高山被孢霉中Δ6脱饱和酶关键位点及其对活性的影响

摘要

高山被孢霉中Δ6脱饱和酶(MaFADS6)是决定ω3/ω6多不饱和脂肪酸代谢流的关键酶.利用定点突变技术研究MaFADS6-I一级结构与功能的关系,为高山被孢霉多不饱和脂肪酸的合成提供了理论依据.利用非链取代式质粒扩增技术对已构建质粒pYES2/NT C-MaFADS6-I内的表达单元(即MaFADS6-I)中细胞色素b5区(HPGG)下游的位点进行定点突变,将所有突变体分别转化酿酒酵母进行诱导表达,进一步通过在培养基中添加Δ6脱饱和酶的底物来考察重组菌对各底物的催化作用.实验结果表明,所有突变体催化α-亚麻酸(ALA)的活性没有改变;K61和D68两个位点对催化亚油酸(LA)起关键作用,其对应的4个突变体对LA的转化率分别为(6.2±0.5)％(K61T)、(0.3±0.0)％ (K61F)、(8.2±0.7)％ (D68N)和(6.6±0.8)％(D68L),相比原始转化率各降低50％以上;G63和T69两个位点对LA的催化无直接影响,但G63T突变体由于突变位点极性改变,其对LA的转化率为(8.5±0.9)％,比原始转化率降低了49.9％;而V66位点的突变体对LA的转化率分别为(22.3±2.6)％ (V66T)和(20.7±2.5)％ (V66A),比原始转化率分别降低了36.1％和37.8％.确定了MaFADS6-I氨基酸序列中K61和D68两个关键氨基酸位点经突变后均会使其酶活明显降低,这为研究MaFADS6-I一级结构与功能的关系提供了理论依据.