一种来源于寄生疫霉的ω-3脱饱和酶、含所述脱饱和酶的载体、重组微生物及其应用

摘要

本发明涉及如SEQ？ID？NO.3的编码寄生疫霉ω-3脱饱和酶的重组核酸序列、含所述ω-3脱饱和酶的载体、含有所述载体的重组微生物特别是重组酿酒酵母菌，还涉及重组酿酒酵母菌的构建方法，以及所述含有所述脱饱和酶的酿酒酵母在多不饱和脂肪酸生物合成中的用途，其在常温下能够将C20:4Δ5,8,11,14催化为C20:5Δ5,8,11,14,17，催化效率达到65％。

说明书

【技术领域】

本发明属于生物工程技术领域，涉及利用微生物合成多不饱和脂肪酸，具体涉及一种用于合成多不饱和脂肪酸的ω-3脱饱和酶、含所述ω-3脱饱和酶的载体、含有所述载体的重组微生物及其应用。

【背景技术】

长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFAs)是指含有20个或20个以上碳原子的多不饱和脂肪酸，按照第一个双键距离C端的位置可以分为ω-6和ω-3两类。ω-3LC-PUFAs在人体内无法自行合成，需要从饮食中获取，属于必需脂肪酸，如EPA和DHA。研究发现，以EPA和DHA为代表的ω-3LC-PUFAs可以作为合成某些激素的前体物质，具有多重生理功能和潜在的药用价值。迄今为止，ω-3LC-PUFAs的来源以深海鱼类为主，然而从中提取的LC-PUFAs却存在稳定性差、纯化工艺复杂、易氧化等缺点。近年来，微生物作为一种新的LC-PUFAs来源正受到越来越广泛的关注：海洋藻类通过自养、异养和混合营养的方式生长，生长周期短，是EPA和DHA的初级生产者，也是ω-3LC-PUFAs最有潜力的来源之一；酵母菌、霉菌等研究成本低、适合大规模生产且遗传背景明细，拥有生产多种LC-PUFAs的潜力。随着分子生物学和生物技术的飞速发展，人们将越来越多的目光投向了产油真菌，以期通过基因工程改造菌体脂肪酸合成路径来生产EPA、DHA，但由于效率低下等原因，至今仍未实现商业化。

自然界中ω-3LC-PUFAs通常由LA和ALA起始合成，经过一系列去饱和酶和延长酶催化，最终形成EPA和DHA。其中，ω-3脱饱和酶是ω-3LC-PUFAs合成过程中的关键酶之一，具有三个富含组氨酸的结构域，能将ω-6多不饱和脂肪酸如LA(C18:2)、GLA(C18:3)、DGLA(C20:3)和ARA(C20:4)分别催化生成对应的ω-3多不饱和脂肪酸ALA(C18:3)、SDA(C18:4)、ETA(C20:4)和EPA(C20:5)。

研究发现，不同来源的ω-3脱饱和酶对不同碳链长度的脂肪酸具有不同的催化效率。目前，已知的来源于藻类和植物的ω-3脱饱和酶只能催化18C的ω-6多不饱和脂肪酸如LA和GLA。而来源于秀丽隐杆线虫的ω-3脱饱和酶FAT1则能同时以18C和20C的多不饱和脂肪酸为底物，但其中对20C底物的催化活性很低。随后，Pereira等人发现来源于异枝水霉的ω-3脂肪酸脱饱和酶sdd17对18C的多不饱和脂肪酸没有催化活性，却能将20C的ARA催化为EPA，转化率为25.9％。同样的，来源于致病疫霉的ω-3脱饱和酶OPIN17也不能以18C的多不饱和脂肪酸为底物，但是对ARA的转化率达到了30.94％。

近年来，Xue等人从瓜果腐霉、大豆疫霉菌、栎树猝死病菌中分离出三种ω-3脱饱和酶——PaD17、PsD17和PrD17并在重组解脂酵母菌中实现异源表达(IdentificationandcharacterizationofnewΔ-17fattyaciddesaturases,ApplMicrobiolBiotechnol(2013)97:1973–1985)。这三种酶既能催化18C又能催化20C的多不饱和脂肪酸，但偏好催化20C底物ARA。通过对这些偏好催化20C脱饱和酶的进一步研究发现，其在常温下对ARA有较高的转化率，实现了常温下生物积累EPA。这一类偏好以20Cω-6LC-PUFAs为底物催化合成ω-3LC-PUFAs的脱饱和酶可以直接、高效地催化ARA生成EPA，为通过延长酶催化合成DHA提供了底物，对于生物合成法生产ω-3LC-PUFAs具有十分重要的意义。为了提高生产效率，筛选此种高效催化ARA合成EPA的脱饱和酶显得尤为重要。这将为构建高产ω-3LC-PUFAs的工程菌，常温发酵生产EPA、DHA，打下坚实的基础。

【发明内容】

本发明的目的是利用生物信息学的方法，获得一些常温偏好20C的ω-3脱饱和酶，通过构建重组工程菌，对每一种ω-3脱饱和酶催化ARA生成EPA的能力进行了鉴定，以获得最具有重要应用潜力的高效催化20Cω-6LC-PUFAs合成ω-3LC-PUFAs的脱饱和酶。

本发明的思路是将5种已知的常温偏好20C的ω-3脱饱和酶序列进行比对，根据序列相似度及同源性分析，筛选出与已知序列相似度高、亲缘性近的来自寄生疫霉的基因序列如SEQIDNO.1和来自真菌媒介丝囊菌的基因序列SEQIDNO.5。利用ClustalW2软件将其氨基酸序列与多种已知的常温偏好20C的ω-3脱饱和酶序列进行比对，发现天然的来自寄生疫霉的基因序列如SEQIDNO.1和来自真菌媒介丝囊菌的基因序列SEQIDNO.5拥有与已知序列相似的3个His-box区。通过TMHMM软件分析结果显示所选序列具有与已知序列相似的跨膜域，随后进行活性验证。

进一步，本发明利用全基因合成技术构建了两段经过优化的ω-3脱饱和酶序列：如SEQIDNO.3的oPpFADS17和如SEQIDNO.7的oAiFADS17。使用PCR技术扩增出目的基因片段，插入PYES2/NTC表达载体得到PYES2/NTC-oPpFADS17和PYES2/NTC-oAiFADS17并完成测序验证，进而用化学法转化入酿酒酵母INVSc1，得到的重组工程菌株能顺利表达两段基因编码的蛋白。最后通过外源添加不同碳链长度的多不饱和脂肪酸底物进行活性验证，确定筛选的oPpFADS17、oAiFADS17序列具有ω-3脱饱和酶活性。

本发明提供具有特异性催化20C能力的ω-3脱饱和酶的编码序列，其核酸序列分别如SEQIDNO.3和SEQIDNO.7。

本发明还提供分别含有SEQIDNO.3和SEQIDNO.7核酸序列的表达载体PUC57-oPpFADS17和PUC57-oAiFADS17，能够分别表达寄生疫霉和真菌媒介丝囊菌的ω-3脱饱和酶。

本发明还提供能够分别表达寄生疫霉和真菌媒介丝囊菌的ω-3脱饱和酶的重组微生物。优选地，所述重组微生物是酿酒酵母。

本发明成功表达了来源于寄生疫霉和真菌媒介丝囊菌、在多不饱和脂肪酸生物合成途径中起关键作用的ω-3脱饱和酶oPpFADS17和oAiFADS17，其氨基酸序列分别如SEQIDNO.4和SEQIDNO.8。

本发明还涉及上述ω-3脱饱和酶oPpFADS17和oAiFADS17在多不饱和脂肪酸生物合成中的用途，特别是在常温下将C20:4^Δ5,8,11,14催化为C20:5^{Δ5,8,11,14,17}。

本发明通过实验方法获得两种ω-3脱饱和酶既能催化18C又能催化20C的多不饱和脂肪酸，但偏好于将20C的ARA转化为EPA，，催化效率达到65％。用此基因构建基因工程菌株为后续工业化生产EPA、DHA奠定了应用基础。

【附图说明】

图1为PCR扩增的目的基因片段图；

其中M为核酸Marker；泳道1为oPaFADS17基因片段(1080bp)；泳道2为oPpFADS17基因片段(1086bp)；泳道3为oAiFADS17基因片段(1095bp)；

图2为酿酒酵母重组转化子PCR鉴定的琼脂糖凝胶电泳图；

其中M为核酸Marker；泳道1为含空质粒的载体；泳道2-4为INVSc1-oPaFADS17的1、2、3号转化子；泳道5-7为INVSc1-oPpFADS17的1、2、3号转化子；泳道8-10为INVSc1-oAiFADS17的1、2、3号转化子；

图3为各ω-3脱饱和酶转化子的转录水平；

图4为各ω-3脱饱和酶转化子气相检测图；

A为INVSc1-oPpFADS17气相检测图；

B为INVSc1-oAiFADS17气相检测图；

C为INVSc1-oPaFADS17气相检测图；

【具体实施方式】

以下实施例用于非限制性地解释本发明的技术方案。

实施例1：常温偏好20C的ω-3脱饱和酶的确定

将5种已知的常温偏好20C的ω-3脱饱和酶序列(基因OPIN17、sdd17、PsD17、PrD17和PaD17)在NCBI文库中进行比对，根据序列相似度及同源性分析，筛选出两种与已知序列相似度高、亲缘性近的ω-3脱饱和酶基因序列，分别来自于寄生疫霉、真菌媒介丝囊菌，其对应的基因编号分别为XM_008906963、XM_008870610。NCBI文库对这两段序列的注释均属于脂肪酸脱饱和酶家族，但并未对其具体功能做详细的注释。

通过ClustalW2软件将以上两段基因的编码区序列与前述5种已知的偏好20C的ω-3脱饱和酶序列进行蛋白比对，发现以上两段序列具有与已知序列相似的3个His-box区，即所有ω-3脱饱和酶的共同点，其相似的His-box区蛋白序列见表1。通过TMHMM软件分析发现以上两段序列具有与已知序列相似的跨膜域。

表1常温下偏好20C的ω-3脱饱和酶的3个His-box氨基酸序列

实施例2：重组表达载体的构建

1、获得目的基因

由于来源于寄生疫霉、真菌媒介丝囊菌和瓜果腐霉的基因序列密码子使用偏好性不同于宿主酿酒酵母，所以根据真核生物的密码子使用偏好性，利用GenscriptOptimumGeneTMsystem对其核酸序列进行密码子优化，分别人工合成了优化后的基因序列oPpFADS17、oAiFADS17和oPaFADS17(为阳性对照)，如SEQIDNO.3、SEQIDNO.7和SEQIDNO.11，然后分别与PUC57-simple载体连接得PUC57-oPpFADS17、PUC57-oAiFADS17和PUC57-oPaFADS17，保存在大肠杆菌Top10中(购买自中国南京金斯瑞公司)。

根据oPpFADS17、oAiFADS17和oPaFADS17，序列设计引物，每对引物添加酶切位点EcoRI和XhoI(下划线处)。以分别含有以上优化基因的质粒PUC57-oPpFADS17、PUC57-oAiFADS17和PUC57-oPaFADS17为模板，用每种基因对应引物，KOD高保真聚合酶，通过PCR扩增得到目的基因片段。PCR程序为：94℃30s，55℃30s，68℃1.5min，30个循环，68℃10min，并对PCR产物进行纯化，纯化产物用1.0％的琼脂糖凝胶电泳验证。结果如图1。

用于扩增目的基因的引物序列如下：

oPpFADS17FctaattgaattcATGGCAACCAAGCAAGC

oPpFADS17RcgattctcgagTTAAGTTGACTTGGTTTTAACAGCG

oAiFADS17FacaatggaattcATGCCATCCCCTAAAGCCAC

oAiFADS17RcctgatctcgagTTATAAGGTCTTTTTAACTGAGTTTGCTCT

oPaFADS17FcatgtagaattcATGGCTTCGTCCACCGTTG

oPaFADS17RttacgactcgagTTAGTTAGCCTTGGTCTTGGCAG

2、酶切反应：

在37℃条件下，用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切目的基因片段和载体PYES2/NTC进行酶切反应，酶切体系(100μL)为：2μLEcoRI，2μLXhoI，30μL目的基因/载体，10μLcutsmartBuffer，56μL去离子水，37℃孵育12h。酶切产物用ThermoScientificGeneJETgelextractionkit试剂盒进行胶回收后，存于-20℃待用。

其中，内切酶缓冲液10×cutsmartBuffer：500mM乙酸钾，200mMTris-醋酸盐缓冲液，100mM醋酸镁，1000μg/mL牛血清白蛋白，pH7.9。

3、连接反应：

用T4连接酶分别连接纯化后的目的基因片段oPpFADS17、oAiFADS17、oPaFADS17和载体PYES2/NTC，4℃孵育12h，连接体系为：PYES2/NTC载体(50ng/μL)1μL，基因片段75-150ng，buffer1μL，T4连接酶1μL，补水至10μL。

其中，10×连接酶buffer：660mMTris-盐酸缓冲液(pH7.6)，66mM氯化镁，100mM二硫苏糖，1mM三磷酸腺苷。

4、转化大肠杆菌TOP10感受态细胞：

转化方法如下：

1)无菌状态下取100μL感受态细胞，加入1-2μL连接产物，吹吸混匀。

2)将上述步骤中的感受态细胞移入电转杯中，避免产生气泡。

3)将电转杯放入Bio-Rad电转仪，调到合适预设程序档位，根据仪器使用操作说明进行电转化，电压条件为1.8kv。

4)将转化后的感受态细胞移至含有1mLSOC复苏培养基的离心管中，37℃，150rpm孵育1h。

5)取200μL涂布于含有100μg/mL氨苄霉素的LB固体培养基平板。倒置37℃培养过夜。

挑取阳性转化子，提取质粒并测序，测序结果与基因序列完全匹配，表明连接成功，获得表达载体，分别命名为PYES2/NTC-oPpFADS17、PYES2/NTC-oAiFADS17、PYES2/NTC-oPaFADS17。

其中，SOC复苏培养基的组成为：20g/L胰蛋白胨，5g/L酵母抽提物，0.5g/L氯化钠，2.5mM氯化钾，10mM氯化镁，20mM葡萄糖。

LB固体培养基的组成是：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母抽提物，10g/L氯化钠，20g/L琼脂。

挑取一个酿酒酵母INVSc1(购自美国英杰公司)克隆于10mLYPD培养基中，30℃过夜培养。测OD600，转接一定量菌液于50mL培养基使OD值为0.4，继续培养2-4h。2500rpm离心3min，40mL1×TE重悬。2500rpm离心3min，2mL1×LiAc/0.5XTE重悬，室温孵育10min。

对实施例2的每个转化子取100μl上一步的酵母悬液，加入1μg重组表达载体质粒DNA和100μg鲑鱼精担体DNA。为了获得最佳的转化效率，每次转化前重复对载体DNA进行变性处理，沸水浴2min，冰浴2min，反复四次。加入700μl1×LiAc/40wt％PEG-3350/1×TE，混匀。30℃孵育30min。补加88μlDMSO，混匀，42℃休克7min。离心10s，去上清。加入1mL1×TE重悬，再次离心。50-100μl1×TE重悬菌体，涂于SC选择养基平板上。30℃培养2-5d。

其中1×TE：10mMTris-盐酸缓冲液(PH＝8.0)，1mM乙二胺四乙醇胺(PH＝8.0)；1×LiAc：10mM醋酸锂。

YPD培养基组成为：10g/L酵母抽提物，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖。

其中SC选择培养基为：6.7g/L酵母氮源(无氨基酸有硫酸铵)，20g/L葡萄糖，0.1g/L(分别为腺嘌呤，精氨酸，半胱氨酸，亮氨酸，赖氨酸，苏氨酸，色氨酸)，0.05g/L(分别为天冬氨酸，组氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，酪氨酸和缬氨酸)，20g/L琼脂粉。

实验例4、酿酒酵母转化子的PCR验证

从平板上挑取生长状态良好的菌落接种到5mL含氨苄抗性的YPD培养基中，30℃200rpm培养48h，用质粒抽提试剂盒(购自天根公司)抽提质粒，测量A260nm和A280nm值，计算质粒的浓度，低温保存。

用相应引物进行PCR鉴定。引物如下：

T7TAATACGACTCACTATAGGG

T7terminatorTCGGTTAGAGCGGATGTG

PCR反应体系如下：ddH₂O7μL，10×TaqMIX10μL，通用引物T71μL，通用引物T7terminator1μL，模板(质粒)1μL。PCR反应条件：94℃5min，94℃30s，58℃30s，72℃1.5min，30个循环，72℃7min。扩增反应结束后取3μLPCR产物进行1wt％琼脂糖凝胶电泳，检测PCR产物条带大小，如图2所示。

由图2可见各基因分别得到3个转化子。重组转化子分别命名为INVSc1-oPpFADS171-3、INVSc1-oAiFADS171-3和INVSc1-oPaFADS171-3，于30wt％甘油管保藏。未插入基因片段的PYES2/NTC空载体作为阴性对照组。

实验例5：酿酒酵母转化子诱导培养

挑取酿酒酵母转化子平板上的单菌落接种于种子培养基SC-U，28℃培养48h，测量OD₆₀₀值。转接入诱导培养基，使OD值达到0.4，同时外源添加不同碳链长度的多不饱和脂肪酸底物。28℃培养48h，收集菌体。

其中种子培养基SC-U为：6.7g/L酵母氮源(无氨基酸有硫酸铵)，20g/L葡萄糖，0.1g/L(分别有腺嘌呤，精氨酸，半胱氨酸，亮氨酸，赖氨酸，苏氨酸，色氨酸和尿嘧啶)，0.05g/L(分别有天冬氨酸，组氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，酪氨酸和缬氨酸)。

诱导培养基是将种子培养基的碳源更换为10g/L棉籽糖，并添加20g/L诱导剂半乳糖。

实验例6：酿酒酵母转化子的转录水平测定

提取酿酒酵母转化子总RNA，具体步骤为：

1)取出适量在液氮中冻存的菌体，于预冷的无菌无酶研钵中加入液氮充分研磨。

2)加入1mLTRIzol(购买自美国Invitrogen公司)继续研磨至粉末，室温放置至溶解。

3)用无酶枪头吸取1mL上述液体于无酶离心管中，加入200μL三氯甲烷混匀。

4)12000rpm4℃离心15min，吸上清于新的无酶离心管中。

5)加入200μL三氯甲烷混匀，12000rpm4℃离心15min，吸上清于新的无酶离心管中。

6)加入等体积的异丙醇，静置15min，12000rpm4℃离心15min。弃上清，室温晾干。

7)加入1mL70vol％乙醇，12000rpm4℃离心15min。用无酶枪头吸去乙醇，室温放置干燥。

8)加入50μL无酶水溶解RNA，-80℃储存。

9)浓度测定：取1μLRNA用NaNodrop2000测定浓度。

10)变性胶电泳检测RNA完整性：取1μgRNA在1.2wt％的变性胶中电泳，观察RNA完整性。

根据oPpFADS17、oAiFADS17、oPaFADS17基因序列和酿酒酵母内参18SrDNA序列设计qRT-PCR引物：

q-oPpFADS17FGGCAACCAAGCAAGCCTATGTA

q-oPpFADS17RGCTAAGGCAACTGCAATTACCAAAC

q-oAiFADS17FTACTACTTCGCTCCATTGTTCGTTT

q-oAiFADS17RCAACCGTAGGATCTATCAACTGAAG

q-oPaFADS17FCTTCGTCCACCGTTGCTG

q-oPaFADS17RAGCCAGCGATTCCGAGA

18S-FAATCATCAAAGAGTCCGAAGACATTG

18S-RCCTTTACTACATGGTATAACTGTGG

取0.5-1μg总RNA为模板，根据PrimeScriptRTreagentkit(购自日本TaKaRa公司)试剂盒说明进行操作，获得重组菌株的cDNA。使用ABI-Prism7900sequencedetectionsystem(AppliedBiosystems,CA)按照SYBRGreenPCRMasterMix(AppliedBiosystems,CA)的说明进行RT-qPCR反应。

反应体系为：10μlSYBRGreenPCRMasterMix，各基因上下游引物各0.5μl，8μl无酶水，1μl模板。PCR循环设置为50℃2min，95℃10min，95℃15s，60℃30s，40个循环。酿酒酵母的18SrRNA作为内参基因。

根据2^-ΔΔCt法计算基因的相对转录水平，其中所有样品测三个重复，其中：ΔΔCt＝ΔCt(样品)-ΔCt(对照)

结果如图3所示。分析发现，各基因转化子较对照组，ΔΔCt值均达到10左右，证明此基因的表达量发生了从无到有的变化，表明在宿主菌株中均成功转录。

实验例7：酿酒酵母的蛋白表达测定

以相同的条件，对不同基因的不同转化子分别诱导后，用0.5mm酸洗玻璃珠破碎菌体提取细胞总蛋白。

用BSA法测定蛋白浓度后，以100μg总蛋白的上样量进行SDS-PAGE电泳，至Marker完全分离。

于Bio-Rad电泳仪中将蛋白凝胶中的蛋白转移到PVDF膜上。转膜条件为20mA，过夜。

转膜完成后，将PVDF膜浸泡在TBST缓冲液中，于水平摇床上室温孵育10min。重复三次。

将PVDF膜浸泡在含5wt％脱脂乳的TBST缓冲液中，于水平摇床上室温孵育90min。

将PVDF膜浸泡在TBST缓冲液中于水平摇床上室温孵育10min。重复三次。

将抗His一抗以1:5000的比例溶于含有5wt％脱脂乳的TBST缓冲液中水平摇床孵育1h。

将PVDF膜浸泡在TBST缓冲液中于水平摇床上室温孵育10min。重复三次。

将羊抗鼠二抗以1:10000的比例溶于含有5wt％脱脂乳的TBST缓冲液水平摇床孵育1h。

将PVDF膜浸泡在TBST缓冲液中于水平摇床上室温孵育10min。重复三次。

将PVDF膜用ECL法显影。在western成像仪中曝光拍照。

结果表明，不同基因的不同转化子蛋白均得到表达，且不同转化子蛋白表达量几乎一致。

其中TBST缓冲液(1L)组成为：8.8g氯化钠；20mL1MTris-HCl缓冲液pH8.0；0.5mL吐温20。

实施例8：酿酒酵母脂肪酸的提取

包括以下步骤：

收集诱导后菌体，真空冷冻干燥。

充分研磨粉碎，称取10mg加入1mL10wt％盐酸甲醇溶液(即含有10wt％HCl的甲醇)，内标(C15:0，C21:0各100μl)，振荡混匀。60℃水浴3h，每隔0.5h震荡一次。

加入1mL正己烷和1mL饱和氯化钠振荡混匀，4000rpm离心5min。取上清至干净的瓶中。

取1mL正己烷加于原瓶，4000rpm离心5min，取上清于上述新瓶中。

新瓶中的液体用N₂吹干。加入1mL正己烷，旋紧盖子，振荡溶解，得到脂肪酸甲酯溶液。

所得脂肪酸甲酯分析采用GC-MS(ShimadzuCo.，Japan)，色谱柱为Rtx-Wax(30m×0.25mm，0.25μm)。进行质谱检测器检测，汽化室和检测器温度分别为240℃和250℃，分流方式进样1μL，分流比10:1，载气为氦气。

程序升温：初始温度40℃保持5min，以20℃/min升到150℃，再以5℃/min升到190℃，保持5min，最后以5℃/min升到220℃，保持17min。通过与脂肪酸甲酯标准品(C15:0)保留时间，峰面积比对以及质谱分析结果，定性、定量样品中脂肪酸组分。

实施例9：常温偏好20C的ω-3脱饱和酶活性鉴定

在诱导培养基中添加三个浓度梯度0.05mM、0.1mM、0.2mM的ARA作为底物进行诱导，收集菌体，提取脂肪酸，GC-MS脂肪酸测定结果如图4所示。

与Ctrl组相比，INVSc1-oPpFADS17、INVSc1-oAiFADS17、INVSc1-oPaFADS17在37.5min中出现新峰，通过与脂肪酸甲酯标准品比对以及质谱分析，判定此峰为EPA。具体分析结果见表2

表2不同ω-3脱饱和酶酿酒酵母重组转化子对ARA的催化效率

INVSc1-oPpFADS17的三个转化子对ARA的催化效率最高，其中INVSc1-oPpFADS173在三个浓度梯度下分别达到64.8％、49.0％、43.8％，与阳性对照INVSc1-oPaFADS17在三个浓度下的催化效率69.7％，48.4％，39.5％几乎没有差别，而绝对产量进一步优于阳性对照的各个转化子。

特别地，与现有技术<IdentificationandcharacterizationofnewΔ-17fattyaciddesaturases>中记载的重组解脂酵母相比，本发明的INVSc1-oPpFADS17转化子在实现相当的催化转化率时，其所需的诱导培养基中的底物ARA浓度显著降低，特别是在0.05mM下实现最高转化率，且EPA产量也进一步提高，显示出更好的EPA转化能力。另外，本发明使用的表达载体酿酒酵母中仅含有Δ9脂肪酸脱氢酶，即酿酒酵母中仅有亚油酸和棕榈油酸两种单不饱和脂肪酸，与现有的重组解脂酵母相比，本发明的重组酿酒酵母不会干扰要利用的多不饱和脂肪酸合成途径，且本发明的重组载体上带有His标签，更有利于后续蛋白的纯化和鉴定。

此外，以上数据看出，来自真菌媒介丝囊菌的ω-3脱饱和酶基因序列尽管与来自寄生疫霉的ω-3脱饱和酶基因序列具有相似度高、亲缘性近的特点，但通过相同技术手段获得的重组菌却不能起到相同的效果。来自真菌媒介丝囊菌的转化子INVSc1-oAiFADS17的催化效率相对较低，分别为46.3％，33.5％，23.9％。为了进一步验证这几段基因是否偏好催化20C的底物，选取INVSc1-oPpFADS173、INVSc1-oAiFADS173和INVSc1-oPaFADS171三株重组转化子，分别在诱导培养基中添加0.2mMLA、GLA、DGLA、ARA以及同时添加0.1mMLA和0.1mMARA分别进行诱导，结果如表3。

表328℃不同ω-3脱饱和酿酒酵母重组转化子对不同底物的催化效率

分析可知，重组转化子INVSc1-oPpFADS173和INVSc1-oAiFADS173、INVSc1-oPaFADS171对20C底物的转化率显著高于18C底物，其中对ARA的转化效率尤为明显。INVSc1-oPpFADS173对ARA的转化率最高，与阳性对照INVSc1-oPaFADS171的转化率相当，产量则高于阳性对照；此外，INVSc1-oPpFADS173对ARA以外的ω-6PUFAs的转化率是阳性对照的两倍左右，说明本发明的重组菌合成ω-3PUFAs的效率明显高于阳性对照。

为了证明达寄生疫霉的ω-3脱饱和酶在常温和较低温下催化活性均较高，在诱导培养基添加0.2mMLA、GLA、DGLA、ARA以及同时添加0.1mMLA和0.1mMARA，12℃条件下进行诱导，结果如表4。

表412℃不同ω-3脱饱和酿酒酵母重组转化子对不同底物的催化效率

从表4的脂肪酸测定结果表明，不同的重组菌低温下的转化率均有所降低。然而，本发明中能够表达寄生疫霉ω-3脱饱和酶的重组酿酒酵母菌在较低温下具有显著高于能够表达真菌媒介丝囊菌的ω-3脱饱和酶的重组酿酒酵母菌的EPA转化率和EPA产量，也优于能够表达瓜果腐霉的ω-3脱饱和酶的重组酿酒酵母菌的EPA转化率和EPA产量。

综上所述，通过本发明获得的ω-3脱饱和酶既能催化18C，又能催化20C的多不饱和脂肪酸，但偏好将20C的ARA转化为EPA，且在常温下转化效率较高，此外合成ω-3PUFAs的效率进一步优于现有技术。用此基因构建基因工程菌株为后续工业化生产EPA、DHA奠定了应用基础。

虽然本发明专利已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明。任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种改动与修饰。因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。