酒酵母不同区域NADPH再生重组质粒的构建

4．3．2 NADPH再生重组菌株的构建

4．3．3 NADPH再生系统在酿酒酵母细胞中的定位表征

4．3．4 NADPH再生系统对于胞内吡啶核苷酸的扰动

4．3．5 分区域调控NADPH对于S-腺苷蛋氨酸合成的影响

4．3．6 酿酒酵母分区域NADPH调控机理分析

4．4 本章小结

第五章 ATP调控用于酿酒酵母合成S-腺苷蛋氨酸的研究

5．1 引言

5．2 实验材料与方法

5．2．1 菌株和质粒

5．2．2 引物

5．2．3 酿酒酵母基因表达盒的快速构建

5．2．4 酿酒酵母RNA的提取

5．2．5 酿酒酵母胞内代谢物的测定

5．3 结果分析与讨论

5．3．1 pRS425-PTFE1-sam2-TPGI重组质粒构建

5．3．2 胞内ATP水平扰动的相关质粒构建

5．3．3 启动子的选择

5．3．4 ATP水平变化对于S-腺苷蛋氨酸合成的影响

5．3．5 酿酒酵母胞内ATP水平变化

5．3．6 ATP调控对于胞内代谢物的分布影响

5．3．7 ATP调控对于中心碳代谢关键基因的转录作用分析

5．3．8 不同蛋氨酸浓度对于S-腺苷蛋氨酸合成的影响

5．4 本章小结

第六章 结论与建议

6．1 论文主要结论

6．2 论文创新点

6．3 问题与展望

参考文献

附录

研究成果及发表的学术论文

致谢

作者与导师简介