一种基于下一代测序技术检测β-地中海贫血突变的多重PCR引物和方法及应用

摘要

本发明提供了一种基于下一代测序技术检测β-地中海贫血突变的多重PCR引物，所述多重PCR引物为如下引物对中的两对或多对：SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示引物对、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示引物对、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示引物对、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示引物对、SEQIDNO:9和SEQIDNO:10所示引物对、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12所示引物对。本发明提供的多重PCR引物组能用于β-地中海贫血突变多样性的高效检测，可覆盖中国南方人群β-地中海贫血突变的46个点突变位点。

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，特别是涉及一种基于下一代测序技术检测β-地中海贫血突变的多重PCR引物和方法及应用。

背景技术

β-地中海贫血是一种由于β-珠蛋白基因突变导致肽链表达失衡而产生的单基因遗传血液病，多由β-珠蛋白基因点突变所致。β-地中海贫血是世界上最常见的遗传性之一，据统计全世界约有1亿多人携带β-地中海贫血基因。β-地中海贫血也是我国南方各省最常见、危害最大的遗传病之一，我国部分省份的β-地中海贫血携带率见表1。地中海贫血基因主要为点突变，在中国南方人群中β-地中海贫血基因覆盖了46种点突变。

表1中国南方β地贫的人群携带率

地区β地贫携带率(％)广州2.54广西6.78四川2.18贵州4.72台湾1.10香港3.41

β-地中海贫血的基因诊断方法主要有：Sanger测序法、限制性片段长度多态性(RFLP)、反向点杂交(RDB)、等位基因特异性PCR(ARMS-PCR)。Sanger测序方法操作较繁琐，极大地限制了其在临床诊断中的应用，测序的检测通量也有限，并且对检测结果需要人工分析，分析耗时耗力。RFLP是通过识别特异性序列位点进行酶切反应，方法简便成本低廉，但其局限性是只能对有限的可产生酶切位点的突变进行检测，由于不完全或部分酶切反应还会导致假阳性或假阴性结果。反向点杂交技术的结果是用肉眼判读，失误率高，往往造成一份样本反复检测。ARMS-PCR需针对每个突变设计相应引物，每一对引物扩增条件都需优化，若需同时检测多种突变时则操作繁琐，而且也会出现假阳性或假阴性结果。

基于地贫缺陷基因的市场和社会检测需求，以及目前地贫缺陷基因检测现状的落后，利用高通量测序技术开发地贫基因突变位点检测试剂盒势在必行。

发明内容

鉴于此，本发明提供了一种基于下一代测序技术检测β-地中海贫血突变的多重PCR引物和方法及应用。

第一方面，本发明提供了一种基于下一代测序技术检测β-地中海贫血突变的多重PCR引物，所述多重PCR引物为如下引物对中的两对或多对：SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示引物对、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示引物对、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示引物对、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示引物对、SEQIDNO:9和SEQIDNO:10所示引物对、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12所示引物对。

优选地，所述SEQIDNO:1-SEQIDNO:12中的一条或多条引物替换为各引物自身3’端延长或截短0～3个碱基后所得的引物。

本领域技术人员可以理解的，若摸索的多重PCR引物组(比如，SEQIDNO:1～SEQIDNO:12所示6对引物组成的引物组)获得了较佳的扩增效果，一般情况下，设计引物的时候，适当的将多重PCR引物组中任一一条引物的长度延长或截短0～3个碱基，也可以获得不错的多重PCR扩增效果，也应纳入本发明保护范围。

第二方面，本发明提供了一种基于下一代测序技术检测β-地中海贫血突变的多重PCR方法，包括如下步骤：

取待测样品；

采用多重PCR反应扩增待测样品获得多重PCR产物，其中，所述多重PCR反应采用的多重PCR引物为如下引物对中的两对或多对：SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示引物对、SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示引物对、SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示引物对、SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示引物对、SEQIDNO:9和SEQIDNO:10所示引物对、SEQIDNO:11和SEQIDNO:12所示引物对。

优选地，所述SEQIDNO:1-SEQIDNO:12中的一条或多条引物替换为各引物自身3’端延长或截短0～3个碱基后所得的引物。

优选地，所述待测样品为DNA样品或RNA样品。

当所述取待测样品为DNA样品时，进行多重PCR的体系参照普通PCR体系进行配置；当所述取待测样品为RNA样品时，要先进行逆转录合成cDNA，再合成第二链DNA，此时，逆转录合成cDNA的步骤相当于一个循环的多重PCR(只采用上游引物组或下游引物组)，合成第二链DNA的步骤也相当于一个循环的多重PCR(只采用下游引物组或上游引物组)。

优选地，所述多重PCR反应的体系中，上游引物组中的各上游引物等摩尔混合；下游引物组中的各下游引物等摩尔混合。

如本发明所述的，“上游引物组”或“下游引物组”为如第一方面所述的多重PCR引物中各引物对的上游引物或下游引物组成的上游引物组或下游引物组；具体地，本发明用“F”表示上游引物，用“R”表示下游引物，如表2所示。

优选地，所述多重PCR反应的体系中，模板量为50ng～1ug/50ul体系。

优选地，所述多重PCR反应的程序为：

上述程序具体为：95℃预变性15min，95℃变性15s，60℃退火2min，72℃延伸3min，循环30～40次(优选为35次)，最后72℃后延伸10min。

优选地，所述多重PCR反应结束后，电泳，割胶回收片段长度为240-270bp的DNA片段。

优选地，将所得多重PCR产物进行建库后进行高通量测序，并通过生物信息学分析高通量测序结果，分析β-地中海贫血突变。

第三方面，本发明提供了一种检测β-地中海贫血突变的试剂盒，包括如第一方面所述的基于下一代测序技术检测β-地中海贫血突变多态性的多重PCR引物。

第四方面，本发明提供了一种如第一方面所述的基于下一代测序技术检测β-地中海贫血突变的多重PCR引物或第二方面所述的基于下一代测序技术检测β-地中海贫血突变的多重PCR方法在检测β-地中海贫血突变多态性中的应用。

本发明提供的基于下一代测序技术检测β-地中海贫血突变的多重PCR引物及方法的有益效果为：1)覆盖了南方人群46种点突变位点；2)平均扩增产物的长度在250bp左右，扩增的产物可用于所有的下一代测序平台。

附图说明

图1为本发明实施例提供的单独引物PCR的琼脂糖凝胶电泳图；

图2为本发明实施例提供的多重PCR的琼脂糖凝胶电泳图；

图3为本发明实施例提供的测序深度的生物信息学分析结果。

具体实施方式

材料及试剂说明：

β地中海贫血患者：来源于深圳市人民医院，患者知情同意。非特殊说明，本发明实施例采用的试剂均为市售商品，本发明实施例采用的数据库均为公开的在线数据库。

具体地，本发明引物如下：

表2.多重PCR引物序列

设计引物：采用Oligo7.0和MFEprimer-2.0对引物二聚体以及茎环错配进行分析，在包含突变位点的外显子两端设计引物，扩增的序列平均长度在250bp左右，且6对引物的退火温度基本一致。

本实施例提供的引物组覆盖了南方人群46个点突变位点。由于很小的序列变化将导致引物扩增效果显著降低，发明人分别针对不同目的区域的不同区段设计了多组多重PCR引物组，在经过预实验筛选后，综合产物片段长度和点突变覆盖范围，本发明选取了扩增效果最佳的引物组，如上表2所示。

表3：46种见于中国南方人群导致表达降低的β地中海贫血点突变及对应的本发明的引物

实施例1

本发明实施例1提供了一种β-地中海贫血突变待测DNA样品的制备方法，包括如下步骤：

收集的新鲜外周血样本各2毫升(ml)，采用QIAampDNAMiniKit(Qiagen,Cat.No:51304)试剂盒提取基因组DNA，并用Nanodrop2000(Thermo)测定DNA的浓度及纯度，然后保存基因组DNA。

实施例2

本发明实施例2提供了一种采用检测β-地中海贫血突变的多重PCR引物构建β-地中海贫血突变测序文库的方法，包括如下步骤：

1、多重PCR：

以实施例1所得基因组DNA为扩增模板，采用SEQIDNO:1～SEQIDNO:12所示共6对引物对，再采用QIAGEN公司MultiplexPCR试剂盒(货号：206143)，按试剂盒说明书配置多重PCR体系。

反应体系：

各引物等摩尔混合，引物总浓度是10微摩尔，模板量可以调整，本实施例中采用200ng。

再按下述多重PCR的条件设置PCR仪器程序，进行多重PCR：

PCR结束后，4℃保存PCR产物并电泳检测，在紫外下切下约240-270bp左右的目的片段。直接回收剩余的PCR产物，得到27uL纯化后的产物，回收步骤采用QIAGEN公司QIAquick胶纯化试剂盒，按常规实验室操作进行)。

为充分说明书本发明实施例的有益效果，本发明单独对表2中的6对引物进行PCR预实验，PCR体系和循环参数等均与上述多重PCR一样，除引物分别替换为表2的P1(HBB-1F和HBB-1R)、P2(HBB-2F和HBB-2R)、P3(HBB-3F和HBB-3R)、P4(HBB-4F和HBB-4R)、P5(HBB-5F和HBB-5R)和P6(HBB-6F和HBB-6R)共6对引物。

6对引物单独PCR的扩增产物电泳图谱如图1所示。6对引物的退火温度基本一致，扩增效率一致，扩增产物长度基本接近，平均长度在250bp左右。6对引物的扩增产物覆盖了β-地中海贫血突变的46种点突变位点。

2、加尾：

取纯化后的PCR产物，在产物3’末端加A尾，配置体系如下(其中，Klenowexo-购自NEB，货号：M0212)：

将该体系置于37℃下30min。利用QIAGEN公司QIAquick胶纯化试剂盒纯化加A尾的PCR产物。

3、加接头：

在DNA两端加上测序用的接头，配置下述体系(其中，Quickligase购自NEB，M2200L)：

其中，Adaptor的序列如下所示：

5’-/5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTC/ideoxyU/ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3’。

随后将该体系置于20℃下15min。然后加入3μL的USER，37℃放置15min。最后通过QIAGEN公司QIAquick胶回收试剂盒纯化连接产物。

4、产物上加入测序用的标签序列，配置体系如下(具体步骤参照illumina高通量测序文库构建说明书)

将配置的体系按下述程序进行PCR反应：

PCR结束后，用1.5％琼脂糖凝胶电泳验证PCR产物富集片段的大小，选取370bp的目的片段进行切胶回收，并纯化至30μL。

琼脂糖凝胶电泳结果图2所示。在图2中，T1泳道可以明显看到在300bp-400bp之间有一条带，为加上接头的片段(370bp，箭头所指处)，与理论相符。

5、将步骤4获得的纯化产物直接用Miseq平台测序进行测序。

测序结果是fastq格式的数据，通过生物信息学分析获得β地中海贫血点突变情况。测序深度见图3。本实施例使用PE150试剂盒进行测序，即片段两端各测序150bp。生物信息学分析测序深度如图3所示，横坐标是利用每对引物得到的扩增产物，纵坐标是测序深度。由图3可知，本实施例测序结果中覆盖了所有引物对的扩增产物，并且分布比较平均。

效果实施例1

采用实施例2的方法，对14例样品分别进行多重PCR、加A尾、加接头、加标签序列、高通量测序及生物信息学分析，获得如下结果，部分结果如表4所示：

表4.β-地中海贫血突变检测结果

如表4所示，在14例样品中，共检测到11处突变。特别值得注意的是，经过对样品测序的数据分析，证实所设计的目标序列在每个DNA样品中均得到有效的扩增，从而反映出所提供的检测方案具有较好的特异性和适用性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。