基于衰减全反射傅里叶变换红外光谱技术的糙米中黄曲霉毒素含量的快速检测方法

摘要

本发明提供一种基于衰减全反射傅里叶变换红外光谱技术的糙米中黄曲霉毒素含量的快速检测方法，包括以下步骤：样品准备，收集不同黄曲霉侵染程度的糙米样品，将糙米样品粉碎得到样品粉末，并冷藏待测；光谱检测，采用傅里叶变换近红外光谱仪扫描样品的光谱信息，并取部分过筛样品，测定糙米样品粉末中黄曲霉毒素B

说明书

技术领域

本发明涉及谷物品质检测技术领域，具体而言涉及一种基于衰减全反射傅 里叶变换红外光谱技术的糙米中黄曲霉毒素含量的快速检测方法。

背景技术

随着科学的发展，糙米的营养价值越来越受到人们的重视。美国食品与药 物管理局经过对糙米的胚与米糠进行分析，发现10g糙米中含蛋白质3g，植物 性脂肪1.2g，B族维生素2.5g。而且，糙米中的维生素B₁、B₂、E、C、D，钙、 铁及纤维素皆高于精米。此外，糙米中具有丰富的营养保健功能因子，而精米 中不含或含量低，例如，糙米中具有抗氧化活性的谷胱甘肽约为3.64mg/100g， 且含有存在阿魏酸集团的γ-谷维醇、γ-氨基丁酸(约3.8mg/100g)、米糠脂多糖、 米糠纤维等。

然而，我国属于亚热带气候，适宜的温度及湿度条件利于霉菌的生长及毒 素的产生，且一些地方的粮食仓储设施不够完善，导致我国粮食作物，例如糙 米受霉菌毒素污染的问题较为普遍。目前，黄曲霉毒素(AFT)、赭曲霉毒素及 脱氧雪腐镰刀菌烯醇等对人畜健康造成较大危害，其中，AFT被世界卫生组织 (WHO)癌症研究机构划定为一类天然存在的致癌物。常见的AFT主要包括 AFB₁、AFB₂、AFG₁、AFG₂和AFM₁等。国际法典委员会(CAC)明确规定食 品中AFT(B₁、B₂、G₁和G₂)不能高于15μg/kg。其中，AFB₁的毒性最具代表， 其毒性是氰化钾的10倍。

目前AFT检测方法主要包括薄层色谱法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)、 酶联免疫法及微柱法等。然而，TLC具有样品前处理繁琐、灵敏度低、重现性 差及安全性低等不足；HPLC具有准确性好、灵敏度高及检测限低的优点，但样 品前处理复杂，所需化学试剂种类繁多，且需专业技术人员，难以满足快速、 在线的检测要求；酶联免疫法对适用酶和抗体的保存条件、时间有一定要求， 且易出现假阳性结果；微柱法不能完成整个黄曲霉毒素的检测过程，仅适用于 定性检验。因此，亟需寻找一种制样简单、快速、准确度高及对环境无污染的 谷物中AFT的快速检测方法。

红外光谱技术是分析化合物的重要手段，然而常规透射法对难溶、难粉碎 等样品的检测存在困难，衰减全反射附件(ATR)的应用使微区成分的分析变得 方便而快捷，检测灵敏度达10^-9g。衰减全反射傅里叶变换红外光谱(ATR-FTIR) 分析技术具有制样简单、测量区域小、检测灵敏度高及对环境无污染等优势， 在食品药品、环境、生命科学与轻工业等领域已得到广泛应用。因此，利用 ATR-FTIR分析技术，建立糙米黄曲霉毒素含量水平的快速检测方法体系，对于 确保粮食质量安全与人畜健康具有重要的意义。

发明内容

本发明目的在于提供一种基于衰减全反射傅里叶变换红外光谱技术的糙米 中黄曲霉毒素含量的快速检测方法，旨在基于ATR-FTIR技术实现同时对糙米中 黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂及其总量的定量检测，提高检测的时效性、准确度， 简化操作复杂性，减小样品损耗量。

本发明的上述目的通过独立权利要求的技术特征实现，从属权利要求以另 选或有利的方式发展独立权利要求的技术特征。

为达成上述目的，本发明提出一种基于衰减全反射傅里叶变换红外光谱技 术的糙米中黄曲霉毒素含量的快速检测方法，包括以下步骤：

步骤1、样品准备，收集不同黄曲霉侵染程度的糙米样品，将糙米样品粉碎 得到样品粉末，并在-18℃环境下冷藏，待测；

步骤2、光谱检测，对于样品粉末，采用傅里叶变换近红外光谱仪扫描样品 的光谱信息，并取部分过筛样品，采用多功能柱净化-高效液相色谱-荧光法测定 糙米样品粉末中黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂及其总量的水平；

步骤3、数据预处理，对前述步骤得到的样品粉末的原始光谱信息进行预处 理，消除干扰；

步骤4、定量预测分析，基于偏最小二乘回归分析方法(PLSR)，依据糙米 样品中黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂及其总量的水平与其相应光谱吸收值的对应 关系，建立糙米样品中黄曲霉毒素真实含量水平与预测水平的相关关系模型；

步骤5、快速测定，利用前述建立的模型，基于待测的糙米的光谱信息而输 出其黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂及其总量水平。

进一步的例子中，前述步骤1中，糙米样品的粉碎过程包括：

将每份糙米颗粒样品粉碎，时间至少为10s，过40目筛，如此以保证样品 的均一性。

进一步的例子中，前述步骤2中，利用Bruker傅里叶变换红外光谱仪采集 糙米粉末样品的光谱信息，具体包括：

将Bruker傅里叶变换红外光谱仪预热30min，取1g糙米粉末样品，置于 Pike公司衰减全反射ATR附件的ZnSe晶体上进行光谱检测，每份样品检测前 先测定背景即空气的光谱；采用漫反射吸收模式，光谱扫描范围为4000～600 cm^-1，分辨率为4cm^-1，扫描次数为64次，重复扫描3次，采用OMNIC软件对 3次扫描所得光谱作平均处理，取平均光谱进行分析。

进一步的例子中，前述步骤3的数据预处理，其具体实现包括：

采用多元散射校正方法(MSC)对糙米样品粉末的原始平均光谱进行预处 理，即、将光谱中的散射光信号与化学吸收信息进行分离；然后，通过Dixon检 验，在95％的置信水平下，自动计算出各样本光谱的马氏距离，去除个别异常 样本，去除样本数量需低于总建模样本量的5％。

进一步的例子中，前述步骤3中采用多元散射校正方法(MSC)对糙米样 品原始平均光谱进行预处理，即通过数学方法将光谱中的散射光信号与化学吸 收信息进行分离，并假设散射系数在所有波长处都是一样的，具体步骤如下：

1)计算所有样品光谱的平均值：

$\bar{A}=\frac{{\Sigma }_{i=1}^n{A}_i}{n};$

2)对平均光谱作一元线性回归分析：

$A_i=m_i\bar{A}+b_i;$

3)对每一条光谱做多元散射校正：

式中：A表示n×p维定标光谱数据矩阵，n为定标样品数，p为光谱采集所 用的波长点数；

A_i表示1×p维矩阵，表示单个糙米样品光谱矢量；

表示所有糙米样品的原始近红外光谱在各个波长点处求平均值所得到 的平均光谱矢量；

m_i和b_i分别表示各糙米样品近红外光谱A_i与平均光谱A进行一元线性回 归后得到的相对偏移系数和平移量。

进一步的例子中，前述步骤4中，糙米样品中黄曲霉毒素真实含量水平与 预测水平的相关关系模型的建立过程包括：

步骤4-1、选取建模集和预测集样本，在模型构建前，利用Kennard-Stone(KS) 算法对样本的建模集与验证集进行挑选，即通过计算自变量x，即光谱之间的欧 式距离，将光谱差异大的样本选入建模集，剩余距离较小样本归为验证集，KS 中样本差异性是通过比较两个样本p,q之间光谱的欧氏距离来确定的，即

$d_x(p,q)=\sqrt{{\Sigma }_{j=1}^J{[x_p\left(j\right)-x_q\left(j\right)]}^2};p,q\in [1,N]$

x_p(j)和x_q(j)是样本p和q在第j个波数的吸光度值，J代表光谱波数数目；

采用KS选取2/3份样品的光谱信息用于模型构建，剩余1/3份样品作为预 测集样本，验证模型可靠性；

步骤4-2、对糙米样品中黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂及其总量的水平进行 预测时，需先采集样本的特征光谱并进行相同的分解，获得光谱的得分，将光 谱的得分带入下面公式，计算出样品中黄曲霉毒素的浓度值：

y＝tB

上式中：y为某个待测样本黄曲霉毒素的预测浓度值，t为某个待测样本光谱分 解的得分，B为回归系数矩阵；

步骤4-3、其次，依据建模结果的最大相对分析误差RPD对模型的实用性 进行判定：

$RPD=\frac{SD}{RMSEP}$

RPD值越大，表明模型稳健性越好，RPD≥2.5，表明此模型可用于定量分 析目的；否则，需进行多次重复试验，以降低偶然或系统误差对试验的影响， 直到满足前述条件RPD≥2.5。

步骤4-4、将样品中黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂及其总量的实际检测水平 作为自变量x，将经PLSR方法得到的黄曲霉毒素的预测含量水平作为因变量y， 建立一元线性回归方程，如下：

y＝ax+b

式中：a为方程斜率，b为方程截距。

应当理解，前述构思以及在下面更加详细地描述的额外构思的所有组合只 要在这样的构思不相互矛盾的情况下都可以被视为本公开的发明主题的一部 分。另外，所要求保护的主题的所有组合都被视为本公开的发明主题的一部分。

结合附图从下面的描述中可以更加全面地理解本发明教导的前述和其他方 面、实施例和特征。本发明的其他附加方面例如示例性实施方式的特征和/或有 益效果将在下面的描述中显见，或通过根据本发明教导的具体实施方式的实践 中得知。

附图说明

附图不意在按比例绘制。在附图中，在各个图中示出的每个相同或近似相 同的组成部分可以用相同的标号表示。为了清晰起见，在每个图中，并非每个 组成部分均被标记。现在，将通过例子并参考附图来描述本发明的各个方面的 实施例，其中：

图1是说明根据本发明某些实施例的基于衰减全反射傅里叶变换红外光谱 技术的糙米中黄曲霉毒素含量的快速检测方法的实现流程图。

图2是黄曲霉毒素B₁真实值与预测值的相关性图谱。

图3为黄曲霉毒素B₂真实值与预测值的相关性图谱。

图4为黄曲霉毒素G₁真实值与预测值的相关性图谱。

图5为黄曲霉毒素G₂真实值与预测值的相关性图谱。

图6为黄曲霉毒素总量真实值与预测值的相关性图谱。

表1为黄曲霉毒素B₁定量分析验证集结果。

表2为黄曲霉毒素B₂定量分析验证集结果。

表3为黄曲霉毒素G₁定量分析验证集结果。

表4为黄曲霉毒素G₂定量分析验证集结果。

表5为黄曲霉毒素总量水平的分析验证集结果。

具体实施方式

为了更了解本发明的技术内容，特举具体实施例并配合所附图式说明如下。

在本公开中参照附图来描述本发明的各方面，附图中示出了许多说明的实 施例。本公开的实施例不必定意在包括本发明的所有方面。应当理解，上面介 绍的多种构思和实施例，以及下面更加详细地描述的那些构思和实施方式可以 以很多方式中任意一种来实施，这是因为本发明所公开的构思和实施例并不限 于任何实施方式。另外，本发明公开的一些方面可以单独使用，或者与本发明 公开的其他方面的任何适当组合来使用。

结合图1所示的本发明某些实施例的基于衰减全反射傅里叶变换红外光谱 技术的糙米中黄曲霉毒素含量的快速检测方法的流程，根据本发明的实施例， 一种基于衰减全反射傅里叶变换红外光谱技术的糙米中黄曲霉毒素含量的快速 检测方法，包括以下步骤：步骤1、样品准备，收集不同黄曲霉侵染程度的糙米 样品，将糙米样品粉碎得到样品粉末，并在-18℃环境下冷藏，待测；步骤2、 光谱检测，对于样品粉末，采用傅里叶变换近红外光谱仪扫描样品的光谱信息， 并取部分过筛样品，采用多功能柱净化-高效液相色谱-荧光法测定糙米样品粉末 中黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂及其总量的水平；步骤3、数据预处理，对前述 步骤得到的样品粉末的原始光谱信息进行预处理，消除干扰；步骤4、定量预测 分析，基于偏最小二乘回归分析方法(PLSR)，依据糙米样品中黄曲霉毒素B₁、 B₂、G₁、G₂及其总量的水平与其相应光谱吸收值的对应关系，建立糙米样品中 黄曲霉毒素真实含量水平与预测水平的相关关系模型；步骤5、快速测定，利用 前述建立的模型，基于待测的糙米的光谱信息而输出其黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、 G₂及其总量水平。

在一些例子中，前述步骤1中，糙米样品的粉碎过程包括：

将每份糙米颗粒样品粉碎，时间至少为10s，过40目筛，如此以保证样品 的均一性。

在一些例子中，前述步骤2中，利用Bruker傅里叶变换红外光谱仪采集糙 米粉末样品的光谱信息，具体包括：

将Bruker傅里叶变换红外光谱仪预热30min，取1g糙米粉末样品，置于 Pike公司ATR附件的ZnSe晶体上进行光谱检测，ATR附件基于光内反射原理 设计，它以光辐射两种介质的界面发生全内反射为基础，由于ZnSe晶体的折射 率n₁(>1.5)大于糙米样品的折射率n₂，且入射角θ大于临界角θ_c(sinθ_c＝n₂/n₁)， 因此会发生全反射。每份样品检测前先测定背景即空气的光谱；采用漫反射吸 收模式，光谱扫描范围为4000～600cm^-1，分辨率为4cm^-1，扫描次数为64次， 重复扫描3次，采用OMNIC软件对3次扫描所得光谱作平均处理，取平均光谱 进行分析。

在一些例子中，前述步骤3的数据预处理，其具体实现包括：

采用多元散射校正方法(MSC)对糙米样品粉末的原始平均光谱进行预处 理，即、将光谱中的散射光信号与化学吸收信息进行分离；然后，通过Dixon检 验，在95％的置信水平下，自动计算出各样本光谱的马氏距离，去除个别异常 样本，去除样本数量需低于总建模样本量的5％。

在一些例子中，前述步骤3中采用多元散射校正方法(MSC)对糙米样品 原始平均光谱进行预处理，即通过数学方法将光谱中的散射光信号与化学吸收 信息进行分离，并假设散射系数在所有波长处都是一样的，具体步骤如下：

1)计算所有样品光谱的平均值：

$\bar{A}=\frac{{\Sigma }_{i=1}^n{A}_i}{n};$

2)对平均光谱作一元线性回归分析：

$A_i=m_i\bar{A}+b_i;$

3)对每一条光谱做多元散射校正：

式中：A表示n×p维定标光谱数据矩阵，n为定标样品数，p为光谱采集所 用的波长点数；

A_i表示1×p维矩阵，表示单个糙米样品光谱矢量；

表示所有糙米样品的原始近红外光谱在各个波长点处求平均值所得到 的平均光谱矢量；

m_i和b_i分别表示各糙米样品近红外光谱A_i与平均光谱A进行一元线性回 归后得到的相对偏移系数和平移量。

多元散射校正可以去除近红外漫反射光谱中样品的镜面反射及不均匀性 造成的噪声，消除漫反射光谱的基线及光谱的不重复性，主要是来消除颗粒分 布不均匀及颗粒大小产生的散射影响；然后，通过Dixon检验，在95％的置信 水平下，自动计算出各样本光谱的马氏距离，去除个别异常样本，可显著改善 模型性能，去除样本数量需低于总建模样本量的5％。

在一些例子中，前述步骤4中，糙米样品中黄曲霉毒素真实含量水平与预 测水平的相关关系模型的建立过程包括：

步骤4-1、选取建模集和预测集样本，在模型构建前，利用Kennard-Stone(KS) 算法对样本的建模集与验证集进行挑选，即通过计算自变量x，即光谱之间的欧 式距离，将光谱差异大的样本选入建模集，剩余距离较小样本归为验证集，KS 中样本差异性是通过比较两个样本p,q之间光谱的欧氏距离来确定的，即

$d_x(p,q)=\sqrt{{\Sigma }_{j=1}^J{[x_p\left(j\right)-x_q\left(j\right)]}^2};p,q\in [1,N]$

x_p(j)和x_q(j)是样本p和q在第j个波数的吸光度值，J代表光谱波数数目；

采用KS选取2/3份样品的光谱信息用于模型构建，剩余1/3份样品作为预 测集样本，验证模型可靠性；

步骤4-2、对糙米样品中黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂及其总量的水平进行 预测时，需先采集样本的特征光谱并进行相同的分解，获得光谱的得分，将光 谱的得分带入下面公式，计算出样品中黄曲霉毒素的浓度值：

y＝tB

上式中：y为某个待测样本黄曲霉毒素的预测浓度值，t为某个待测样本光谱分 解的得分，B为回归系数矩阵；

步骤4-3、依据建模结果的最大相对分析误差RPD对模型的实用性进行判 定：

$RPD=\frac{SD}{RMSEP}$

RPD值越大，表明模型稳健性越好，RPD≥2.5，表明此模型可用于定量分 析目的；否则，需进行多次重复试验，以降低偶然或系统误差对试验的影响， 直到满足前述RPD≥2.5的条件。

步骤4-4、将样品中黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂及其总量的实际检测水平 作为自变量x，将经PLSR方法得到的黄曲霉毒素的预测含量水平作为因变量y， 建立一元线性回归方程，如下：

y＝ax+b

式中：a为方程斜率，b为方程截距。

下面结合一些示例性的例子，以及图2-图6，对前述方法加以更具体的说明。

一、样品准备。选取132份不同黄曲霉侵染程度的糙米样品，去除杂物。 光谱采集前需先测定糙米样品的初始水分(GBT21305-2007谷物及谷物制品水 分的测定常规法)，自然晾晒至样品水分含量较为相近(湿基：11％～14％)，降 低水分差异对结果造成的较大干扰。分别将样品粉碎(粉碎时间t>10s)，过40 目筛，避光，-18℃冷藏；

二、样品测定。室温(25℃)下开启计算机和Bruker傅里叶变换红外光谱 仪，预热30min，取1g糙米粉末样品，置于Pike公司ATR附件的ZnSe晶体上， ATR附件基于光内反射原理设计，它以光辐射两种介质的界面发生全内反射为 基础，由于ZnSe晶体的折射率n₁(>1.5)大于糙米样品的折射率n₂，且入射角 θ大于临界角θ_c(sinθ_c＝n₂/n₁)，因此会发生全反射。每份样品检测前先测定背 景(空气)光谱；采用吸收模式，光谱扫描范围为4000～600cm^-1，分辨率为4 cm^-1，扫描次数为64次，重复扫描3次，采用OMNIC软件对3次扫描所得光 谱作平均处理，取平均光谱进行分析。取部分过筛样品，采用多功能柱净化-高 效液相色谱-荧光法测定糙米中黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂及其总量的水平；

三、数据预处理。基于TQanalyst6.0软件，首先，采用多元散射校正方法 (MSC)对糙米样品原始平均光谱进行预处理，即通过数学方法将光谱中的散 射光信号与化学吸收信息进行分离，并假设散射系数在所有波长处都是一样的。 具体步骤如下：

1.计算所有样品光谱的平均值：

$\bar{A}=\frac{{\Sigma }_{i=1}^n{A}_i}{n}$

2.对平均光谱作一元线性回归分析：

$A_i=m_i\bar{A}+b_i$

3.对每一条光谱做多元散射校正：

式中：A表示n×p维定标光谱数据矩阵，n为定标样品数，p为光谱采集所用的 波长点数；

A_i表示1×p维矩阵，表示单个糙米样品光谱矢量；

表示所有糙米样品的原始近红外光谱在各个波长点处求平均值所得到 的平均光谱矢量；

m_i和b_i分别表示各糙米样品近红外光谱A_i与平均光谱A进行一元线性回 归后得到的相对偏移系数和平移量。

四、定量预测分析。

采用TQAnalyst6.0软件，具体步骤如下：

1.首先，选取建模集和预测集样本。在光谱分析中，模型构建前，需对样本的 建模集与验证集进行挑选，Kennard-Stone(KS)算法常用于划分建模集及验证集 样本数，可用于偏最小二乘、支持向量机等建模集和验证集的划分，即通过计 算自变量x，即光谱之间的欧式距离，将光谱差异大的样本选入建模集，剩余距 离较小样本归为验证集，减少了相似样本被选入建模集。KS算法中样本差异性 是通过比较两个样本p,q之间光谱(X向量)的欧氏距离来确定的，即

$d_x(p,q)=\sqrt{{\Sigma }_{j=1}^J[x_p\left(j\right)-x_q{\left(j\right)}^2};p,q\in [1,N]$

x_p(j)和x_q(j)是样本p和q在第j个波数的吸光度值，J代表光谱波数数目。

采用KS算法，选取2/3份样品的光谱信息用于模型构建，剩余1/3份样品 作为预测集样本，验证模型可靠性。

2.其次，基于偏最小二乘回归分析方法(PLSR)，依据糙米样品中黄曲霉毒素 B₁、B₂、G₁、G₂及其总量的水平与其相应光谱吸收值的对应关系，建立糙米样 品中黄曲霉毒素真实含量水平与预测水平的相关关系模型。

偏最小二乘回归分析方法的基本原理如下：

X＝TP+E

Y＝UQ+F

U＝TB

矩阵B的最小二乘解为：

B＝(T^TT)^-1T^TY

式中，X为光谱矩阵，Y为浓度矩阵，T、U分别为X和Y矩阵的得分矩阵，P 和Q为X和Y矩阵的载荷矩阵，E和F分别为X和Y矩阵的残差矩阵，B为回 归系数矩阵。

PLSR作为化学计量学中比较经典的分析方法，具有可以实现回归模型、数 据结构化及两组变量之间的相关性分析的作用，能用少量的PLSR因子数来预测 未知样品的含量，可以解决许多普通多元回归方法无法解决的问题。

具体步骤如下：

对糙米样品中黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂及其总量的水平进行预测时，需 先采集样本的特征光谱并进行相同的分解，获得光谱的得分，将光谱的得分带 入下面公式，计算出样品中黄曲霉毒素的浓度值。

y＝tB

上式中：y为某个待测样本黄曲霉毒素的预测浓度值，t为某个待测样本光谱分 解的得分，B为回归系数矩阵。

其次，依据建模结果的最大相对分析误差RPD对模型的实用性进行判定：

$RPD=\frac{SD}{RMSEP}$

RPD值越大，表明模型稳健性越好，RPD≥2.5，表明此模型可用于定量分 析目的；否则，需进行多次重复试验，以降低偶然或系统误差对试验的影响。

最后，将样品中黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂及其总量的实际检测水平作为 自变量x，将经PLSR方法得到的黄曲霉毒素的预测含量水平作为因变量y，建 立一元线性回归方程，如下：

y＝ax+b

式中：a为方程斜率，b为方程截距。

黄曲霉毒素B₁、B₂、G₁、G₂及其总量的实际检测值与光谱预测值的关系如 图2、3、4、5、6，其模型验证集结果见表1、2、3、4、5。

虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然其并非用以限定本发明。本发明 所属技术领域中具有通常知识者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可作各 种的更动与润饰。因此，本发明的保护范围当视权利要求书所界定者为准。