一种用于大肠杆菌定量检测的选择性培养基及大肠杆菌定量检测方法

摘要

一种用于大肠杆菌定量检测的选择性培养基及大肠杆菌定量检测方法。所述的选择性培养基的组成为：乳糖：10～26g/L，蛋白胨：15～25g/L，牛胆盐：1～7g/L，羧甲基纤维素钠：0.01～0.90g/L，氯化钠:2～7g/L，磷酸氢二钾：2.5～7.5g/L。用于大肠杆菌定量检测的选择性培养基定量检测大肠杆菌的方法，将待检测细菌样品接种到上述用于大肠杆菌定量检测的选择性培养基中，于无氧条件下，25-44℃，150-280rpm，培养7-15h后检测菌液pH值，根据菌液pH值和大肠杆菌初始浓度关系标准曲线计算出样品中大肠杆菌的数量。本发明方法用于大肠杆菌的定量检测，快速、准确、灵敏度高。

说明书

技术领域

本发明属于微生物的定量检测技术领域，特别是涉及一种快速、低成本、高灵敏度的用于大肠杆菌定量检测的选择性培养基及大肠杆菌定量检测方法。

背景技术

大肠杆菌是水体污染程度的重要指示菌，是肠道中最普遍、数量最多的一类细菌，近年来，由于大肠杆菌引发的食品安全事件层出不穷，每年由大肠杆菌引发的病例多达6.4亿，在我国，大肠杆菌是引起我国居民腹泻的首要病源，环境中的大肠杆菌己经成为人类病原存在的一个重要指标,成为环境保护、食品卫生、饮水卫生和流行性病学领域中最重要的研究对象之一。饮用水或食物中的大肠杆菌可引发霍乱、伤寒、痢疾等肠道疾病。因此快速准确的检测大肠杆菌的数量在环境水质监测与食品安全中有着重大的意义。

目前大肠杆菌检测的技术包括：平板计数法、PCR、基因芯片、生物传感器、紫外可见分光光度检测法、胶体金免疫侧吸检测试纸条、脉冲场凝胶电泳分析、乳胶凝集试验等，以上的检测方法各有利弊，常规培养检测法耗时且工作量大，新兴的检测技术对仪器设备操作等要求较高，并且一些检测灵敏度受到限制，分子生物学方法，如PCR存在不能区分死菌或者活菌的缺陷，使检测结果具有假阴性。因此急需一种快速、简单、高灵敏的检测方法。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供了一种用于大肠杆菌定量检测的选择性培养基及大肠杆菌定量检测方法。本发明方法用于大肠杆菌的定量检测，快速、准确、灵敏度高。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种用于大肠杆菌定量检测的选择性培养基，其特征在于，所述的选择性培养基的组成为：乳糖：10～26g/L，蛋白胨：15～25g/L，牛胆盐：1～7g/L，羧甲基纤维素钠：0.01～0.90g/L，氯化钠:2～7g/L，磷酸氢二钾：2.5～7.5g/L。

根据以上方案，所述的选择性培养基组成优选为：乳糖：25g/L，蛋白胨:15g/L，牛胆盐：2g/L，羧甲基纤维素钠：0.15g/L，氯化钠：2.5g/L，磷酸氢二钾：4g/L。

提供一种上述选择性培养基的制备方法，步骤如下：

(1)按照配方将乳糖、蛋白胨、牛胆盐、羧甲基纤维素钠，氯化钠和磷酸氢二钾加热溶解后定容；

(2)混匀，高压灭菌而得。

根据上述方案，所述的高压灭菌100℃-150℃，灭菌时间10-25min。

利用上述用于大肠杆菌定量检测的选择性培养基定量检测大肠杆菌的方法，步骤如下：将待检测细菌样品接种到上述用于大肠杆菌定量检测的选择性培养基中，于无氧条件下，25-44℃，150-280rpm，培养7-15h后检测菌液pH值，根据菌液pH值和大肠杆菌初始浓度关系标准曲线计算出样品中大肠杆菌的数量。

根据上述方案，所述接种的方法为将用于大肠杆菌定量检测的选择性培养基分装于试管，每只试管5-15ml，接种5-10μl待检测细菌样品到选择性培养液中。

根据上述方案，培养条件优选为：30-39℃，200-250rpm。

根据上述方案，接种培养10-14h后检测菌液pH值。

按上述方案，所述菌液pH值和大肠杆菌初始浓度关系标准曲线的获得方法如下：

a.配制一系列浓度的大肠杆菌溶液；

b.将待检测细菌样品接种到选择性培养基中，25-44℃，150-280rpm，培养7-15h后检测菌液pH值：

c.拟合得到菌液pH值和大肠杆菌初始浓度关系标准曲线c(x，y)——x大肠杆菌初始浓度，y为菌液pH值。

按上述方案，所述菌液pH值和大肠杆菌初始浓度关系标准曲线中一系列细菌样品的浓度范围是：1-10000cfu/ml。

按上述方案，所述步骤c拟合时，对大浓度段进行单独拟合得到大浓度时菌液pH值和大肠杆菌初始浓度的对数值的线性关系曲线c₂(x₂，y₂)——x₂大肠杆菌初始浓度的对数值，y₂为菌液pH值；所述的大浓度是：大肠杆菌的浓度位于10-10000cfu/ml；

相应地，在求算待测样品中大肠杆菌初始浓度时根据菌液pH值，选用大浓度时菌液pH值和大肠杆菌初始浓度的关系曲线的关系曲线c₂(x₂，y₂)，结合培养该待测样品后的菌液的pH值计算待测样品中大肠杆菌初始浓度。

大肠杆菌在没有葡萄糖做碳源、无氧条件下，能够把乳糖分解成乳酸等酸性物质，使培养基的pH下降。据此我们特别设计了一种大肠杆菌选择性培养基，具体地，本发明的培养基中选用了乳糖作碳源，可起到抑制除大肠杆菌以外其他细菌的生长；此外，通过添加抑菌剂牛胆盐，可利用牛胆盐对革兰氏阳性菌具有良好的抑制作用，使培养基的大肠杆菌选择性更好；另通过添加羧甲基纤维素钠，可以增加液体培养的黏度，使细菌能够均匀的在培养基中生长等。经我们研究发现；这种选择性培养基可促进大肠杆菌的培养，进而对大肠杆菌生长一定时间后的这种培养基的pH进行检测发现：一定范围内不同浓度的大肠杆菌接种到该选择性培养基上培养一定的时间后，pH与大肠杆菌初始浓度呈现一定的指数关系。据此，我们提供了一种利用上述用于大肠杆菌定量检测的选择性培养基定量检测大肠杆菌的方法。该方法用于大肠杆菌的定量检测，快速、准确、灵敏度高(可以检测到的数量级是：1cfu/ml)。

相对于现有技术，本发明具有以下优点：

(1)使用pH计检测培养后菌液pH，利用pH与大肠杆菌初始浓度关系，进行大肠杆菌的定量检测，快速、准确、灵敏度高(可以检测到的数量级是：1cfu/ml)；

(2)更加方便快捷，降低成本；

(3)本发明提供的大肠杆菌培养基是一种选择性液体培养基，环境和食品中常见致病菌如金黄色葡萄球菌，沙门氏菌，无乳链球菌，单增李斯特氏菌等都无法在该培养基上生长，能够专一性的应用到食品和环境中大肠杆菌的检测。

附图说明

图1是不同初始浓度的细菌在发明的选择性培养基上生长13h后的体系pH值；

图2是大肠杆菌初始浓度的对数值与pH之间的关系图；

图1中R²＝0.99939，关系式是y＝A₁*exp(-x/t₁)+A₂*exp(-x/t₂)+y₀其中A₁的值是0.94394，t₁的值是78.40394，A₂的值是0.99396，t₂的值是627.35178，y₀的值是5.05955，y＝0.94394*e^{(-x/78.40394)}+0.99396*e^{(-x/627.35178)}+5.05955，x大肠杆菌初始浓度，y为菌液pH值；

图2为大浓度时菌液pH值和大肠杆菌初始浓度的对数值的线性关系式是y＝a+bx，其中R²＝0.99252。其中a的值是7.89257，b的值是-0.87011，y＝7.89257-0.87011x，x大肠杆菌初始浓度对数值，y为菌液pH值。

具体实施方式

为更好理解本发明，以下结合实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明要求保护的范围并不局限于实施例表示的范围。

实施例1：

用于大肠杆菌定量检测的选择性培养基的制备：

取乳糖12.5g，蛋白胨7.5g，牛胆盐1g，羧甲基纤维素钠0.075g，氯化钠1.25g，磷酸氢二钾2g，加入适量的去离子水，加热搅拌使其溶解，全部溶化后，补足因蒸发而失去的水分到500ml；

混匀，115℃高压灭菌15min，得大肠杆菌选择性培养基，备用。利用上述用于大肠杆菌定量检测的选择性培养基定量检测大肠杆菌的方法：

(1)菌液pH值和大肠杆菌初始浓度关系标准曲线的获得：

配制一系列浓度(2-2000cfu/ml)的大肠杆菌溶液：取8个50ml的离心管，编号后，每个离心管里加9ml生理盐水，用移液枪取1ml待稀释菌液加到1号管中，吹打70次，使大肠杆菌充分分散，即成10^-1稀释液，从1号管中取1ml加到2号管中，吹打70次，让菌液混合均匀，即成10^-2稀释液,依次类推进行。

无菌条件下，将上述灭好菌的培养基分装到试管中，将稀释成不同大肠杆菌浓度梯度的菌液接种到培养基中，37℃，225rpm，培养13h。

用pH计检测菌液的pH，得出的数据进行作图，见图1和图2。

(2)定量检测牛奶样品中的大肠杆菌：

在最优条件下应用于纯牛奶中大肠杆菌的检测，实验如下，纯牛奶经过巴氏灭菌以后，接种微量和稍高浓度的细菌，备用；

将待检测牛奶样品接种到上述用于大肠杆菌定量检测的选择性培养基中，37℃，225rpm，培养13h。用pH计检测菌液的pH，取三次重复实验pH的平均值6.863333，代入到y＝0.94394*e^{(-x/78.40394)}+0.99396*e^{(-x/627.35178)}+5.05955中，计算得到的细菌初始浓度数值是10.4425cfu/ml，对照采用平板计数法检测，结果：大肠杆菌初始浓度是8.833333cfu/ml。

培养稍高细菌浓度的样品的菌液的pH的平均值6.4333333，可代入到y＝7.89257-0.87011x计算得到的细菌初始浓度数值是47.54139cfu/ml，对照采用平板计数法检测，结果：大肠杆菌初始浓度是44.166666cfu/ml。

实施例2：

用于大肠杆菌定量检测的选择性培养基的制备：

取乳糖7g，蛋白胨10g，牛胆盐0.75g，羧甲基纤维素钠0.25g，氯化钠1.5g，磷酸氢二钾3g，加入适量的去离子水，加热搅拌使其溶解，全部溶化后，补足因蒸发而失去的水分到500ml；

混匀，115℃高压灭菌15min，得大肠杆菌选择性培养基，备用。利用上述用于大肠杆菌定量检测的选择性培养基定量检测大肠杆菌的方法：

菌液pH值和大肠杆菌初始浓度关系标准曲线的获得：

配制一系列浓度的大肠杆菌溶液；

无菌条件下，将上述灭好菌的培养基分装到试管中，将稀释成不同大肠杆菌浓度梯度的菌液接种到培养基中，37℃，225rpm，培养8h；

用pH计检测菌液的pH，得到的数据进行作图，得到大浓度时菌液pH和大肠杆菌初始浓度对数值的线性关系式y＝7.44004-0.39081x，相关系数R²＝0.97795。

检测时，将待检测牛奶样品(含较高大肠杆菌浓度)接种到上述用于大肠杆菌定量检测的选择性培养基中培养8h后，用PH计测试菌液PH值，将菌液的pH代入到上述线性关系式中计算样品中大肠杆菌的浓度。