PRRSV非结构蛋白影响病毒致病力的关键氨基酸位点筛选及其作用机制研究

摘要

病毒的毒力基因与病毒致病性密切相关.本课题组的前期研究结果证实置换了高、低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的非结构蛋白nsp9和nsp10能够影响PRRSV的致病性,它们被确定为我国流行的PRRSV致死性毒力基因,但这两个蛋白参与致死性毒力作用的具体分子机制尚未阐明.本研究拟开展PRRSV高低致病性毒株nsp9和nsp10上影响病毒致病力的关键氨基酸位点寻找,并在此基础上探究其毒力作用机制.通过比较和研究不同致病力毒株的nsp9和nsp10对病毒感染的组织嗜性影响、对病毒基因组和亚基因组RNA合成效率的影响、病毒复制的保真性以及病毒蛋白本身的稳定性等几个方面,探索nsp9和nsp10影响PRRSV致病力的作用机制.利用反向遗传操作技术,构建并拯救出相互突变不同致病性PRRSV nsp9和nsp10差异氨基酸位点的感染性克隆及重组病毒,通过TCID50、流式细胞术、荧光定量PCR等方法,确定影响PRRSV在其靶细胞…猪原代肺泡巨噬细胞(PAMs)上复制增殖的关键氨基酸位点,通过动物攻毒实验验证关键氨基酸位点对于病毒致病力的影响;通过荧光定量PCR和Northern blot等方法检测关键氨基酸位点对病毒感染PAMs后病毒RNA合成的影响;通过Western blot等方法研究关键氨基酸位点对于nsp9和nsp10稳定性的影响;通过利巴韦林等药物筛选以及噬斑实验研究不同毒株nsp9和nsp10引起的基因序列保真性的差异.本研究的创新点在于从分子、细胞和宿主动物水平确定影响PRRSV致病力的非结构蛋白中关键氨基酸位点,解析非结构蛋白nsp9和nsp10影响病毒致病力的分子基础,为阐明PRRSV的分子致病机理及制定防控措施提供理论依据.