一株脂肽生物表面活性剂产生菌筛选及其脂肽性质研究

摘要

本课题研究了生物表面活性剂产生菌的筛选，生物表面活性剂的理化性质及小鼠毒性，相关研究如下： (1)研究了合肥工业大学学生食堂馨园餐厅及工大怡园餐厅下水道附近的污水及土壤、合肥市石油库附近长期受油污染土壤、山东东营胜利油田被石油长期污染的油土样和油水样共11个样品，经富集培养、血平板、油平板等步骤，从中分离筛选出一株产脂肽的生物表面活性剂菌株H-02，其排油活性较好，排油圈直径达到9.2 cm。对菌株H-02进行了形态、生理生化和16S rDNA序列分析鉴定，得出菌株H-02是枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis H-02)。其所产脂肽具有较好的乳化性能，能使乳化液保持稳定至少10 d以上。 (2)通过单因素实验和正交实验研究了各种营养物质和环境因素对菌株H-02发酵生产脂肽表面活性剂的影响。研究并确定了优化的培养基组成为(g/100mL):可溶性淀粉2.5，硝酸铵0.6，硫酸镁0.04，氯化钙0.008，酵母粉0.08，磷酸二氢钾0.24，磷酸氢二钠0.96，初始pH7.0-7.5；培养条件为：500 mL三角瓶的装液量为150 mL，接种量5.0％，培养温度35℃。在上述条件下，脂肽产量达到了3.18 g/L以上。 (3)对菌株H-02所产脂肽的理化性质研究表明，枯草芽孢杆菌H-02所产的生物表面活性剂是一种脂肽类生物表面活性剂，具有很好的表面活性和独特的理化性质。所产的脂肽具有良好的乳化活性和发泡性能，另外还具有抗菌活性。因此，它的应用领域非常广，除可以应用于石油开采外，特别适合于食品工业、医药等领域。脂肽可耐受高温和高浓度盐，尤其是高钙离子，pH适应范围广，pH适应范围为4-10，是一种具有应用潜力的生物表面活性剂。 (4)对菌株H-02发酵液的安全性进行了小鼠经口急性毒性和30 d喂养试验，实验结果表明该脂肽对小鼠无明显毒性。

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致谢

第一章绪论

1.1生物表面活性剂产生菌的分离筛选方法

1.1.1表面张力筛选法

1.1.2界面张力筛选法

1.1.3血平板筛选法

1.1.4原油平板筛选法

1.1.5液滴坍塌筛选法（Drop-collapse method）

1.1.6傅立叶变换红外光谱筛选法(Fourier Transform Infrared Spectroscopy)

1.2生物表面活性剂的分类及其微生物来源

1.2.1糖脂类

1.2.2脂肽和脂蛋白

1.2.3脂肪酸、磷脂和中性脂

1.2.4高分子生物表面活性剂

1.2.5微粒生物表面活性剂

1.3生物表面活性剂的应用研究

1.3.1石油开采业(microbial enhanced oile recovery,MEOR)

1.3.2环境生物修复技术

1.3.3食品工业

1.3.4医疗和化妆品工业

1.3.5生物表面活性剂在农业中的应用

1.3.6生物表面活性剂在其它方面的应用

1.4影响生物表面活性剂生产的因素

1.4.1碳源

1.4.2氮源

1.4.3环境因素

1.5生物表面活性剂的提取方法

1.5.1萃取

1.5.2超滤

1.5.3泡沫分离

1.6研究目的与意义

第二章生物表面活性剂产生菌的筛选及鉴定

2.1引言

2.2材料

2.2.1土壤来源

2.2.2培养基

2.2.3试剂

2.2.4仪器

2.3方法

2.3.1菌株培养与筛选

2.3.2生物表面活性剂表面活性测定方法

2.3.3菌株鉴定

2.4结果与分析

2.4.1筛选结果

2.4.2表面活性剂TLC分析

2.4.3生物表面活性剂的乳化能力

2.4.4菌株H-02鉴定结果

2.5小结

第三章菌株H-02产脂肽生物表面活性剂条件优化

3.1引言

3.2材料

3.2.1菌株

3.2.2培养基

3.2.3试剂、药品与仪器

3.3方法

3.3.1培养方法

3.3.2测定方法

3.3.3实验设计

3.4结果与分析

3.4.1碳源

3.4.2氮源

3.4.3磷源

3.4.4种龄及接种量的影响

3.4.5温度、溶解氧和pH的影响

3.4.6培养基中其它成分的调整

3.5小结

第四章表面活性剂理化性质研究

4.1前言

4.2材料

4.2.1菌株

4.2.2培养基

4.2.3试剂、药品与仪器

4.3方法

4.3.1培养方法

4.3.2测定方法

4.4结果与分析

4.4.1脂肽生物表面活性剂的提取纯化

4.4.2脂肽生物表面活性剂的乳化活性测定

4.4.3脂肽生物表面活性剂热稳定性的测定

4.4.4 pH值对脂肽生物表面活性剂活性的影响

4.4.5 NaC1浓度对脂肽表面活性剂的影响

4.4.6 CaC12对脂肽生物表面活性剂的影响

4.4.7脂肽生物表面活性剂的抗菌活性

4.4.8脂肽与Tween80乳化性能的比较

4.4.9菌株H-02发酵液的发泡性能

4.5 小结

第五章脂肽生物表面活性剂小鼠毒性实验

5.1引言

5.2材料

5.2.1菌株

5.2.2培养基

5.2.3试剂、药品与仪器

5.2.4实验动物

5.2.5饲料

5.3方法

5.3.1培养方法

5.3.2动物实验

5.4结果与分析

5.4.1脂肽的小鼠经口急性毒性

5.4.2脂肽对体重及饲料利用率的影响

5.4.3病理学观察

5.5小结

第六章结论与展望

6.1结论

6.2创新点

6.3研究展望

参考文献

攻读硕士期间发表的论文