微藻多基因共表达载体及多基因共表达微藻

摘要

本发明公开了一种微藻多基因共表达载体，所述表达载体的开放阅读框，采用Ubi启动子、Nos启动子或Hsp70A启动子；目的基因之间以2A肽序列连接并构建在所述表达载体的一个开放阅读框中。

说明书

技术领域

本发明涉及微藻的基因工程领域，尤其是涉及采用小球藻内源性启动子 和2A肽来构建高效表达载体，能够在一个表达框中融合多个基因，转化微藻 后实现在微藻中共表达多个基因产物。

背景技术

微藻基因工程研究在莱茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)^[1-2]中取得 了重要的进展，在三角褐指藻(Phaeodactylumtricornutum)^[3]、杜氏盐藻 (Dunaliellasalina)^[4]以及小球藻(Chlorella)^[5-6]等微藻上也有了不同程度的 研究。目前，普遍用于转化的质粒中表达抗性基因和目的基因启动子是独立 的，分别位于不同的表达框里。通过抗性筛选获得的转化藻不能保证目的基 因及其表达框架能够同时整合进基因组，也不能保证其表达，因此给进一步 的鉴定和筛选带来了较大的困难和工作量。此外，对于表达2个及以上目的基 因时，通常需在质粒中同时插入多个表达框，使得质粒骨架变大，对整合效 率和目的基因的表达造成了很大的影响。

利用微藻作为新型生物反应器生产高附加值重组蛋白(蛋白疫苗、治疗 性抗体、工业酶等)的研究已经进行了多年，与其它表达系统相比，微藻具 有以下几点优势：1)成本低，以1g未纯化的蛋白计算，其成本不到用哺乳动 物细胞生产的万分之一^[7]；2)不会受到病毒和朊病毒的影响，这两者对人体 有害，通常由哺乳动物细胞培养引起；3)与细菌和酵母相比，可以进行复杂 的蛋白折叠和修饰，如Mamedov等^[8]用质谱分析法对莱茵衣藻糖蛋白的N端聚 糖模式进行了研究，发现其与哺乳动物细胞相似；4)多数种类的微藻是安全 的，即生产的蛋白具有生物相容性，可以不进行纯化。

莱茵衣藻(C.reinhardtii)是真核微藻的模式藻，可以进行自养生长也可以以 乙酸钠为碳源进行混养^[9]生长，遗传和代谢背景清楚，三种基因组(核、叶绿 体和线粒体)都可实现外源基因转化，目前被认为是最有潜力的重组蛋白生 产平台^[10]。但其面临着一个较大的障碍，即其无论在光自养还是混养培养时 的生长速率都较低，培养技术不成熟。

相比较而言，转基因小球藻具有更加明显的优势。小球藻含有丰富的蛋 白质、脂类、叶绿素、多糖、维生素、微量元素以及一些生物活性代谢产物， 营养成分全面而均衡，因而在保健品、饲料、食品、医药等方面具有巨大的 应用价值。与转基因植物相比，小球藻的产量易于控制，与其它微藻如C. reinhardtii相比，小球藻的繁殖速度要快得多，钱峰慧^[12]在异养培养蛋白核小 球藻时发现该藻可耐受高浓度的葡萄糖，在5L和50L生物反应器中培养90h 左右，细胞密度分别可达132.18g/L和149.43g/L。小球藻分离纯化表达产物相 对简单，适于规模化生产，且产业化的培养技术已经成熟，小球藻作为食品、 营养品等已经被人们广泛认可。这些优点是其它表达系统和微藻所不具备的， 作为新一代的生物反应器，有巨大的应用潜力。

蛋白核小球藻与一般的实验室研究用微藻不同，它可高产蛋白质、叶黄 素和小球藻生长因子，已于2012年被我国批准为新资源食品。使用独特的异 养-稀释-光诱导串联培养平台技术^[13](Sequentialheterotrophy-dilution- photoinductioncultivation,SHDP)可以实现其高密度高品质的培养，并已经成 功实现了蛋白核小球藻粉的工业化生产，异养培养的平均生长速率达3g/L/d， 不低于现有任何其它外源基因表达系统；此外，在合适的户外培养条件下该 藻株可快速固定CO₂并积累高达40％的油脂^[14]，目前已经用作微藻固碳和微藻 能源的工业模式藻株进行产业化开发。基于SHDP技术和高产油蛋白核小球藻 良种，可实现集“高附加值微藻产品、微藻能源和生物固碳”的一体化开发，有 望加快微藻能源和微藻固碳的产业化进程。蛋白核小球藻表达系统的研究和 开发在微藻能源、微藻固碳、废水处理、生物医药、酶制剂、饲料(饵料) 添加剂等工业生物技术领域具有极其重要的应用价值，但迄今未见有关该藻 遗传改造方面的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种应用于微藻的多基因共表达的载体，尤其是 采用了小球藻内源性的启动子和具有自我剪切功能的2A肽。

本发明提供了一种微藻多基因共表达载体，所述表达载体的开放阅读框， 采用Ubi启动子(Ubiquitin启动子)、AR启动子、Nos启动子或Hsp70A(热 激动蛋白70A启动子)启动子；目的基因之间以2A肽序列连接并构建在所述 表达载体的一个开放阅读框中。上述的启动子可为内源性的或来源自高等植 物。所述的表达载体具有其他载体的通用的复制原点基因和抗性基因，或者 无通用的抗性基因，其抗性基因构建入开放阅读框中,与目的基因一同表达。

其中，优选地，所述Hsp70A启动子和AR启动子与目的基因之间构建有 Kozak序列GCCACC。

其中，优选地，所述的开放阅读框，采用Hsp70A启动子；Hsp70A为蛋白 核小球藻内源性启动子，其序列如SEQIDNO:1所示。

优选地，所述的2A肽选自但不限于F2A(肽Footandmouthdiseasevirus 2A)、T2A肽(Thoseaasignavirus)、P2A肽(Porcineteschovirus-12A)和E2A肽 (Equinerhinitis2A)。

进一步优选地，所述的F2A肽基因序列如SEQIDNO:2所示；所述的T2A 肽基因序列如SEQIDNO:3所示；所述的P2A肽基因序列如SEQIDNO:4所示； 所述的E2A肽基因序列如SEQIDNO:5所示。

上述表达载体选自pGreen0000、pGreen0029、pBIN19、pBI121、pBI221、 pBluescriptSK/KS的重组构建载体。

其中，优选地，所述的表达载体的开放阅读框的终止子为Nos终止子

本发明另一方面涉及构多基因共表达微藻，含有上述的构建有抗性基因 和目的基因的多基因共表达载体。

其中，所述的微藻藻种选自蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)、普 通小球藻(Chlorellavulgaris)、椭圆小球藻(Chlorellaellipsoidea)和小球 藻(Chlorellazofingiensis)。

其中，优选地，所述的抗性基因选自但不限于ble基因(博来霉素抗性基 因)、nptII基因(遗传霉素抗性基因)和hpt基因(潮霉素抗性基因)。

进一步优选地，在构建上述多基因共表达微藻，选用电穿孔法、基因枪 法和玻璃珠法，优选地，选用电穿孔法。

本发明提供的载体利用具有自身剪切功能的2A肽，可以实现一个开放阅 读框中表达多个目的基因的效果，与其他共表达的策略相比具有更具明显的 优势。

附图说明

图1为现有载体的开放表达框的结构示意图；

图2为本发明所述载体的开放表达框的结构示意图；

图3为本发明中涉及的pGreenII0000-NosT重组质粒的构建流程图；

图4为本发明涉及的pGreenII0000-NptII-P2A-EGFP-NosT重组质粒的构 建流程图；

图5为本发明涉及的pGreenII0000-Ubi(AR、Hsp)-NptII-P2A-EGFP-Nos 重组质粒的构建流程图；

图6为不同类型启动子的载体转化的小球藻的培养效果图；其中， 00ARNPE为pGreenII0000-AR-NptII-P2A-EGFP-Nos重组载体，00UbiNPE 为pGreenII0000-Ubi-NptII-P2A-EGFP-Nos重组载体，00HspNPE为pGreenII 0000-Hsp-NptII-P2A-EGFP-Nos重组载体，00NNPE为pGreenII0000-Nos-Npt II-P2A-EGFP-Nos重组载体

图7为不同类型启动子的载体转化的小球藻的荧光显微镜观察图。其 中,DIC为微干涉相差显微结果，TxRed为红色荧光显微结果；FITC为绿色荧 光显微结果；TxRed-FITC为红色荧光和绿色荧光共同显微结果。Y代表野生 型,HSP7代表编号为7的Hsp70A启动子转化株，Hsp10代表编号为10的 Hsp70A启动子转化株,Ubi2代表编号为2的Ubi启动子转化株，AR4代表编 号为4的AR启动子转化株。

具体实施方式

参照说明书附图，对本发明的具体实施例作出进一步详细说明，但不限 于以下实施例所述的技术方案。

实施例1

pEASY-F2A、P2A、T2A重组质粒的构建

根据F2A、P2A、T2A三种2A肽的氨基酸序列及蛋白核小球藻内源密码 子偏好性[8]设计其核苷酸序列，分别设计2段有重复约20bp的上下游引物， 分别为F2A1、F2A2、P2A1、P2A2、T2A1、T2A2，用融合PCR法合成完整 的序列，回收纯化后连接到pEASY-Blunt克隆载体，用M13引物做PCR鉴 定单菌落，提取质粒后测序验证。所用引物如下：

表12A肽融合时所用引物

实施例2

pGreenII0000-NosT重组质粒的构建

参照图3所示，用分别含NotI和SacI酶切位点的Nos终止子上下游引 物NosT-F/R和高保真酶Pfu聚合酶从pGreenII0029质粒中克隆出Nos终止 子片段。用SpeI和NotI双酶切pGreenII0000质粒和Nos终止子片段，分 离纯化Nos终止子片段和线性化的pGreenII0000质粒，然后用T4DNA连接 酶过夜连接，得到pGreenII0000-NosT重组质粒，转化大肠杆菌Trans-T1感 受态细胞，用00F和00R引物做PCR鉴定单菌落，并提取质粒测序验证。所 用引物如下：

表2构建pGreenII0000-NosT重组质粒时所用引物

实施例3

pGreenII0000-NptII-P2A-EGFP-NosT重组质粒的构建

参照图4所示，首先分别用NptII_BamF和NptII_P2AR引物克隆出NptII基 因片段(新霉素磷酸转移酶)、P2A_NptIIF和P2A_EGFPR引物克隆出P2A片段、 EGFP_P2AF和EGFP_NotR引物克隆出EGFP片段，其中NptII_P2AR和P2A_NptIIF 引物为反向互补序列，含有18bp的NptII基因末端序列和18bp的P2A基因 前端序列，P2A_EGFPR和EGFP_P2AF引物为反向互补序列，含有18bp的P2A 基因末端序列和19bp的EGFP基因前端序列以及SpeI酶切位点序列。回收 纯化3个基因片段后用重组PCR法将3个片段连接起来，得到Npt II-P2A-EGFP序列，再用NptI_IBamF和EGFP_NotR引物扩增此序列，回收纯化后 连接pEASY-Blunt克隆载体，用M13引物做PCR鉴定单菌落，提取质粒后 测序验证。

分别用BamHI和NotI双酶切pGreenII0000-NosT重组质粒和 pEASY-NptII-P2A-EGFP重组质粒，分离纯化NptII-P2A-EGFP基因片段和线 性化的pGreenII0000-NosT质粒，然后用T4DNA连接酶过夜连接，得到 pGreenII0000-NptII-P2A-EGFP-NosT(简称00NPE)重组质粒，转化大肠杆 菌Trans-T1感受态细胞，用00F和00R引物做PCR鉴定单菌落，并提取质粒 测序验证。上述使用的引物如下：

表3构建pGreenII0000-NptII-P2A-EGFP-NosT重组质粒时所用引物

实施例4：

参照图5所示，pGreenII0000-Ubi(AR、Hsp)-NptII-P2A-EGFP-Nos 重组质粒的构建

1)pGreenII0000-Ubi-NptII-P2A-EGFP-Nos(简称00UbiNPE)重组质 粒的构建

分别用HindIII和BamHI双酶切pGreenII0029-Ubi-EGFP-Nos重组质粒 和pGreenII0000-NptII-P2A-EGFP-Nos重组质粒，分离纯化Ubiquitin启动子 基因片段和线性化的pGreenII0000-NptII-P2A-EGFP-Nos重组质粒，然后用 T4DNA连接酶过夜连接，得到pGreenII0000-Ubi-NptII-P2A-EGFP-Nos重组 质粒，转化大肠杆菌Trans-T1感受态细胞，用00F和UbiR引物做PCR鉴定 单菌落，并提取质粒测序验证。

2)pGreenII0000-AR-NptII-P2A-EGFP-Nos(简称00ARNPE)重组质 粒的构建

用含HindIII位点的上游引物AR_hinF和含BamHI位点的下游引物AR_bamR 从pMS188质粒中克隆出AR启动子基因片段，其中下游引物AR_bamR中添加 有助于翻译起始的Kozak序列“GCCACC”。之后操作与00UbiNPE质粒构建 相同，用00F和AR_bamR引物做PCR鉴定单菌落，并提取质粒测序验证。

3)pGreenII0000-Hsp-NptII-P2A-EGFP-Nos(简称00HspNPE)重组质 粒的构建

用含HindIII位点的上游引物Hsp_hinF和含BamHI位点的下游引物 Hsp_bamR从蛋白核小球藻基因组DNA中克隆出Hsp70A启动子基因片段，其 中下游引物Hsp_bamR中添加有助于翻译起始的Kozak序列“GCCACC”。回收 纯化后连接到pEASY-Blunt克隆载体，测序验证后提取质粒，之后操作与 00UbiNPE质粒构建相同，用00F(表2)和Hsp_bamR引物做PCR鉴定单菌落， 并提取质粒测序验证。

上述实验所用的引物如下，

表4，构建pGreenII0000-Ubi(AR、Hsp)-NptII-P2A-EGFP-Nos重组质 粒时所用引物

实施例5

pGreenII0000-NosP-NptII-F2A(P2A、T2A)-EGFP-Nos重组质粒的构 建

上述质粒的启动子均为与NptII基因同属于一个表达框下的Nos启动子， Nos-NptII基因片段直接用PCR法从pGreenII0029质粒上克隆获得。分别用 含BamHI位点的Nos_PbF引物和NptII_F2AR(NptII_P2AR、NptII_T2AR)引物克 隆出Nos-NptII基因片段、用F2A_NptIIF和F2A_EGFPR引物克隆出F2A片段、 用P2A_NptIIF和P2A_EGFPR引物克隆出P2A片段、用T2A_NptIIF和T2A_EGFPR引 物克隆出T2A片段，再分别用融合PCR法获得NosP-NptII-F2A(P2A、T2A) 基因片段。连接pEASY-Blunt克隆载体，测序验证后提取质粒。

分别用BamHI和SpeI双酶切pEASY-NosP-NptII-F2A(P2A、T2A)质 粒和pGreenII0000-Ubi-NptII-P2A-EGFP-Nos重组质粒，分离纯化Nos-Npt II-F2A(P2A、T2A)基因片段和线性化的pGreenII0000-EGFP-Nos片段，然 后用T4DNA连接酶过夜连接，得到pGreenII0000-Nos-NptII-F2A(P2A、 T2A)-EGFP-Nos重组质粒，转化大肠杆菌Trans-T1感受态细胞，用00F和 EGFP_cxR引物做PCR鉴定单菌落，并提取质粒测序验证。

上述载体构建所用的引物如下，

表5构建pGreenII0000-NosP-NptII-F2A(P2A、T2A)-EGFP-Nos重组 质粒所用引物

实施例6：

蛋白核小球藻的电击转化

1)在Endo培养基中接种10％的蛋白核小球藻，30℃、150rpm弱光条 件下混养。

2)取1mL处于对数生长期的藻液，4℃下8,000rpm离心3min收集藻 细胞，小心吸出上清液，加入1mL的高渗液，用枪头轻轻吹打至混匀，冰浴 40min。

3)4℃下8,000rpm离心3min收集藻细胞，小心吸出上清液，加入1mL 电击液用枪头轻轻吹打至混匀，用血球板计数法统计细胞密度。

4)用电击液调节细胞密度至5×107个/mL，加入上述质粒(载体 00UbiNPE、重组质粒00ARNPE、重组质粒00HspNPE和pGreenII 0000-NosP-NptII-F2A(P2A、T2A)-EGFP-Nos重组质粒)、辅助质粒pSoup 及鲑鱼精DNA。混匀后取100μL加入2mm电击杯，静置冰浴5min。

5)调节电击参数进行电击，完成后，冰上静置10min，加入200μL含 1g/mL葡萄糖的BBM培养基，30℃静置1h。

8)用移液器小心吸出转移至离心管中，4℃下12,000rpm离心2min收 集藻细胞。加入150μL含1g/mL葡萄糖的BBM培养基，于无菌的96孔板 中恢复培养24h。

9)全部取出，涂布在含G418的SE固体培养基(含1.5％琼脂)上，先 30℃避光过夜，后在2klx、16h/8h光暗周期培养，约一周后可见有单藻落长 出

转化效率如图6和图7所示；其中，参照图6和图7所示，在3个培养 皿中，采用Hsp70A启动子的重组载体(00HspNPE)转化效率最好，采用Ubi 启动子的重组载体(00UbiNPE)的转化效率次之。转化效率统计如下表6所 示，其中，如下所述的转化效率每个电转化的细胞所产生的转化子数目。

表6启动子Ubi、Hsp70A和Nos的转化效率

3,300V/cm** Ubi 7.13×10^-6Hsp70A 9.45×10^-6Nos 4.39×10^-6no plasmid* 0

*空质粒作为阴性对照。

**转化参数。

本发明虽然已以较佳实施例公开如上，但其并不是用来限定本发明，任 何本领域技术人员在不脱离本发明的精神和范围内，都可以利用上述揭示的 方法和技术内容对本发明技术方案做出可能的变动和修改，因此，凡是未脱 离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何 简单修改、等同变化及修饰，均属于本发明技术方案的保护范围。

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