一株利用棕榈油生产鼠李糖脂生物表面活性剂的铜绿假单胞菌及其应用

摘要

鼠李糖酯是一种无毒，无污染，能生物降解，具有良好的选择性和专一性阴离子表面活性剂，具有优秀的表面活性，在医药、食品、化妆品、环境保护等众多工业领域有独特的应用前景。本发明筛选到一株具有高鼠李糖脂产量和高转化率的铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）TIB-R02？CGMCC？No.9376。根据其发酵特点设计改造相关发酵设备，实现300L发酵罐的串联发酵实验。根据生产菌的生产状态及设备的特点开发了铜绿假单胞菌TIB-R02？CGMCC？No.9376发酵生产鼠李糖脂的生产工艺，在鼠李糖脂较高产量同时可以控制由于产生大量鼠李糖脂带来的表面活性产生的逃液问题。用该设备及发酵工艺在以75g/L棕榈油浓度为碳源时，鼠李糖脂产量达到60.6g/l，转化率达到80%以上。因此该菌株及生产工艺具有良好的工业应用前景。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及到一株生产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）TIB-R02CGMCCNo9376和该菌利用棕榈油发酵生产鼠李糖脂的方法。

背景技术

生物表面活性剂是一种与化学合成的表面活性剂相比除具有其优点外，还具有化学合成表面活性剂所不具备的无毒，能生物降解，无污染，具有良好的选择性和专一性，生物相容性好等优点，在医药、食品、化妆品、环境保护等众多工业领域有独特的应用前景。大力发展生物表面活性剂技术产业，将成功的带动石油、医药、洗涤用品等相关领域的全面发展，促进社会进步和经济发展，使我国拥有自主知识产权，提高国际竞争力。

鼠李糖酯是一种阴离子生物表面活性剂，它们不仅溶于甲醇、氯仿和乙醚，在碱性水溶液中也表现出良好的溶解特性。然而鼠李糖酯最突出的特性是它的表面活性，如能显著降低水的表面张力改变固体表面的润湿性，具有乳化、破乳、消泡、洗涤、分散与絮凝、抗静电和润滑等多种功能。鼠李糖酯不仅能乳化碳氢化合物，而且还能稳定其乳化体系。鼠李糖酯的另外一个重要特性是它的抗菌性。已经报道有好几种鼠李糖酯混合物具有抗菌和抗真菌的效果。因此深入的研究已鼠李糖酯为代表的表面活性剂，具有非常重要的应用价值。棕榈油毛油粗原料属于廉价碳源料，使用它作为发酵原料可以有效降低生产成本，开发棕榈油毛油的利用效率，可以为鼠李糖酯的大规模生产和广泛应用提供基础。

目前，鼠李糖脂主要是利用铜绿假单胞菌通过液态发酵的方法获得。由于鼠李糖脂是一种良好的生物表面活性剂具有优良的发泡、乳化等作用，所以在生产过程中随着不停地搅拌和通气发酵罐内会产生大量体积微小、结构致密的泡沫。传统的消泡方法如流加消泡剂、机械消泡及加压消泡等均无法达到消泡的作用，导致大量泡沫携带培养基从尾气管逃液造成培养基浪费及产物损失，同时增加了染菌的风险无法达到发酵生产的要求。因此如何改造发酵设备并结合传统消泡方法优化发酵工艺来控制发酵过程中逃液的发生，成为鼠李糖脂发酵生产的关键。

发明内容

本发明的目的是提供一株能够生产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌和发酵法生产鼠李糖脂的方法及应用。

本发明筛选得到一株生产鼠李糖脂的铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）TIB-R02已于2014年6月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），保藏号为CGMCCNo9376，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明具体提供了使用上述菌种以棕榈油为碳源进行发酵生产鼠李糖脂的方法。该方法包括发酵培养基，菌种培养，发酵生产工艺：

1.菌种培养：以上述铜绿假单胞菌为生产菌种，使用合适的培养基和培养条件，通过固体平板培养和摇瓶液体培养获得菌种。在发酵罐发酵中的种子使用30L发酵罐进行二级种子培养，在300L发酵中将种子直接打入发酵罐中。

固体平板培养基组成：10g/L葡萄糖,5g/L蛋白胨,1g/L酵母粉,0.5g/LNaCl，1.5g/L琼脂；摇瓶种子培养基组成：10g/L葡萄糖,5g/L蛋白胨,1g/L酵母粉,0.5g/LNaCl。

培养条件：温度30-37℃，转速100-250rpm，培养时间10-24h。

2.摇瓶发酵生产工艺：

发酵培养基组成：1.1g/LKCl;1.1g/LNaCl;0.00028g/LFeSO₄.7H₂O;3.4g/LKH₂PO₄;4.4g/LK₂HPO₄;0.5g/LMgSO₄.7H₂O;0.5g/L酵母粉；0.5-1.5g/LNaNO₃;5-20g/L棕榈油。无机盐培养基中加入适当微量元素包括：0.29g/LZnSO₄.7H₂O;0.24g/LCaCl₂.4H₂O;0.25g/LCuSO₄.5H₂O;0.17g/LMnSO₄.H₂O。

摇培养基碳氮源进行优化，获得分批摇瓶发酵培养基组成，优化后培养基碳源为：NaNO₃7.5g/L，碳源：棕榈油75g/L。

将1步培养的菌种以10%接种量接入优化后发酵培养基中培养192小时，鼠李糖脂产量可以达到57g/L，摇瓶发酵生产过程见附图1。

3.发酵罐发酵工艺：将1步培养菌种接入发酵罐，采用主从发酵罐串联进行发酵（发酵罐示意图见附图2），主罐进行发酵，主罐为300L发酵罐，发酵液体积150L，发酵温度为30℃，搅拌转速为200rpm，初始通气量为1v/v/m，接种量按体积比10%接种。在发酵过程中，根据主罐起泡情况，发酵罐压力，以及菌体生长情况控制通气量达到控制发酵过程逃液的情况（具体情况见实施例，参数控制见附图4）。从罐收集逃逸的泡沫并进行消泡工作，从罐不进行温度和pH控制，主罐逃逸过来的泡沫采用顶部进入，控制从罐压力，使泡沫破裂，起到消除泡沫的作用，将消泡后液体通过蠕动泵由从罐底部打回主罐进行发酵。发酵168h，鼠李糖脂产量60g/L以上，转化率80%以上，串联发酵生产过程见附图3。

4.利用该菌及发酵工艺生产鼠李糖脂有以下优点：

1）该菌种发酵产量高，转化率高，可以有效以棕榈油为碳源生产鼠李糖脂。

2）使用本发酵工艺，在300L发酵罐中可以在避免发酵起泡逃液的情况下达到较高鼠李糖脂发酵产量。

附图说明

附图1：摇瓶发酵鼠李糖脂产量及细胞干重图

附图2：主从串联发酵罐示意图

附图3：主从罐串联发酵生产鼠李糖脂产量及细胞干重图

附图4：主罐发酵过程关键参数示意图

具体实施

以下为列举的实施例，以便于更好地理解本发明。

实施例1铜绿假单胞菌TIBR02无机盐发酵培养基中硝酸铵浓度的优化：铜绿假单胞菌TIBR02分别接种于10%的棕榈油为碳源，硝酸钠浓度为5g/L、7.5g/L、10g/L、12.5g/L和15g/L的无机盐培养基中，该培养基其他成分为：1.1g/LKCl;1.1g/LNaCl;0.00028g/LFeSO4.7H2O;3.4g/LKH2PO4;4.4g/LK2HPO4;0.5g/LMgSO4.7H2O;0.5g/L酵母粉。无机盐培养基中加入适当微量元素包括：0.29g/LZnSO4.7H2O;0.24g/LCaCl2.4H2O;0.25g/LCuSO4.5H2O;0.17g/LMnSO4.H2O。发酵使用250ml摇瓶装液量为25ml，30度、200r/min的培养144小时，每24h取样检测鼠李糖脂产量、细胞干重及棕榈油剩余量。铜绿假单胞菌TIBR02在硝酸钠浓度为7.5g/L时产量最高、转化率最高，分别为鼠李糖脂最高产44.4g/L和60.02%，所以发酵过程中硝酸钠的浓度选择为7.5g/L。

实施例2铜绿假单胞菌TIBR02无机盐发酵培养基中棕榈油浓度的优化：

铜绿假单胞菌TIBR02分别接种于棕榈油浓度为75g/L、100g/L、125g/L和150g/L的无机盐培养基中，无机盐培养基成分为：7.5g/LNaNO3；1.1g/LKCl;1.1g/LNaCl;0.00028g/LFeSO4.7H2O;3.4g/LKH2PO4;4.4g/LK2HPO4;0.5g/LMgSO4.7H2O;0.5g/L酵母粉。无机盐培养基中加入适当微量元素包括：0.29g/LZnSO4.7H2O;0.24g/LCaCl2.4H2O;0.25g/LCuSO4.5H2O;0.17g/LMnSO4.H2O。发酵使用250ml摇瓶装液量为25ml，30度、200r/min的培养196小时，每24h取样检测鼠李糖脂产量、细胞干重及棕榈油剩余量。铜绿假单胞菌TIBR02在棕榈油浓度为75g/L时转化率最高，约为76.9%。所以发酵过程中棕榈油的浓度选择为75g/L。

实施例3在最适C/N条件下以棕榈油为碳源利用铜绿假单胞菌TIBR02进行摇瓶发酵：铜绿假单胞菌TIBR02，10%的接种量接种于棕榈油浓度为75g/L、硝酸钠7.5g/L的无机盐培养基该培养基其他成分为1.1g/LKCl;1.1g/LNaCl;0.00028g/LFeSO4.7H2O;3.4g/LKH2PO4;4.4g/LK2HPO4;0.5g/LMgSO4.7H2O;0.5g/L酵母粉。无机盐培养基中加入适当微量元素包括：0.29g/LZnSO4.7H2O;0.24g/LCaCl2.4H2O;0.25g/LCuSO4.5H2O;0.17g/LMnSO4.H2O。发酵使用250ml摇瓶装液量为25ml，30度、200r/min的培养216小时，每24h取样检测鼠李糖脂产量、细胞干重及棕榈油剩余量。在192小时达到最高产量为57.73g/L，转化率约77%。

实施例4在最适C/N条件下以棕榈油为碳源利用铜绿假单胞菌TIBR02进行300L发酵罐的串联发酵：采用二级种子罐各培养12小时，以10%的接种量将铜绿假单胞菌TIBR02接种于碳源为75g/L棕榈油的无机盐培养基中，接种OD（600）=6.25，无机盐培养基成分为：7.5g/LNaNO3；1.1g/LKCl;1.1g/LNaCl;0.00028g/LFeSO4.7H2O;3.4g/LKH2PO4;4.4g/LK2HPO4;0.5g/LMgSO4.7H2O;0.5g/L酵母粉。无机盐培养基中加入适当微量元素包括：0.29g/LZnSO4.7H2O;0.24g/LCaCl2.4H2O;0.25g/LCuSO4.5H2O;0.17g/LMnSO4.H2O。使用300L发酵罐装液量为150L及300L储罐，起始发酵条件为温度=30度、通风=150L/min，转速=200rpm，溶氧=100%，ph=6.64，罐压p=0.05，发酵192h，每24取样测细胞干重（DCW）、鼠李糖脂浓度及棕榈油剩余量。

为了克服发酵生产过程中起泡逃液的问题，我们采用自行设计的主从式发酵罐进行发酵并通过调节发酵生产过程中的通气量、溶氧（DO）与罐压等参数解决了鼠李糖脂生产过程中起泡逃液的问题。下面我们以溶氧为主要线索，将整个发酵调控工艺分为3个阶段：①高溶氧阶段；②中度溶氧阶段；③低溶氧阶段，进行概述。

高溶氧阶段：时间：0-15h溶氧：60%以上通风：150L/min转速：200rpm罐压：0.05kpa目的：铜绿假单胞菌是转性好氧性细菌，发酵前期需要大量通气来保证氧气供应。另一方面，发酵前期鼠李糖脂含量较少，高通气量也不会导致大量起泡。

中度溶氧阶段：此阶段是鼠李糖脂大量产生的阶段并伴有大量泡沫产生，发酵罐中的泡沫会通过尾气管进入储罐液化，需要不定时根据储罐中的泡沫液化后的重量将液体重新泵回发酵罐进行再次发酵。主要分为下面a、b、c三个阶段：

a：前期

时间：15h-30h

溶氧：60%-50%

通风：50L/min-30L/min

转速：200rpm

罐压：0.05kpa

目的：由于鼠李糖脂的生成导致发酵罐中有大量泡沫产生，需要降低通气量防止发酵罐逃液。同时菌体还处于快速生长期需要消耗大量氧气，所以维持溶氧在70%以上保证菌体的氧气供应。

b：中期

时间：30h-100h

溶氧：50%-35%

通风：30L/min-10L/min

转速：250rpm

罐压：0.05kpa

目的：鼠李糖脂的大量生成导致发酵罐产生大量泡沫，需要降低通气量防止储罐逃液（发酵罐已经逃液）。同时维持相对较高的溶氧量，保证鼠李糖脂的快速合成。

c：后期

时间：100h-120h

溶氧：30%-20%

通风：10L/min

转速：250rpm

罐压：0.08kpa

目的：此阶段发酵罐逃液严重，不宜再调高转速；同时为了维持溶氧，通风不宜再调低。此时，可通过调高罐压加速泡沫破裂，达到消泡的目的。

低溶氧阶段

时间：120h-192h

溶氧：15%以下

通风：5L/min

转速：250rpm

罐压：0.09kpa

目的：此阶段细胞基本停止生长（144小时后）鼠李糖脂的合成基本完成，发酵罐逃液严重必须再次降低通风量、并调高罐压阻止储罐逃液。此时发酵罐中氧气供应非常低，这种低溶氧率加速菌体死亡使细胞内大量积累的鼠李糖脂快速的释放到细胞外，缩短了发酵时间。通过168h发酵鼠李糖脂达到最高产量60.6g/l，转化率达到80%以上。