一种从藜麦中制备γ-氨基丁酸的工艺

摘要

本发明公开一种从藜麦中制备γ-氨基丁酸的工艺。所述工艺包括：选用优质藜麦为原料，用亚硫酸钠溶液进行清洗；在低温、低氧的条件下对洗净后的藜麦进行发芽处理；将发芽后的藜麦进行干燥、粉碎，得到藜麦粉体；以乙醇为溶剂对藜麦粉体进行粗提取得到粗提取产物，再结合超临界提取法萃取粗提取产物中的γ-氨基丁酸，得到最终提取物。本发明从原料选择及前处理、发芽富集、γ-氨基丁酸提取三个环节出发来提出一种从藜麦中制备γ-氨基丁酸的工艺，工艺操作简单，产量高，制备的γ-氨基丁酸安全性较生物合成法以及化学合成法相对较高，适宜工业化生产γ-氨基丁酸。

说明书

技术领域

本发明涉及γ-氨基丁酸的制备领域。更具体地，涉及一种从藜麦中制 备γ-氨基丁酸的工艺。

背景技术

随着社会的发展与进步，人们的生活水平以及收入水平均得到大幅度的 提高，由于工作、学习、生活等因素引起的紧张、压力等问题也逐渐增加， 已经在社会人群中普遍存在。长期处于高压焦虑的状态，人们将会陷入亚健 康状态之中，其中最为典型的现象即为失眠、多梦。γ-氨基丁酸作为一种 非蛋白组成的天然活性氨基酸具有舒缓压力、放松心情、提高脑活力等功 效，对焦虑、失眠、多梦等现象具有一定的缓解效果，在国外已经被广泛应 用。

目前，不同领域学者对γ-氨基丁酸的研究主要集中在原料选择、提取 方法以及制备工艺等某一方面。制备γ-氨基丁酸的合成方法主要有三种， 分别为化学合成法、植物富集法以及微生物发酵法。化学合成法主要通过γ -氯丁氰的取代水解反应实现，将邻苯二甲酰亚胺钾与γ-氯丁氰在180摄氏 度下反应，然后将产物与浓硫酸回流，经结晶提纯而得，合成γ-氨基丁酸 效率极高，但是反应条件剧烈、所选试剂危险性较大、安全性较低，彻底清 除制作过程中所引进的化学成分的相关操作工艺尚未探究成功；微生物合成 法主要以谷氨酸或其衍生物谷氨酸钠为原料，利用酵母菌、乳酸菌和曲霉菌 等食品安全级微生物发酵制得，整个制备过程始终处于一个复杂的微生物体 系之中，很难准确控制整个发酵代谢过程中的产物，可能产生对人体有害的 代谢产物，存在一定的安全问题；相对而言，植物富集法操作简单、引入化 学成分较少，反应体系单一，从而具有较高的安全性。

当前的植物富集方法以发芽糙米为主，大多数结合盐离子胁迫增加所制 得发芽糙米中γ-氨基丁酸的含量，从而引进金属离子，导致相应产品中重金 属超标。因此，需要提供一种工艺操作简单，产量高，制备的γ-氨基丁酸 安全性较生物合成法以及化学合成法相对较高，适宜工业化的γ-氨基丁酸 的生产工艺。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从藜麦中制备γ-氨基丁酸的工艺。本发明意 在提出一种在保证安全性的基础上提高γ-氨基丁酸产量的整体方法。

现有技术中，制备γ-氨基丁酸的合成方法主要有三种，分别为化学合 成法、植物富集法以及微生物发酵法。其中，植物富集法操作简单、引入化 学成分较少，反应体系单一，具有较高的安全性。目前的植物富集方法以发 芽糙米为主，大多数结合盐离子胁迫增加所制得发芽糙米中γ-氨基丁酸的 含量，但是安全条件下保证高γ-氨基丁酸含量的离子浓度及添加方式有待 探讨。除此之外，所加钙离子很容易富集在产品中，造成钙含量超标，有一 定的风险。众多研究表明，增加钙胁迫操作将有助于γ-氨基丁酸的富集。 钙在γ-氨基丁酸的富集中可起到胁迫的作用。基于此，发明选择钙含量较 高的藜麦为原料，一般的糙米中的钙含量为0.012％，而藜麦中的钙含量可以 高达0.148％，通过优化藜麦的发芽条件(低温、低氧)，利用其在发芽过程 中γ-氨基丁酸的富集，而且钙含量在安全范围内，有效的避免重金属超 标。再配合后期对γ-氨基丁酸提取工艺参数的调整(醇提、旋转蒸发、冷冻 干燥以及超临界提取法萃取)，能够得到安全性高且纯度高的最终提取物。

同时，藜麦营养价值丰富，已经被联合国粮农组织公认为唯一一种满足 人体营养需求的单体植物，被誉为丢失的“营养黄金”，其所含的蛋白质、膳 食纤维、矿物质含量均高于其他粮食谷物，本发明利用藜麦中钙含量高的特 点将其进行发芽工艺的优化调整、有针对性的改善提取工艺，从而制得γ-氨 基丁酸。

为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种从藜麦中制备γ-氨基丁酸的工艺，包括如下步骤：

选用优质藜麦为原料，用亚硫酸钠溶液进行清洗；

在低温、低氧的条件下对洗净后的藜麦进行发芽处理；

将发芽后的藜麦进行干燥、粉碎，得到藜麦粉体；

以乙醇为溶剂对藜麦粉体进行粗提取得到粗提取产物，再结合超临界提 取法萃取粗提取产物中的γ-氨基丁酸，得到最终提取物。

优选地，所述优质藜麦为钙含量高于0.14％的藜麦。

优选地，清洗藜麦所用的亚硫酸钠溶液的浓度为0.1-0.4％。

优选地，对藜麦进行发芽处理的过程包括：

加入藜麦自身重量的1.3-1.5倍的超纯水，在30-35℃无菌条件下浸泡 10-12小时；

沥去藜麦中的水分，盖上纱布，于35-40℃无菌条件下发芽25-28h，期间 始终保持纱布为湿润状态。此过程一方面由于藜麦自身钙含量高，另一方面 通过对发芽的条件进行针对性的调整，使得发芽效率得到相应提升，发芽率 从普通的55％能够提升并基本维持在65％。

优选地，发芽后藜麦的干燥温度为70-75℃，干燥3.5-4.5h后粉碎，粉碎 后过70-80目筛，得到藜麦粉体。

优选地，所述乙醇粗提取的过程为：用浓度为70-75％的乙醇为溶剂提取 藜麦粉体3.5-4.5h，过滤得到滤液，将滤液进行浓缩，至最初体积的13-15％， 再将浓缩后的滤液进行冷冻干燥得到粗提取产物。

优选地，所述超临界提取法全过程为：将冷冻干燥得到的粗提取产物放 入萃取容器，设定温度为28-30℃，通入提携剂与二氧化碳混合后的混合流体， 控制压力为32-33Mpa，混合流体的流量为34-35L/h条件下进行萃取，整个 过程中保持环境卫生。

优选地，所述提携剂的加入量为待提取物重量的20-30％；所述提携剂为 水和乙醇按照5:1-7:1混合的混合溶液。

优选地，所述工艺包括如下具体步骤：

1)选用钙含量高于0.19％的藜麦为原料，用浓度为0.1-0.4％的亚硫酸钠 溶液进行清洗；

2)加入藜麦自身重量的1.3-1.5倍的超纯水，在30-35℃无菌条件下浸泡 11-12小时；

3)沥去藜麦中的水分，盖上3层纱布，于35-40℃无菌条件下发芽25-28 小时，期间始终保持纱布为湿润状态；

4)将发芽后的藜麦在70-75℃温度下干燥，粉碎，过70-80目筛，得到 藜麦粉体；

5)用浓度为70-75％的乙醇为溶剂提取藜麦粉体3.5-4.5h，过滤得到滤液， 将滤液进行浓缩，至最初体积的13-15％，再将浓缩后的滤液进行冷冻干燥操 作得到粗提取产物；所述过滤的方式为采用0.45μm的微孔过滤膜进行过滤；

6)将低温干燥得到的粗提取产物放入萃取容器，设定温度为28-30℃， 通入提携剂与二氧化碳混合后的混合流体，控制压力为32-33Mpa，混合流体 的流量为34-35L/h条件下进行萃取，整个过程中保持环境卫生；所述提携剂 的加入量为待提取物重量的20-30％；所述提携剂为水和乙醇按照5:1-7:1混合 的混合溶液；

7)将萃取得到的产物在80-83℃加热60-65min进行杀菌，即制得最终提 取物。

本发明的对提取过程的工艺进行了针对性的调整，提取过程首先采用乙 醇为溶剂粗提取，经过旋转蒸发及冷冻干燥得到粗提取产物，再结合超临界 提取法萃取粗提取产物中的γ-氨基丁酸。首先采用醇提是为了降低化学物质 的含量，乙醇作为一种易于挥发的有机溶剂，相对于其他有机溶剂是较为安 全的，已经被用于食品、医药、化妆品等众多领域，很容易在后续工序中挥 发干净，保证最终产物的安全性；接着采用旋转蒸发结合冷冻干燥得到粗产 物的目的是进一步除去提取剂，提高提取物的浓度；最后运用超临界提取法 萃取的目的在于在超临界状态下γ-氨基丁酸提取物的含量将会提高。并且对 工艺参数进行了具体的限定，通过步骤间的相互配合，最终在藜麦中提取高 安全性、高提取率的γ-氨基丁酸。

一种采用如上所述的从藜麦中制备γ-氨基丁酸的工艺制备得到的最终 提取物，所述最终提取物中γ-氨基丁酸的含量大于85％。

本发明从原料选择及前处理、发芽富集、γ-氨基丁酸提取三个环节出发 来提出一种从藜麦中制备γ-氨基丁酸的工艺。本发明首次提出以藜麦作为提 取γ-氨基丁酸的原料，并且对制备工艺进行相关优化和探索。选择了利于发 芽富集γ-氨基丁酸的原料以及利于富集γ-氨基丁酸的发芽条件(低温低氧)； 选用低温干燥方法，即在70℃下进行干燥，现有技术中为保证干燥程度大部 分提取中选择95℃以上的干燥温度，而本提取方法为保证γ氨基丁酸的活性， 仅选择70℃为干燥温度，在保证了同样的干燥效果外更利于获取高活性的γ- 氨基丁酸；采用高新技术提取，选择安全提取溶剂(提取过程首先采用乙醇 为溶剂粗提取，经过旋转蒸发及冷冻干燥得到粗提取产物，再结合超临界提 取法萃取粗提取产物中的γ-氨基丁酸)；并且采用安全的灭菌方法，来得到 γ-氨基丁酸的含量大于85％的最终提取物(现有技术中采用植物富集法制备 的提取物中γ-氨基丁酸的含量一般为20％-75％)。

本发明的有益效果如下：

本发明提供一种从藜麦中提取γ-氨基丁酸的方法，工艺操作简单，产量 高，制备的γ-氨基丁酸安全性较生物合成法以及化学合成法相对较高，适宜 工业化生产γ-氨基丁酸。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

图1示出本发明实施例7中吊桥实验的γ-氨基丁酸舒压试验结果图。

图2示出本发明实施例7中地铁试验的γ-氨基丁酸舒压试验结果图。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一 步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员 应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制 本发明的保护范围。

实施例1

一种从藜麦中制备γ-氨基丁酸的工艺，包括如下具体步骤：

第1步，选取优质的藜麦1000g(钙含量高于0.19％)，用0.2％的亚硫酸 氢钠，将其洗净。

第2步，加入1500mL超纯水，在30℃无菌条件下浸泡12h。

第3步，沥去水分，盖上3层湿纱布，于40℃无菌低氧条件下发芽25h (不断补充水分，始终保持纱布为湿润状态)。

第4步，70℃干燥4.5h，将其粉碎，过80目筛。

第5步，密封，4℃无菌状态下保存，待用。

第6步，75％乙醇为溶剂提取3.5h，过0.45μm的微孔过滤膜，将滤液 进行旋转蒸发操作，至仅有最初的15％。

第7步，将低温干燥完成后的粉末放进萃取釜中，将其温度设定为30℃， 通入提携剂与二氧化碳混合后的混合流体，按照待提取物重量的20％添加提 携剂(水和乙醇按照5:1混合均匀)，控制压力为32Mpa，混合流体的流量为 35L/h条件下进行萃取，整个过程中保持环境卫生。

第8步，80℃加热60min杀菌，得到最终提取物。

实施例2

一种从藜麦中制备γ-氨基丁酸的工艺，包括如下具体步骤：

第1步，选取优质的藜麦1000g(钙含量高于0.14％)，用0.1％的亚硫酸 氢钠，将其洗净。

第2步，加入1300mL超纯水，在30℃无菌条件下浸泡11h。

第3步，沥去水分，盖上3层湿纱布，于35℃无菌低氧条件下发芽25h (不断补充水分，始终保持纱布为湿润状态)。

第4步，70℃干燥3.5h，将其粉碎，过70目筛。

第5步，密封，4℃无菌状态下保存，待用。

第6步，70％乙醇为溶剂提取3.5h，过0.45μm的微孔过滤膜，将滤液 进行旋转蒸发操作，至仅有最初的13％。

第7步，将冷冻干燥完成后的粉末放进萃取釜中，将其温度设定为28℃， 通入提携剂与二氧化碳混合后的混合流体，按照待提取物重量的20％添加提 携剂(水和乙醇按照5:1混合均匀)，控制压力为32Mpa，混合流体的流量为 34L/h条件下进行萃取，整个过程中保持环境卫生。

第8步，80℃加热60min杀菌，得到最终提取物。

实施例3

一种从藜麦中制备γ-氨基丁酸的工艺，包括如下具体步骤：

第1步，选取优质的藜麦1000g(钙含量高于0.14％)，用0.4％的亚硫酸 氢钠，将其洗净。

第2步，加入1500mL超纯水，在35℃无菌条件下浸泡12h。

第3步，沥去水分，盖上3层湿纱布，于40℃无菌低氧条件下发芽28h (不断补充水分，始终保持纱布为湿润状态)。

第4步，75℃干燥4.5h，将其粉碎，过80目筛。

第5步，密封，4℃无菌状态下保存，待用。

第6步，75％乙醇为溶剂提取4.5h，过0.45μm的微孔过滤膜，将滤液 进行旋转蒸发操作，至仅有最初的15％。

第7步，将低温干燥完成后的粉末放进萃取釜中，将其温度设定为30℃， 通入提携剂与二氧化碳混合后的混合流体，按照待提取物重量的30％添加提 携剂(水和甲醇按照7:1混合均匀)，控制压力为33Mpa，混合流体的流量为 35L/h条件下进行萃取，整个过程中保持环境卫生。

第8步，83℃加热65min杀菌，得到最终提取物。

实施例4

一种从藜麦中制备γ-氨基丁酸的工艺，包括如下具体步骤：

第1步，选取优质的藜麦1000g，用0.2％的亚硫酸氢钠，将其洗净。

第2步，加入1500mL超纯水，在35℃无菌条件下浸泡11h。

第3步，沥去水分，盖上3层湿纱布，于40℃无菌低氧条件下发芽25h (不断补充水分，始终保持纱布为湿润状态)。

第4步，75℃干燥4h，将其粉碎，过80目筛。

第5步，密封，4℃无菌状态下保存，待用。

第6步，70％乙醇为溶剂提取4.5h，过0.45μm的微孔过滤膜，将滤液 进行旋转蒸发操作，至仅有最初的15％。

第7步，将低温干燥完成后的粉末放进萃取釜中，将其温度设定为28℃， 通入提携剂与二氧化碳混合后的混合流体，按照待提取物重量的20％添加提 携剂(水和乙醇按照7:1混合均匀)，控制压力为32Mpa，混合流体的流量为 34L/h条件下进行萃取，整个过程中保持环境卫生。

第8步，80℃加热60min杀菌，得到最终提取物。

实施例5

一种从藜麦中制备γ-氨基丁酸的工艺，包括如下具体步骤：

第1步，选取优质的藜麦1000g，用0.2％的亚硫酸氢钠，将其洗净。

第2步，加入1500mL超纯水，在35℃无菌条件下浸泡10h。

第3步，沥去水分，盖上3层湿纱布，于35℃无菌低氧条件下发芽28h (不断补充水分，始终保持纱布为湿润状态)。

第4步，75℃干燥4h，将其粉碎，过80目筛。

第5步，密封，4℃无菌状态下保存，待用。

第6步，75％乙醇为溶剂提取3.5h，过0.45μm的微孔过滤膜，将滤液 进行旋转蒸发操作，至仅有最初的15％。

第7步，将低温干燥完成后的粉末放进萃取釜中，将其温度设定为30℃， 通入提携剂与二氧化碳混合后的混合流体，按照待提取物重量的30％添加提 携剂(水和甲醇按照5:1混合均匀)，控制压力为33Mpa，混合流体的流量为 35L/h条件下进行萃取，整个过程中保持环境卫生。

第8步，80℃加热60min杀菌，得到最终提取物。

对比例1

一种从藜麦中制备γ-氨基丁酸的工艺，包括如下具体步骤：

第1步，选取优质的藜麦1000g，用0.2％的亚硫酸氢钠，将其洗净。

第2步，加入1500mL超纯水。

第3步，75℃干燥4h，将其粉碎，过80目筛。

第5步，密封，4℃无菌状态下保存，待用。

第6步，采用纯净水为溶剂对上述粉碎后的藜麦粉体提取3.5h，过0.45μm 的微孔过滤膜，将滤液进行旋转蒸发操作，至水分含量1％。

实施例6

实施例1-5制备的最终提取物中γ-氨基丁酸含量测定：

参考张晖等人方法略做改动，准确称取0.5mg最终提取物，以甲醇为提 取液定容至10ml，摇匀离心，上清液再浓缩至2ml，备用。

色谱条件

(1)泵：四元梯度泵，流速1.0ml/min。

(2)AgilentTC-C₁₈(4.6×250mm，5μm)柱温40℃。

(3)流动相：A相，1.6gNaAC·3H₂O，pH7.20，1000ml；B相，1.6 gNaAC·3H₂O，pH7.20，200ml；甲醇400ml；乙腈400ml。

(4)检测波长：334nm。

(5)自动衍生化步骤如表1所示。

(6)梯度洗脱如表2所示。

表1自动衍生化步骤

步骤 动作目的 吸量/uL 1 吸硼酸缓冲液 5.0 2 吸OPA 1.0 3 吸水 0.0 4 吸样品 2.0 5 吸水 0.0 6 原位混合 7 吸Fmoc-Cl 1.0 8 吸水 0.0 9 原位混合 10 进样

表2梯度洗脱程序

时间/min A/％(体积) B/％(体积) 流速/mL min^-10 50.0 50 1.0

11 50.0 50 1.0 12 0 100 1.0 14 0 100 1.0

注：OPA——邻苯二甲醛-巯基乙醇；FMOC-CL——芴甲氧羰基氯

结果计算：

样品中γ-氨基丁酸含量按下式计算

X＝[(C×V)/M]×100

式中：

X：样品中γ-氨基丁酸含量，mg/100g；

C：提取液中γ-氨基丁酸的浓度，mg/ml；

V：提取液定容后的体积，ml；

M：样品的质量，g；

100：100克样品中的含量。

结果

经以上方法测定后，实施例1-5中制备的最终提取物中γ氨基丁酸含量 分别高达87.2％、87％、87.9％、85.2％和88.5％。对比例1中制备的最终提取 物中γ氨基丁酸含量只有20％。

实施例7

本发明实施例5制备的γ-氨基丁酸功效验证试验，并与对比例1制备的 γ-氨基丁酸做对比：

当人体处于压力状态下，唾液将会分泌嗜铬粒蛋白A，可以将其指定为 压力衡量指标，衡量其紧张状态。

1.吊桥实验

选取40名恐高患者，每10人一组分为4组，使其通过同一架吊桥，分 别测定上桥、桥中以及下桥3个状态下所有受试者唾液中嗜铬粒蛋白A的含 量，对其紧张度进行测试，以未服用γ-氨基丁酸的人群作为对照组。第一组 为对照组：实验前30min服用5mL水；第二组为低剂量组：实验前30min服 用5mL浓度为10mg/mL的γ-氨基丁酸溶液；第三组为中剂量组：实验前 30min服用5mL浓度为20mg/mL的γ-氨基丁酸溶液；第四组为高剂量组： 实验前30min服用5mL浓度为30mg/mL的γ-氨基丁酸溶液。记录不同阶段 测试者唾液中嗜铬粒蛋白A的含量，最终结果以每组平均值表示。

该测试结果如图1所示，由γ-氨基丁酸缓解压力实验结果可知，与对照 组相比，整个实验过程中低剂量组、中剂量组、低剂量组受试人群唾液中嗜 铬粒蛋白A变化幅度均小于对照组，且桥中状态时，低剂量组、中剂量组、 高剂量组受试人群唾液中嗜铬粒蛋白A含量均低于对照组，且依次降低，说 明γ-氨基丁酸对人群的紧张情绪具有一定缓解效果，且与含量相关。

2.地铁试验

分别选取年龄在15-18岁、25-28岁、35-38岁、45-48岁之间的受试者 20名，每10名一组，每个年龄段分三个组，使其在同一高峰时间通过同一列 地铁，分别测定15min后其唾液中嗜铬粒蛋白A的分泌情况，每个年龄段中 的第一组为对照组1：每名受试者在实验前30min服用5mL水；第二组为对 照组2：每名受试者在实验前30min服用5mL对比例1制备的浓度为30mg/mL 的γ-氨基丁酸溶液；而第三组为实验组：每名受试者在实验前30min服用5mL 本发明实施例5制备的浓度为30mg/mL的γ-氨基丁酸溶液，分别对其紧张度 进行测试。记录不同阶段测试者唾液中嗜铬粒蛋白A的含量，最终结果以每 组平均值表示。

该测试结果如图2所示，由γ-氨基丁酸缓解压力实验结果可知，与对照 组1和2相比，所有年龄段的试验组人群的唾液嗜铬粒蛋白A变化率均低于 对照组，说明γ-氨基丁酸对人群的紧张情绪具有一定缓解效果。

将本发明实施例2-5制备的γ-氨基丁酸进行如上所述的功效验证试验， 其实验结果如实施例7所示结果相似。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而 并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在 上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有 的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变 化或变动仍处于本发明的保护范围之列。