蜡样芽孢杆菌D13及其挥发性物质在防治水稻细菌病害中的应用

摘要

本发明公开了蜡样芽孢杆菌D13及其挥发性物质在防治水稻细菌病害中的应用。一种对水稻白叶枯病菌具有抑制作用的蜡样芽孢杆菌D13，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC？No.10243，保藏日期为2014年12月25日。本发明所述的蜡样芽孢杆菌D13产生的挥发性物质在防治水稻细菌病害中的应用。本发明筛选出挥发性物质对黄单胞菌有抑菌效果的菌株枯草芽孢杆菌OKB105和蜡样芽孢杆菌D13。D13产生的挥发性物质对Xoo具有抑制效果，低浓度时，D13产生的挥发性物质可以抑制水稻黄单胞菌的swarming和致病能力，而高浓度时则会增强细胞膜通透性和胞内物质的裂解，从而导致细胞死亡。

说明书

技术领域

本发明属于微生物领域，涉及蜡样芽孢杆菌D13及其挥发性物质在防治水稻细菌病害中 的应用。

背景技术

水稻黄单胞菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae,Xoo)是水稻白叶枯病的病原菌，生长于木 质部，沿叶脉引起黄白色的病斑。水稻白叶枯是亚洲国家水稻的主要病害，严重时造成50-60％ 的减产。对水稻黄单胞菌的研究较为透彻，已报道的致病因子包括过敏反应、II和III泌出系 统分泌的产物、胞外多糖(EPS)、移动性、扩散性信号因素(DSF)和胞外酶等。

很久以前人们就认识到细菌能够产生特殊的气味，并开发为乳酪、酸奶和红酒的芳香成分。 近期的研究表明细菌可以通过产生挥发性物质与植物、真菌、线虫及其它细菌进行互作。2003 年，Ryu等首次发现细菌产生的挥发性有机化合物(volatileorganiccompounds,VOCs)能够影 响植物生长。在过去十年里，2,3-丁二醇、3-羟基-2-丁酮、十六烷基二甲基胺、2-戊基呋喃已 被证实对植物生长有促进作用。BacillussubtilisGB03产生的2,3-丁二醇通过酸化根际、提高 铁的吸收、调控植物体内生长素的合成转运及其抑制ABA合成响应基因的表达等机制来促进 植物的生长。此外，根际促生细菌(plantgrowth-promotingrhizobacteria,PGPR)产生的VOCs 还能够引起植物对干燥、盐、营养缺乏等非生物胁迫的抗逆性。例如细菌VOCs可以提高植物 对铁的吸收和调节植物体内钠的平衡。2004年，Ryu首次报导根际促生细菌分泌的挥发性物 质能够诱导拟南芥系统抗性的产生。B.amyloliquefaciensIN937a和B.subtilisGB03产生的2,3- 丁二醇能够明显提高拟南芥对胡萝卜软腐果胶杆菌的抗性。除此之外，Paenibacilluspolymyxa E681分泌的十三烷也能诱导植物产生系统抗性(Inducedsystemicresistance,ISR)。

早于1966年细菌产生的挥发性物质就被报道能够影响真菌的生长和发育。研究表明灰色 链霉菌(Streptomycesgriseus)产生的挥发性物质能够明显减少Gleosporiumaridum的孢子形 成，促进白腐小核菌(Sclerotiumcepivorum)和立枯丝核菌(Rhizoctoniasolani)菌核的形成。 目前已报道具有抑真菌活性的挥发性物质包括二甲基二硫醚、十一烯、苯甲醛、环己醇、癸醛、 2-乙基-1-己醇、苯并噻唑、二甲基三硫醚以及一些中长链的烷类、烯类、醛类和醇类等。

近期，有研究表明枯草芽孢杆菌产生的挥发性物质能够降低大肠杆菌的移动性并提高其对 抗生素的适应性，然而关于PGPR挥发性物质对病原细菌的研究则相对较少。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种对水稻白叶枯病菌具有抑制作用的蜡 样芽孢杆菌D13。

本发明的另一目的是同工蜡样芽孢杆菌D13在防治水稻白叶枯病菌中的应用。

本发明的又一目的是提供蜡样芽孢杆菌D13的挥发性物质在防治水稻白叶枯病菌中的应 用。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种对水稻白叶枯病菌具有抑制作用的蜡样芽孢杆菌D13，保藏于中国普通微生物菌种保 藏管理中心，保藏号为CGMCCNo.10243，保藏日期为2014年12月25日。

本发明所述的蜡样芽孢杆菌D13在制备防治水稻细菌病害的生物农药中的应用，优选在 制备防治水稻白叶枯病的生物农药中的应用。

本发明所述的蜡样芽孢杆菌D13产生的挥发性物质在防治水稻细菌病害中的应用，优选 在防治水稻白叶枯病中的应用。

本发明所述的蜡样芽孢杆菌D13产生的挥发性物质在制备防治水稻细菌病害的生物农药 中的应用，优选在制备防治水稻白叶枯病的生物农药中的应用。

有益效果：

本发明筛选出挥发性物质对黄单胞菌有抑制效果的菌株蜡样芽孢杆菌D13。D13产生的 挥发性物质对Xoo具有抑制效果，低浓度时，D13产生的挥发性物质可以抑制水稻黄单胞菌 的swarming和致病能力，而高浓度时则会增强细胞膜通透性和胞内物质的裂解，从而导致细 胞死亡。本发明利用固相微萃取结合GC-MS对D13产生的挥发性物质进行鉴定，产生的挥发 性物质主要包括酸类、醇类、苯类、酮类及其含硫含氮化合物。其中，癸醇(DA)和3,5,5- 三甲基己醇(TMH)能有效地抑制Xoo的生长，此外3,5,5-三甲基己醇对水稻细菌性条斑病菌、 番茄细菌性斑点病菌和番茄青枯病菌也有同样的抑制效果。这些结果表明D13产生的挥发性 物质具有广谱毒性，具有较好的应用前景。

附图说明

图1芽孢杆菌挥发性化合物对水稻白叶枯的抑菌效果

图2基于gyrB序列构建的BacilluscereusD13系统发育树

图3芽孢杆菌挥发性物质对Xooswarming能力影响

图4芽孢杆菌挥发性物质对Xoo菌落直径的影响

图5芽孢杆菌挥发性物质对Xoo活力的影响

图6芽孢杆菌挥发性物质对Xoo致病相关基因表达水平的影响

图7芽孢杆菌挥发性物质对Xoo致病力影响

图8扫描电镜下芽孢杆菌挥发性物质处理后的Xoo菌体形态

A:control；B:D13

图9透射电镜下芽孢杆菌挥发性物质处理后的Xoo菌体形态

A:control；B:D13。

图10芽孢杆菌抑Xoo挥发性物质筛选

其中，LA(十二烷酸),TA(十三烷酸),MA(十四酸),PA(十六酸),MCP(3-甲基-1,2-环戊二醇), TMH(3,5,5-三甲基己醇),DA(癸醇)和PCO(2-二十五烷酮).

图11不同浓度的DA和TMH对Xoo生长的影响

图12DA和TMH对Xoc、Pst和Rst生长的影响

其中水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola,Xoc),番茄细菌性斑点病菌 (Pseudomonassyringaepv.tomatoDC3000,Pst)和番茄青枯病菌(Ralstoniasolanacearumpv. tomato,Rst).

生物材料保藏信息

D13，分类命名为蜡样芽胞杆菌Bacilluscereus,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心，保藏日期为2014年12月25日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCCNo.10243。

具体实施方式

实施例1挥发性物质具有抑细菌活性的芽孢杆菌菌株筛选

采用分隔培养皿的方法筛选挥发性物质具有抑菌活性的芽孢杆菌菌株。芽孢杆菌菌株包括 从马来西亚分离的菌株及实验室保存的一些芽孢杆菌。分隔培养皿的一边倒入LB固体培养基， 并加入30μl10⁸cfumL^-1的芽孢杆菌菌液，而在另一边倒入NA固体培养基和10μl10⁸cfumL^-1 的Xoo菌液，以只有Xoo菌液不含芽孢杆菌菌液的处理为对照。28℃共培养6d后测量Xoo 菌落直径。我们从50株马来西亚分离的野生菌及实验室保存的模式菌株中筛选出抑菌效果较 好的菌株D13(图1)，其产生的挥发性物质对Xoo具有明显的抑制效果，且抑制率为37.5％。 其中D13为马来西亚分离的野生菌。

对D13进行16SrRNA和gyrB扩增和测序，并将测序所得序列与NCBI数据库进行blast 比对，通过MEGA4.0软件对D13和芽孢杆菌模式菌株进行系统发育分析，确定D13菌株属 于蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)(图2)；将D13送交CGMCC保藏，保藏编号为CGMCCNo. 10243。。

实施例2Xooswarming能力测定

采用分隔培养皿的方法检测B.cereusD13挥发性物质对Xooswarming能力的影响。将Xoo 菌液调至OD₆₀₀＝1.0，并取2μl滴至含有0.7％琼脂的NA培养基的分隔培养皿中，而在分隔 培养皿的另一边加入30μl10⁸cfumL^-1的B.cereusD13菌液。28℃共培养3d后测量Xoo菌落 直径。分别收集D13处理后的Xoo菌体，提取细菌RNA，使用PrimeScriptfirstStrandcDNA SynthesisKit(TaKaRa，Dalian)进行RNA反转录，方法参照试剂盒说明书。Real-timePCR 采用SYBRPremixExTaq^TM试剂盒(TaKaRa，Dalian)，在AppliedBiosystems7500RealTime PCRSystem(ABI，USA)上完成。分别检测相关基因的表达水平，使用的引物见表1。

表1所用的引物

D13挥发性物质处理3d后的Xooswarming能力弱于比对照(图3)，而对Xoo的菌落直 径和活菌数测定表明只有处理4d后，这些参数才会明显降低(图4和5)。同时，与swarming 相关的motA和motC均下调表达(图6)。这些结果表明处理3d时，D13挥发性物质是抑制 Xoo的swarming能力而不是直接致死。

实施例3Xoo致病性测定

收集B.cereusD13挥发性物质按照实施例1方法处理3d后的Xoo菌体，重悬于灭菌水中 至终浓度为10⁸cfuml^-1，以剪叶法接种水稻(IR24)。接种14d后调查病斑长度。

D13挥发性物质处理3d后的Xoo致病力明显弱于比对照(图7)，rpf(regulationof pathogenicityfactor)基因簇是Xoo生物膜形成和致病所必需的，而rpfF、rpfC和rpfG是其关 键的基因，如图6所示rpfC也相应地被D13挥发性物质抑制表达。

实施例4扫描电镜和透射电镜检测Xoo细胞外部形态和内部结构

采用分隔培养皿法，将D13和Xoo28℃共培养6d后，灭菌水清洗3次，并用2.5％戊二 醛固定，进行扫描电镜和透射电镜观察。以LB培养液处理的Xoo为对照。对照Xoo细胞壁光 滑，成杆状，而D13挥发性物质处理的Xoo细胞壁凹陷，细胞变得畸形，不成杆状(图8)。 而透射电镜观察表明正常的Xoo细胞内细胞质分布均匀，而芽孢杆菌挥发性物质处理后的Xoo 细胞质浓缩，部分细胞的细胞壁被破坏，导致细胞膜通透性增强并且胞内物质裂解(图9)。

实施例5挥发性物质的收集和鉴定

采用固相微萃取法^[1]收集挥发性物质，取20μL芽孢杆菌菌液滴加至含有30mlLB培养基 的100ml瓶中于28℃培养6d。将SPME萃取头插入至100ml瓶的上空，并于50℃水浴中 孵育30min，进行GC-MS分析。气质联用程序：将SPME萃取头置于220℃解离5min；柱 温：起始温度为35℃保持3min后，以10℃/min升温至180℃，再以4℃/min升温至240℃ 保持5min；载气为氦气，柱流速为1ml/min。质谱扫描范围：50-500m/z。将扫描数据与 NIST/EPA/NIH数据库进行比对。结果显示产生的挥发性物质主要包括酸类、醇类、苯类、酮 类及其含硫含氮化合物(表2)。

表2D13产生的挥发性物质

实施例6VOCs试剂对Xoo抑细菌活性筛选

分别将100μlVOCs试剂液体纯品和100μlVOCs试剂固体纯品(用DMSO溶解，浓度为 1gml^-1)滴加至含有LB培养基的分隔培养皿上，另一边含有NA的培养基上加入10μl10⁸cfu ml^-1的Xoo菌液，以相应体积的DMSO为对照。28℃共培养6d后测量Xoo菌落直径。

初步筛选后，选择有抑菌活性的3,5,5-三甲基己醇(TMH)和癸醇(DA)进行进一步的 筛选。用DMSO将TMH和DA稀释至0.8mgml^-1到40mgml^-1，检测100μl不同浓度的稀 释液对Xoo的抑菌活性，确定TMH和DA的最低抑制浓度。同时检测TMH和DA对 Xanthomonasoryzaepv.oryzicola(Xoc)、Pseudomonassyringaepv.tomatoDC3000(Pst)和 Ralstoniasolanacearumpv.tomato(Rst)的抑菌效果。

D13产生的十多种挥发性物质中买到纯品的只有8种，检测这8种挥发性物质纯品对Xoo 生长的影响。由图10可知，只有癸醇(DA)和3,5,5-三甲基己醇(TMH)能够明显抑制Xoo 的生长，抑制率分别为53.6％和60.7％。此外，当添加100μl4.8mgml^-1的癸醇(DA)和24mg ml^-1的3,5,5-三甲基己醇(TMH)时就可以很好的抑制Xoo的生长(图11)。TMH同样能够抑 制水稻细菌性条斑病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzicola,Xoc)、番茄细菌性斑点病菌 (Pseudomonassyringaepv.tomatoDC3000,Pst)和番茄青枯病菌(Ralstoniasolanacearumpv. tomato,Rst)的生长，而DA只对Xoc有抑制效果(图12)。这些结果表明TMH对病原细菌具 有广谱毒性。

参考文献

[1]YuanJ,RazaW,ShenQ,HuangQ.AntifungalActivityofBacillusamyloliquefaciensNJN-6VolatileCompounds againstFusariumoxysporumf.sp.cubense.Appliedandenvironmentalmicrobiology.2012；78:5942-4.