阻止菜豆凝集素聚合并抑制凝血毒性的多肽及其基因和用途

摘要

本发明公开了一种阻止菜豆凝集素聚合并抑制凝血毒性的多肽及其基因和应用，所述多肽的氨基酸序列如SEQ？ID？NO：1所示。本发明通过计算机模拟实验和生化实验定量研究菜豆凝集素凝血毒性的强弱，并利用Fmoc固相合成的方法合成多肽，设计的多肽具有阻断菜豆凝集素二聚体形成，从而抑制菜豆凝集素的凝血毒性。

说明书

技术领域

本发明涉及医学生物工程领域，具体地指一种阻止菜豆凝集素聚合并抑制凝血毒性的多肽及其基因和用途。

背景技术

普通菜豆(PhaseolusvulgarisL.)含有碳水化合物、矿物质、多种维生素和人体必需氨基酸等，在营养缺乏的发展中国家是重要的植物蛋白来源，在发达国家是调整膳食结构的食品，因此，普通菜豆是全球重要的食用豆类之一。

菜豆中毒是一种严重危害人类健康的现象。研究表明，菜豆中的菜豆凝集素会形成二聚体复合物结合，从而凝集血细胞，引发中毒现象。凝集素中毒潜伏期一般在2-4小时，会出现恶心、呕吐、腹痛腹泻、头疼、头晕、心慌胸闷、出冷汗、手脚发冷、四肢麻木、畏寒等症状。目前常用的方法是在高温中破坏分解凝集素二聚体结构，从而使凝集素丧失凝血毒性。然而，菜肴烹饪过程中不注意火候温度而产生的人中毒现象与牲畜因食用含有凝集素植物而产生的中毒现象屡次发生，严重危害人类健康，并造成大量的经济损失。

因此，为满足社会需求，急需研发阻止菜豆凝集素聚合并抑制凝血毒性的相关药物。

发明内容

本发明所要解决的技术问题就是提供一种阻止菜豆凝集素聚合并抑制凝血毒性的多肽及其基因和应用，本发明通过计算机模拟实验和生化实验定量研究菜豆凝集素凝血毒性的强弱，并利用Fmoc固相合成的方法合成多肽(具体见步骤3)或者通过基因序列转录翻译得到该多肽，设计的多肽具有阻断菜豆凝集素二聚体形成，从而抑制菜豆凝集素的凝血毒性。

为解决上述技术问题，本发明提供的一种阻止菜豆凝集素聚合并抑制凝血毒性的多肽，所述多肽的氨基酸序列为丝氨酸-苯丙氨酸-异亮氨酸-缬氨酸-丝氨酸，如SEQIDNO：1所示

本发明还提供了一种编码上述多肽的基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。

最优选，其核苷酸序列如SEQIDNO：3所示。

将上述核苷酸序列插入原核表达载体pET30中得到重组载体，再将导入大肠杆菌中，其表达纯化得到阻止菜豆凝集素聚合并抑制凝血毒性的多肽。(该方法见分子克隆手册)

此外，应当理解，鉴于密码子兼并性及物种具有密码子偏好性的特点，本领域技术人员，可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

本发明还提供了一种上述的多肽在制备及其抗凝血和植物凝集素有关疾病的药物中的应用。如该多肽可作为抗凝血的解毒剂，并可作为饲料添加剂等，减少因凝血毒性而造成的生命和财产损失。

如将抗凝血多肽的粉末用PBS缓冲液配成终浓度为0.05mg/mL的溶液，得到制剂，从而治疗抗凝血和植物凝集素有关疾病。

本发明的理论基础：

1)本发明通过计算机模拟研究可从分子层次解释菜豆凝集素的凝血功能，为设计抗凝血多肽提供重要的理论基础和物理模型。

2)生化实验可定量测定菜豆凝集素的凝血毒性。

3)多肽可阻止菜豆凝集素聚合物形成，并降低凝血毒性。

本发明的有益效果在于：

1)本发明的多肽能判别植物凝集素的凝血毒性强弱。

2)本发明的多肽能作为抗凝血抑制剂，从而降低人中毒的风险。

3)本发明的多肽能作为动物饲料添加剂，从而减少因为凝血毒性问题造成的经济损失。

综上所述，通过本发明的设计思路，抗肿瘤等其它的多肽。并且该方法系统性、综合性强。

附图说明

图1为本发明的抗凝血多肽SFIVS和外源菜豆凝集素PHA-E(PDBcode:3WCR)分子对接结果图；

图2为反相液相色谱分析合成的抗凝血多肽的纯度图；

图3为抗凝血多肽的质谱图；

图4为抗凝血多肽抗菜豆凝集素PHA-E的凝血活性图；

图中，阳性对照组：25μLPHA-E(倍比稀释)+25μLPBS+25μL兔红血球溶液；

多肽处理组：25μLPHA-E(倍比稀释)+25μL多肽+25μL兔红血球溶液；

空白对照组：25μL多肽+25μLPBS+25μL兔红血球溶液。

具体实施方式

为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。

实施例1

阻止菜豆凝集素聚合并抑制凝血毒性的多肽(以下简称：抗凝血多肽或者抗凝血多肽SFIVS)的合成

1)以外源菜豆凝集素PHA-E为基础设计抗凝血多肽的理论基础：

如图1所示：抗凝血多肽SFIVS和外源菜豆凝集素PHA-E单体结合强度最高的前10个结构中有7个结构，其抗凝血多肽位于菜豆凝集素的二聚体结合面。上述结果表明抗凝血多肽SFIVS和另一个菜豆凝集素单体结构有较强的竞争关系，能减少菜豆凝集素形成二聚体复合物的几率，从而会降低菜豆凝集素的凝血毒性。

2)抗凝血多肽SFIVS多肽设计，主要包括分析二聚体复合物结构和设计多肽抑制剂两个部分，具体步骤如下：

(A)选择菜豆凝集素复合物结构(PDBcode:3WCR)；

(B)分析该复合物结构中单体和单体间接触面上的三级相互作用情况；

(C)选取接触面上相互作用较多的序列进行模拟分析；

(D)根据(C)中的分析结果设计多肽，并与菜豆凝集素单体结构进行分子对接模拟分析(ZDock)；

(E)选取(D)中相互作用较多，结合强度较强的多肽(丝氨酸-苯丙氨酸-异亮氨酸-缬氨酸-丝氨酸)作为菜豆凝集素的抗凝血多肽。

3)抗凝血多肽合成，具体步骤如下：

(A)Fmoc固相合成(利用美国PTITirbute-UV多肽合成仪合成)：

首先将Fmoc-Ser(tBu)-Wang(1.2g，0.5mmol)树脂用NMP(5ml)溶胀1小时，20％哌啶/NMP(3mL)处理5min脱除树脂的Fmoc保护基(UV检测反应进程)，连接第一个氨基酸缬氨酸，将Fmoc-Val-OH(1.7g，5mmol，10eq)，HBTU(2.0g，5mmol，10eq)，HOBt(0.675g，5mmol，10eq)溶于0.4mol/LDIPEA/NMP溶液中(3mL)，将混合液加入已脱除Fmoc保护基的Wang树脂中，搅拌20min，抽干后NMP(4mL)洗三次，20％哌啶/NMP(3mL)处理5min脱除氨基酸上的Fmoc保护基(UV检测反应进行)，同样的方法依次连接异亮氨酸、苯丙氨酸和丝氨酸。

(B)树脂裂解和去保护

将已连接5个氨基酸的多肽从多肽合成仪的反应器中取出，放入20mL的圆底烧瓶，加入10mL预先配好的裂解液(三氟乙酸95％、三异丙基硅烷2.5％、水2.5％)，密闭，然后放在磁力搅拌器上室温下搅拌2h。反应完后，过滤，收集过滤液。再以1mL三氟乙酸洗涤剩余树脂2次，收集滤液。将滤液平均放入两个50mL的离心管，分别加入40mL预先冷冻的乙醚，离心10min，转速5000rpm，将离心液倒出，得到的固体再用冷冻的乙醚洗3次，收集所得固体，即得到粗产品。

4)抗凝血多肽的纯化，具体步骤如下：

将上述得到的粗产品溶于4mL0.05％三氟乙酸/乙腈溶液中，利用岛津LC-20AT半制备高效反向液相色谱仪进行分离提纯。选用InertsilODS-SPC18反向色谱柱(15μm，20mm×25cm)，流动相组成为：A液，0.05％三氟乙酸/水；B液，0.05％三氟乙酸/乙腈；梯度设置：B液5→65％，时间1h，流速5mL/min，进样量0.5mL。486检测器检测220nm吸收峰，并分段收集.注意主峰出现的位置、峰形，收集主峰析出液。将收集的样品溶液倒入50mL的离心管中，利用液氮将其冷冻成固体状态，放入冷冻干燥机上冻干，即得到纯化后的抗凝血多肽。

5)抗凝血多肽的鉴定

将上述纯化得到的多肽取少量溶于0.05％三氟乙酸/乙腈中，利用岛津LC-29AD分析型高效液相色谱柱进行纯度鉴定。选用InertsilODS-SPC18反向色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)，流动相组成为：A液，0.05％三氟乙酸/水；B液，0.05％三氟乙酸/乙腈；梯度设置：B液5→65％，时间15min，流速1mL/min，进样量10μL。

如图2所示：486检测器检测220nm吸收峰。

如图，将上述纯化所得的多肽通过布鲁克amaZonSL质谱仪检测其分子量，电离方式为ESI正离子模式，多肽Ser-Phe-Ile-Val-Ser理论分子量[M+H]⁺为552.30Da。测得的分子量为552.45Da，与理论值相符。

实施例2

菜豆凝集素凝血毒性测定方法

1)对检测用红细胞悬液进行细胞定量，具体步骤如下：

(A)采集新鲜兔血置于5％～10％枸橼酸钠抗凝剂中，与4倍体积阿氏(Alsever’s)液混匀后置于4摄氏度冰箱保存备用。

(B)将步骤(A)得到的新鲜兔血与生理盐水按5:8的比例缓慢混匀，1000rpm离心5分钟，收集沉淀。

(C)重复上述步骤洗涤红细胞，至上清液颜色近乎透明后，按红细胞体积配成20％的红细胞悬液。

(D)取步骤(C)得到的红细胞悬液经生理盐水稀释后计数红细胞，并调整红细胞浓度为5×10⁷个/ml-5×10⁸个/mL，4摄氏度冰箱保存备用。优选地，所述步骤(A)中得到的新鲜兔血保存备用不得超过14天。

2)用已知浓度的菜豆凝集素作为标准品进行凝血活性检测，具体步骤如下：

(a)阳性对照组菜豆凝集素标准溶液的倍比稀释：向“V”型血凝板中每孔中加入25μLPBS(pH7.2,0.2mol/L)缓冲液，然后吸取菜豆凝集素标准溶液(0.05mg/mL)25μL加入到“V”型血凝板的第一孔，混合后吸取25μL混合液加入到第二孔，混合后亦取出25μL加入到第三孔，以此类推作倍比稀释。(b)作为阳性对照组的凝集素倍比稀释液中，每孔再加入25μLPBS。

(c)空白对照组中仅加入PBS。

(d)微微摇动血凝板使其混匀。每孔加入25μL20％红细胞悬液，加毕后继续摇动1min，室温置放1h。用肉眼观察凝集素标准溶液的凝集反应情况。

注：将凝集程度分为5个等级，从低到高分别以0、1、2、3、4表示。

4：红细胞完全凝集，呈一层薄膜片状，均匀地分布在整个孔中，且边缘不整齐。

3：红细胞大部分凝集，但不成膜状，周边有较窄的透明带，且有未凝集的红细胞沉淀于孔底成红色小圆点状。

2：红细胞部分凝集，周边有较宽的透明带，且有未凝集的红细胞沉淀于孔底成红色圆点状，且相当于空白对照组的50％。

1：红细胞大部分不凝集，有可见凝集颗粒，未凝集的红细胞沉淀于孔底成红色圆形状。

0：红细胞完全不凝集，全部沉淀于孔底成大的圆形状，与空白对照组完全相同。

实施例3

抗凝血多肽活性检测，具体步骤如下：

(A)上述得到的抗凝血多肽的粉末用PBS缓冲液配成终浓度为0.05mg/mL的溶液，超声波助溶；

(B)依照上述(a)步骤倍比稀释菜豆凝集素标准溶液后，每孔加入25μL0.05mg/mL的多肽溶液，加毕后继续摇动1min，室温置放30min待其充分结合；

(C))重复步骤(d)，用肉眼观察凝集反应情况并与对照组相比判断其凝集程度。

上述方法，分别检测菜豆凝集素标准品、多肽处理组(3个重复)、以及仅有多肽的空白对照组与兔血细胞之间的凝集反应，肉眼观察并记录。

结果表明阳性对照组中的PHA-E倍比稀释至第4格时，仍有凝集血细胞的能力，而相同浓度下的多肽处理组样品中，由于多肽SFIVS与PHA-E部分结合，降低了PHA-E的凝血活性，第4格中没有凝集现象出现，与空白对照相同，血细胞自然沉降(图4)

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。