具有提高的莱苞迪苷D含量的甜叶菊植物

摘要

本发明公开了具有升高的莱苞迪苷D含量和其他期望的特征的植物和产生植物的方法。已观察到，莱苞迪苷D(rebD)具有期望的甜味性质，并因此期望产生具有限定的糖苷谱的甜叶菊植物株系、栽培种和品种，其中rebD含量无论是基于甜叶菊叶子的总重量，还是相对于其他糖苷(例如rebA或甜菊苷)，或上述两者，均增加。

说明书

本专利申请要求2013年3月15日提交的美国临时专利申请No.61/792,796的权益，其全部内容以引用的方式并入本文。

背景技术

据信，甜叶菊(SteviaRebaudiana)(例如SteviaRebaudianaBertoni，下文称为“甜叶菊(Stevia)”)在20世纪初被发现于南美洲。由于一系列糖苷的存在，一般认为该植物的叶子比甘蔗甜一个数量级以上。对于用作低卡路里的甜味剂来说，该植物及其糖苷被认为是理想的。存在于甜叶菊植物叶子中的甜味组分当中有甜菊苷、莱苞迪苷A、B、C、D、E、F、杜尔可苷A(DA)、甜菊双糖苷、甜茶苷等，其每一种都具有它自身特有的甜味和相关的味道。甜味的品质是微妙的，甚至纯化的甜菊苷(其为甜叶菊植物中的糖苷之一，即使不是主要的糖苷)与莱苞迪苷A相比，也据信具有令人不悦的苦涩余味。已观察到，像莱苞迪苷A(“rebA”)一样，莱苞迪苷(“rebD”)具有期望的甜味品质、性质和味道。

发明内容

已观察到，莱苞迪苷D(rebD)具有期望的甜味性质，并因此期望产生具有限定的糖苷谱的甜叶菊植物株系、栽培种和品种，其中rebD含量无论是基于甜叶菊叶子的总重量，还是相对于其他糖苷(例如rebA或甜菊苷)，或上述两者，均增加。此类甜叶菊植物不仅产生更多的特别期望的甜味组分(即，甜叶菊糖苷谱在rebD含量方面较高)，而且还通过最大程度减少不太期望的组分以及会影响甜味性质的品质的不需要的组分来提供方便的加工。

附图说明

图1示出甜菊醇、甜菊苷、杜尔可苷A(DA)和相关糖苷的结构：Glc＝葡萄糖；Xyl＝木糖；和Rha＝鼠李糖。

图2示出在实例中更详细描述的用于获得高rebD甜叶菊植物的育种图。

图3示出基于在叶子中发现的材料的量(以干重的百分比计)，rebD百分比含量与rebA/(rebA+甜菊苷)比率的关系图。具有高rebD含量表型的植物以菱形表示，而具有野生rebD表型含量的植物以正方形表示。在横坐标上的85处的垂直线将高和低rebD表型的植物分开。

图4示出在叶子中发现的rebE(RE)+rebN(RN)+rebM(RM)含量与rebD含量(以干重的百分比计)的关系图。植物中RE+RN+RM的量与rebD的量显著相关，相关系数R²＝0.86。具有高rebD表型的植物具有大于0.4％的RE+RN+RM含量。

具体实施方式

1.0定义

莱苞迪苷A、B、C、D、E、F、M和N分别以rebA、rebB、rebC、rebD、rebE(或RE)、rebF、rebM(或RM)和rebN表示。

如本文所用的高rebD植物是基于干燥甜叶菊叶子中的rebD重量具有大于0.5％的rebD含量的那些。

如本文所用的高rebM植物是基于干燥甜叶菊叶子中的rebM重量具有大于0.1％的rebM含量的那些。

如本文所用的高rebN植物是基于干燥甜叶菊叶子中的rebN重量具有大于0.1％的rebN含量的那些。

值得注意的是，高rebD植物也可以是高rebM和/或高rebN植物。

栽培种是在栽培中产生的并针对可通过繁殖而维持的期望特征加以选择的植物或植物群。特定的栽培种的成员不一定基因相同。

植物品种意指在最低已知等级的单一植物学分类单元中的植物群，该品种如果能够区别于在最低等级的那个分类单元中的任何其他品种则是独特的。如本文所用的品种包括无性繁殖的相同克隆分离株。

如文本所用的种子被理解为是指甜叶菊植物的单个和/或多个颖果或成熟胚珠。

如本文所用的“多向杂交”是在三个或更多个亲本品种之间的杂交，该亲本品种用于涉及鉴定具有一种或多种期望表型的植物的选择性植物育种，该植物在与相同种的其他植物杂交育种后，产生在一种或多种期望的表型方面最高产的植物。来自杂交的子代一般是无性繁殖的并可通过随后的杂交育种用于开发新的品种。

贯穿本公开全文而给出的糖苷的重量是指：以针对含水量进行了校正的干燥组织的重量百分比计，所指出的组分的百分比重量。通过以下方式对重量进行含水量校正：在105℃将样品(通常为2克)干燥3小时，并计算由水分引起的任何重量损失。干燥组织通常具有约6-8％的水分。

2.0具有提高的rebD含量的植物的产生。

当如图3中所示绘制rebD的含量和rebA/(rebA+甜菊苷)时，可以看到，具有高rebD含量的植物形成不同的种群。此类植物不仅对于获得纯化的rebD和其他莱苞迪苷，还对于获得含有rebD和包括但不限于rebA、rebE、rebM及rebN的其他糖苷的组合物均是可取的。此类组合物在食品行业中可用作低卡路里甜味剂。该组合物有利地可仅包含有限量的苦味组分，或对某些个体具有不期望的味道/余味的组分，诸如甜菊苷。

具有升高的rebD含量和具有本文所述的其他期望特征的甜叶菊植物的产生可通过由2013年3月15日转移到弗吉尼亚州马纳萨斯大学大道10801号的美国典型培养物保藏中心(ATCC)(邮编)(AmericanTypeCultureCollection(ATCC),10801UniversityBoulevard,Manassas,Va.20110USA)的种子的生长而完成，包括以下的种子：SCO419×SCO435，保藏名称_______；和SCO422×SCO312，保藏名称_______。种子至ATCC的转移发生在2013年3月15日，经由联邦快递运输服务(FedEx)，包装号为3205839/INET3370，追踪号为799292752291。种子的一部分从ATCC转移至苏格兰亚伯丁市巴克斯本的NCIMB有限公司(邮编AB219YA)(NCIMB,Ltd.,Bucksburn,Aberdeen,Scotland,AB219YA)，其中为保藏物分配名称NCIMB42226SteviarabaudianaSCO419×SCO435Tent1(NCIMB42226甜叶菊SCO419×SCO435帐篷1)和保藏名称NCIMB42227SteviarabaudianaSCO422×SCO312Tent2(NCIMB42227甜叶菊SCO422×SCO312帐篷2)。

也可能的是，通过常规的杂交育种技术或分子技术转移一种或多种遗传因子(基因、启动子、蛋白编码序列等)至其他甜叶菊植物来使用保藏的株系产生甜叶菊品种和株系。或者，可能的是，通过单独的经典选择和杂交育种或与化学或辐射诱发突变相结合来产生具有高rebD含量的甜叶菊植物。

本文所述的是高rebD甜叶菊植物和栽培种，其具有大于或等于约0.5％、0.55％、0.6％、0.65％、0.7％、0.75％、0.8％、0.85％、0.9％、0.95％、1.0％、1.05％或1.1％的rebD含量，或从约0.5％至约1％、从约1.0％至约1.5％或从约1.5％至约2.0％的rebD含量。此类植物和栽培种可具有约低于2％、2.25％、2.5％、2.75％或3％的最大rebD含量。

在一个实施例中，高rebD植物为F1、F2、F3，或选自野生型植物的杂交种的高rebD甜叶菊植物的后续子代，其中该高rebD植物还可具有大于约0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.92、0.93、0.94或0.95的rebA/(rebA+甜菊苷)比率，此类植物还可具有低于约0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.92、0.93、0.94或0.95的甜菊苷含量。此类植物可具有约低于2％、2.25％、2.5％、2.75％或3％的最大rebD含量。或者，该植物可具有从约0.5％至约1％、从约1.0％至约1.5％或从约1.5％至约2.0％的rebD含量。

在另一个实施例中，高rebD植物是高rebD甜叶菊植物的第一代或后续子代，该高rebD甜叶菊植物的种子经受化学或辐射诱变，其中该高rebD植物还可具有大于约0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.92、0.93、0.94或0.95的rebA/(rebA+甜菊苷)比率；此类植物还可具有低于约0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.92、0.93、0.94或0.95的甜菊苷含量。此类植物还可具有约低于2％、2.25％、2.5％、2.75％或3％的最大rebD含量。或者，该植物可具有从约0.5％至约1％、从约1.0％至约1.5％或从约1.5％至约2.0％的rebD含量。

本文所述的高rebD甜叶菊植物按干燥植物组织的重量计可具有大于约4.0％、4.2％、4.4％、4.5％、5.0％、5.25％或5.5％的且可低于约15％、14％、13％、12％、11.5％、11％、10％、9％、8％、7.5％、7.0％、6.5％、6.0％的rebA含量。甜叶菊植物按干燥植物组织的重量计还可具有大于约4.0％、4.2％、4.4％、4.5％、5.0％、5.25％或5.5％的且可低于约5.5％、5.25％、5.0％、4.75％或4.6％的rebA含量，前提是rebA的上限不小于rebA的下限。

除rebD和rebA含量外，本文所述的高rebD植物还可具有按干燥植物组织的重量计低于约0.65％、0.70％、0.75％、0.80％、0.85％、0.90％、0.92％、0.93％、0.94％、0.95％或1.29％的甜菊苷含量。在一个实施例中，高rebD植物的甜菊苷含量按重量计大于约0.3％、0.35％或0.4％但低于约0.65％、0.70％、0.75％、0.80％、0.85％、0.90％、0.92％、0.93％、0.94％、0.95％或1.29％。

本文所述的高rebD甜叶菊植物可具有对干燥植物组织而言大于约0.1％、0.2％、0.25％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％或0.64％的rebM含量。

除rebD和rebM含量外，本文所述的高rebD植物还可具有对干燥植物组织而言大于约0.1％、0.15％、0.2％、0.27％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％或0.47％的rebN含量。

本文所述的是高rebM甜叶菊植物和栽培种，其具有大于或等于约0.1％、0.2％、0.25％、0.26％、0.27％、0.28％、0.29％、0.30％、0.31％、0.4％、0.5％、0.6％或0.64％的rebM含量，或从约0.1％至约1％、从约0.1％至约0.5％或从约0.1％至约0.7％的rebM含量。此类植物和栽培种可具有约低于0.5％、0.7％、1％或2％的最大rebM含量。

本文所述的是高rebN甜叶菊植物和栽培种，其具有大于或等于约0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.26％、0.27％、0.28％、0.30％、0.35％、0.4％、0.45％或0.47％的rebN含量，或从约0.1％至约1％或从约0.1％至约0.5％的rebN含量。此类植物和栽培种可具有约低于0.5％、1％或2％的最大rebN含量。

本公开的另一方面涉及来自本文所述的一种或多种高rebD甜叶菊植物或甜叶菊栽培种的组织和种子。更具体地讲，本公开的一个实施例涵盖高rebD甜叶菊植物(一种或多种)或甜叶菊栽培种的种子。在另一个实施例中，本公开涉及高rebD甜叶菊植物或甜叶菊栽培种的组织，包括但不限于叶子、茎、根、嫩枝或细胞。此类组织可以是任何形式，包括分离的、收获的、干燥的、粉化的、冻干的、化学破坏的、机械破坏的或物理破坏的。

如本文所述的甜叶菊植物在食品行业中具有多种用途，应当理解，本公开涵盖用于使食物或饮料变甜的组合物，其包含来源于高rebD植物的任何形式的组织。在一个实施例中，该组合物包含本文所述的高rebD植物的分离的、收获的、干燥的、粉化的、冻干的、化学破坏的、机械破坏的或物理破坏的组织。在一个这样的实施例中，该组合物含有来自高rebD植物的组织，该组织含有低于1.5％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％或0.5％的甜菊苷，并任选地具有大于0.80、0.85、0.87或0.90的rebA/(rebA+甜菊苷)比率。

本公开的另一个方面涉及本文所述的高rebD植物的提取物。此类提取物包含足够的DNA和/或RNA以鉴定该提取物是由高rebD植物所制备。除足以鉴定提取物的rebD和DNA和/或RNA外，该提取物还可以含有rebA、rebB、rebC、rebE、rebF、rebM和/或rebN中的任意一种或多种。足以鉴定该提取物是由本文所述的高rebD植物所制备的DNA和/或RNA将被理解为意指产生于高rebD植物的DNA或RNA，或由存在于提取物中的高rebD植物DNA和/或RNA产生的扩增核酸。存在于样品中的核酸的扩增可通过本领域已知的任何技术(包括聚合酶链反应(PCR)和连接酶链反应(LCR))来实现。该DNA和/或RNA将被理解为，如果通过包括但不限于测序、RFLP映射等的分子技术进行分析表明其产生于高rebD植物，则鉴定该提取物的来源是高rebD植物。在一个实施例中，该试验将以大于95％、97％、98％或99％的置信限确立该提取物源自高rebD甜叶菊植物。

3.0特定实施例

1.一种或多种甜叶菊植物，或甜叶菊栽培种，其中所述一种或多种植物或所述栽培种的叶子(例如在发芽后3-4个月时收获的叶子)含有按干燥甜叶菊叶子的重量计大于约0.5％的rebD。

2.实施例1的一种或多种甜叶菊植物或甜叶菊栽培种，其中所述一种或多种植物或所述栽培种具有按干重计大于或等于约0.5％、0.55％、0.6％、0.65％、0.7％、0.75％、0.8％、0.85％、0.9％、0.95％、1％、1.05％或1.1％的rebD含量，或按干重计从约0.5％至约1％、从约1.0％至约1.5％或从约1.5％至约2.0％的rebD含量。

3.根据实施例1-2中任一个的一种或多种甜叶菊植物，其中所述一种或多种植物具有按干重计低于约15％、14％、13％、12％、11.5％、11％、10％、9％、8％、7％、6.5％、6％、5.5％、5.25％、5％、4.75％或4.6％的rebA含量。

4.根据实施例1-3中任一个的一种或多种甜叶菊植物，其中所述rebA含量按干重计大于约4％、4.2％、4.4％、4.5％、5％、5.25％或5.5％。

5.根据实施例1-4中任一个的一种或多种甜叶菊植物，其中所述甜菊苷含量按干重计低于约0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.92、0.93、0.94或1.29％。

6.根据实施例1-5中任一个的一种或多种甜叶菊植物，其中所述甜菊苷含量按干重计大于约0.3、0.35或0.4％。

7.根据实施例1-6中任一个的一种或多种甜叶菊植物，其中：rebA/(rebA+甜菊苷)比率大于约0.65、0.70、0.75、0.80、0.85、0.90、0.92、0.93、0.94或0.95，并且所述比率小于1。

8.根据实施例1-7中任一个的一种或多种甜叶菊植物，其中所述rebA/(rebA+甜菊苷)比率大于约0.85、0.90、0.92、0.93、0.94或0.95，并且所述比率小于1。

9.根据实施例7-8中任一个的一种或多种甜叶菊植物，其中(RebE+RebM+RebN)的总和按干重计大于0.4％、0.5％或0.6％。

10.来自实施例1-9中任一个的一种或多种甜叶菊植物的种子。

11.来自实施例1-10的植物的组织。

12.实施例1-9的植物的叶子、茎、嫩枝或细胞。

13.一种含有根据实施例1-9中任一个的植物的种子、组织、叶子、茎或细胞中的一者或多者的组合物，其中所述种子、组织、叶子、茎或细胞是收获的、干燥的、粉化的、冻干的、化学破坏的、机械破坏的或物理破坏的。

14.一种用于使食物或饮料变甜的组合物，包括根据实施例13的组合物。

15.根据实施例13或实施例14的组合物，其中所述组合物含有低于1.5％的甜菊苷。

16.一种用于制备含有rebD并任选地含有rebA的组合物的方法，包括制备根据实施例13的组合物。

17.一种含有rebD和鉴定其是由根据实施例1-9中任一个的植物所制备的足够的遗传物质的提取物，所述提取物任选地含有rebA、rebC、rebF中的任意一种或多种。

18.一种甜味剂组合物，含有根据实施例17的提取物。

19.一种栽培种，包括实施例1-9的一种或多种高rebD植物。

20.根据实施例1-2中任一个的一种或多种甜叶菊植物，其中RebM的含量按干重计大于0.1％、0.2％或0.3％。

21.根据实施例1-2中任一个的一种或多种甜叶菊植物，其中RebN的含量按干重计大于0.1％、0.2％或0.3％。

22.一种含有rebD和鉴定其是由根据实施例1-9中任一个的植物所制备的足够的遗传物质的提取物，所述提取物任选地含有rebE、rebM、rebN中的任意一种或多种。

23.一种甜味剂组合物，含有根据实施例22的提取物。

24.一种甜叶菊植物或甜叶菊栽培种，其中所述植物或所述栽培种的叶子含有按干燥甜叶菊组织(例如叶子)的重量计大于约0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.26％、0.27％、0.28％、0.29％、0.30％或0.31％的rebM。

25.一种甜叶菊植物或甜叶菊栽培种，其中所述植物或所述栽培种的叶子含有按干燥甜叶菊组织(例如叶子)的重量计大于约0.1％、0.2％、0.25％、0.26％、0.27％、0.28％、0.29％、0.30％、0.31％、0.4％、0.5％、0.6％或0.64％的rebM。

26.一种甜叶菊植物或甜叶菊栽培种，其中所述植物或所述栽培种的叶子含有按干燥甜叶菊组织(例如叶子)的重量计大于约0.1％、0.15％、0.2％或0.25％、0.26％、0.27％或0.28％的rebN。

27.一种甜叶菊植物或甜叶菊栽培种，其中所述植物或所述栽培种的叶子含有按干燥甜叶菊组织(例如叶子)的重量计大于约0.1％、0.15％、0.2％、0.25％、0.26％、0.27％、0.28％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％或0.47％的rebN。

28.一种甜叶菊植物或甜叶菊栽培种，其中所述植物或所述栽培种的叶子含有按干燥甜叶菊组织(例如叶子)的重量计大于约0.25％、0.26％、0.27％、0.28％、0.29％、0.30％、0.31％的rebM和/或大于约0.22％、0.25％、0.26％、0.27％、0.28的rebN。

29.一种甜叶菊植物或甜叶菊栽培种，其中所述植物或所述栽培种的叶子含有按干燥甜叶菊组织(例如叶子)的重量计大于约0.25％、0.26％、0.27％、0.28％、0.29％、0.30％、0.31％、0.4％、0.5％、0.6％或0.64％的rebM和/或大于约0.25％、0.26％、0.27％、0.28％、0.3％、0.35％、0.4％、0.45％或0.47％的rebN。

30.一种甜叶菊植物或甜叶菊栽培种，其中所述植物或所述栽培种的叶子含有按干燥甜叶菊组织(例如叶子)的重量计大于约0.4％、0.5％、0.6％或0.64％的rebM和/或大于约0.35％、0.4％、0.45％或0.47％的rebN。

31.根据实施例24-30中任一个的甜叶菊植物或甜叶菊栽培种，其中所述植物或栽培种含有按所述干燥甜叶菊组织的重量计大于约0.87％的rebD或大于约0.9％的rebD。

32.根据实施例31的甜叶菊植物或甜叶菊栽培种，其中所述植物或栽培种含有按所述干燥甜叶菊组织的重量计大于约1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％、1.5％或1.6％的rebD。

33.根据实施例24-32中任一个的一种或多种甜叶菊植物，其中所述一种或多种甜叶菊植物是从选自ATCC保藏名称______、ATCC保藏名称______、NCIMB保藏名称NCIMB42226SteviarabaudianaSCO419×SCO435Tent1或NCIMB保藏名称NCIMB42227SteviarabaudianaSCO422×SCO312Tent2的一种或多种种子保藏物长成的甜叶菊植物的子代。

34.从选自ATCC保藏名称______、ATCC保藏名称______、NCIMB保藏名称NCIMB42226SteviarabaudianaSCO419×SCO435Tent1或NCIMB保藏名称NCIMB42227SteviarabaudianaSCO422×SCO312Tent2的一种或多种甜叶菊种子保藏物长成的一种或多种甜叶菊植物。

35.根据实施例24-34中任一个的甜叶菊植物的一部分(例如叶子、茎、根、子叶、种子或细胞)。

36.一种由甜叶菊植物或其部分产生的组合物，该组合物含有足够的遗传物质以鉴定其是由根据实施例24-35中任一个所述的甜叶菊植物或其一部分所制备的，所述组合物(例如化学或物理提取物)任选地含有rebA、rebB、rebC、rebD、rebE、rebF、杜尔可苷A(DA)、甜菊双糖苷或甜茶苷中的任意一种、两种、三种、四种或更多种。

37.一种通过从根据实施例24-35中任一个的植物或其部分中提取一种或多种糖苷(例如rebA、rebB、rebC、rebD、rebE、rebF)来制备甜味剂的方法。

4.0实例

实例1

将从中国和阿根廷(AR)收集的甜叶菊种质基于高、中、低rebA和rebD含量分成三个基因组。从每个组中选择四个株系并保持在单独的帐篷中(帐篷1：高rebA和rebD植物，帐篷2：中rebA和rebD植物，和帐篷3：低rebA和rebD植；参见表1)。在放在温室中的每个帐篷中使用共同的家蝇(Muscadomestica)作为传粉者来产生种子。

表1.在帐篷1、2和3中亲本克隆的糖苷谱*

*糖苷谱百分比(％)重量以针对含水量进行了校正的组织重量的％给出。参见实例2中用于干燥甜叶菊植物的叶子的方案。

从每个帐篷收获种子。收获的一部分种子使用钴-60(⁶⁰Co)源(科罗拉多州立大学兽医和生物医学学院环境与放射健康科学系(DepartmentofEnvironmentalandRadiologicalHealthSciences,CollegeofVeterinaryMedicineandBiomedicalSciences,ColoradoStateUniversity))在10、25或50千拉德经受伽马辐射。表2汇总了从每个帐篷收获的种子的量，经受每种辐射处理的部分种子和作为对照保留的非辐射种子的量。

表2.从帐篷1-3收获的种子，以及经受每种辐射处理和用作对照的量

*在温室条件下产生的1000粒种子具有约0.4克的平均重量

将经过辐射处理的(诱变处理的)种子和对照种子播种到土壤中并使之在具有24小时光照、温度维持在约24℃的生长箱中发芽。种子在约3-4天开始发芽，并在种植籽苗约一个星期后移至用于生长的温室中。从经过辐射处理的种子长成的植物被命名M₀代植物。表3汇总了从受到不同剂量的辐射的每个帐篷中的种子产生的植物的数量。

表3.从受到指定辐射剂量的每个帐篷的种子(籽苗)产生的植物的数量

当列于表3的植物有三至四个月大时，从对照和帐篷1的经辐射处理的突变体植物的每一棵植物收集叶子组织(75％来自前三分之一，25％来自中间三分之一)。在脱水机中将叶子在68℃干燥20-24小时。通过高压薄层色谱法(HPTLC)和/或高效液相色谱法(HPLC，有时被称为高压液相色谱法)分析干燥的叶子样品的糖苷谱。

通过HPLC分析来自帐篷1的高rebD植物，并且示于表4的在非辐射对照、10krad(千拉德)、25krad和50krad之间的平均糖苷组成表明25krad平均产生了具有更高rebD含量和更高rebA/(rebA+甜菊苷)比率的植物。参见表4。

表4.来自帐篷1的以来自经受每种辐射处理的所有植物和对照的叶子的干重百分比给出的平均糖苷组成和植物的rebA/(rebA+STV)比率。

色谱显示来自产生于经辐射处理的组的帐篷1的若干植物产生的rebD水平高于对照植物和它们的亲本。突变体SCO312在开花初期(约八个月大时)具有1.11％的rebD。参见表6。对来自帐篷2和3的总共1535棵植物中的多于350棵植物进行了分析；然而，与对照和/或亲本植物相比，未发现植物具有显著变化的糖苷谱，尤其是rebD含量。参见实例3。

在后面数月中连续进行叶子组织的收集和分析直至对照和产生于辐射种子的植物开始开花。选择对照和高rebD、rebA及rebA/(rebA+STV)植物。制备以选自M0种群(SCO422×SCO312和SCO435×SCO419)的高rebD亲本产生的两个双亲本杂交种和以选自F1种群(SCO273×SCO260)的高rebD亲本产生的一个双亲本杂交种(图2)。将来自杂交种SCO422×SCO312和SCO435×SCO419的种子分入两个池，并如上所述，一半给予20k-rads剂量的伽马辐射。如上所述，种植来自第二轮伽马辐射的命名为“M1”的种子，以及非辐射“M1”和“F1”植物的种子以产生供选择的下一代植物。

结果显示诱变并具体地讲伽马辐射引起的诱变可产生比通过传统育种技术产生的植物具有更高rebD含量和更高rebA/(rebA+甜菊苷)比率的植物(参见表6)。

实例2通过HPLC分析法分析甜叶菊植物中的糖苷

实例2(A部分)叶子提取

将从甜叶菊植物收获的叶子在约68℃干燥24小时并完整储存直至要对它们进行分析。将叶子研磨成干燥叶子粉末。在带有盖子的15mL管中添加10ml水至0.1g叶子粉末中。混合以润湿叶子粉末后，将样品置于50℃水浴中一小时，其中每15分钟进行混合。用0.45μm尼龙滤器过滤该样品然后置于液相色谱小瓶中。

实例2(B部分)糖苷样品的色谱分析

将得自上述2A的过滤样品施加到配有紫外线-可见光检测器(Waters2487双波长或等效检测器)的具有加热器(Waters2695或等效加热器)的高效液相色谱(HPLC)系统。为了分析，该HPLC配有250mm×4.6mm，5μmC18柱(资生堂有限公司(ShiseidoCo.Ltd.)的CapcellpakMGII或等效柱)和保护柱(菲罗门公司(Phenomenex)，KJ0-4282，具有Phenomenex，C184×2.0mm，P/NAJ0-4286插件或等效柱)。在水中制备样品并通过下表中所示的梯度洗脱方法分析。

溶剂A：0.01M磷酸盐缓冲液，pH2.6；溶剂B：乙腈。流量：1ml/min；柱温55℃。

时间(分钟)溶剂A溶剂B080％20％5.580％20％870％30％1170％30％14.565％35％2365％35％

26.520％80％2920％80％31.580％20％

在210nm进行糖苷的检测。采用数据收集和处理软件(如沃特世公司(Waters,Corp.)的Empower或等效软件)，使用已知糖苷标准品进行校正，以确定样品的糖苷含量。

为了确定植物组织中糖苷的量，通过以下方式对在提取中使用的叶子或其他组织的重量进行含水量校正：将已称重的叶子粉末样品在105℃干燥3小时，然后确定由水分引起的重量损失。

实例3通过传统育种和伽马诱变得到的甜叶菊植物的糖苷分析

使用在实例2中概述的方法，通过HPLC分析亲本植物(参见表5，其中每个亲本分离株在两个不同的时间点评估)和选定的通过实例1中的育种方案发育的子代的糖苷含量。如果基于经水分校正的干燥叶子中的糖苷重量，植物含有大于0.5％的rebD，则认为其是高rebD植物。高rebD植物的亚组含有大于0.5％的rebD并具有大于0.8(或以百分比80％表示)的rebA/(rebA+甜菊苷)比率。除高rebD外，下文描述的植物可含有高水平的高级糖苷，诸如rebN。此类植物可含有大于0.5％的rebD和大于0.4％的组合的rebE+rebN+rebM，和更高的糖苷总含量。

表5.来自不含有高rebD含量和不具有大于0.8的rebA/(rebA+甜菊苷)比率或不具有高rebD异构体含量的亲本甜叶菊植物的叶子的糖苷谱。

表5(续)

rebDrebA/(rebA+stv)rebErebNrebMrebE+rebM+rebNSCO 7.6.11.19jan0.16％59.04％0.01％0.02％0.03％0.06％SCO 7.6.11.19orig0.26％71.42％0.03％0.04％0.06％0.13％SCO 7.6.11.2feb0.11％59.26％0.02％0.01％0.02％0.05％SCO 7.6.11.2-010.30％63.92％0.01％0.09％0.02％0.13％SCO 7.6.11.2-020.29％67.26％0.04％0.05％0.07％0.16％SCO 7.6.11.3jan0.16％55.80％0.01％0.02％0.01％0.05％SCO 7.6.11.3orig0.23％67.08％0.02％0.05％0.04％0.10％SCO73jan0.18％67.60％0.02％0.03％0.03％0.07％SCO73orig0.13％66.22％0.02％0.03％0.03％0.08％

SG是rebD、rebA、甜菊苷(STV)、rebF、rebC、杜尔可苷A(DA)、甜茶苷和rebB的总和。

来自本研究的高rebD植物，包括产生于传统育种(SCO260-300)的子代和来源于伽马辐射引起的突变育种(SCO312-512)的子代，也显示出高rebA比率(rebA/(rebA+甜菊苷))以及高rebE、rebM和rebN含量。参见表6。

表6.来自选定的育种含有高rebD含量的甜叶菊植物的叶子的糖苷谱。

表6(续)

样品rebDrebA/(rebA+stv)rebErebNrebMrebE+rebM+rebNSCO2600.78％89.53％0.10％0.18％0.21％0.49％SCO2730.92％92.65％0.15％0.20％0.27％0.61％SCO2840.57％92.30％0.10％0.17％0.26％0.52％

SCO2960.59％97.29％0.14％0.14％0.31％0.60％SCO3000.56％89.02％0.07％0.20％0.14％0.41％SCO3121.11％91.32％0.15％0.28％0.20％0.63％SCO4190.97％87.93％0.17％0.17％0.25％0.59％SCO4220.88％95.20％0.17％0.22％0.31％0.70％SCO4270.58％94.17％0.06％0.15％0.26％0.47％SCO4350.92％93.95％0.14％0.28％0.31％0.72％SCO5120.51％93.46％0.11％0.15％0.30％0.56％

图3和图4中的坐标图显示高rebD子代与低rebD亲本植物的明显区别和植物中rebD含量与植物中rebE+rebM+rebN含量之间的相关性。

实例4：源自后续伽马诱变的另外甜叶菊植物的糖苷分析

多向杂交来自实例1的伽马诱变产生的若干甜叶菊植物以产生种子。使用如实例1中描述的同样方法对来自多向杂交植物的种子进行第二次伽马引起的诱变，然后使其发芽以产生植物。将经受第二次诱变的来自选定植物的叶子进行干燥，并如实例2和3中所述对其进行分析。叶子的糖苷含量列于表7。

表7：来自选定的育种含有高rebD、高rebM和高rebN含量的甜叶菊植物的叶子的糖苷谱

样品名称RebERebDRebNRebMRebA甜菊苷2300-020.08％1.00％0.35％0.49％6.94％0.82％2300-120.03％0.72％0.19％0.33％5.41％1.16％2300-130.10％1.43％0.35％0.43％3.24％0.56％2303-050.08％0.95％0.36％0.62％8.27％0.47％2303-320.04％0.79％0.25％0.43％10.22％1.09％2303-330.04％0.69％0.22％0.23％4.92％0.60％2303-130.08％1.43％0.38％0.51％6.59％0.68％2303-140.04％1.04％0.28％0.45％6.86％0.51％2303-260.05％1.05％0.36％0.49％7.18％0.65％2300-090.13％0.98％0.27％0.53％4.94％0.30％2303-150.05％1.19％0.26％0.48％7.13％0.76％2303-380.07％0.88％0.25％0.37％10.45％1.64％2305-010.04％0.86％0.34％0.58％8.20％0.79％2303-480.05％1.02％0.34％0.49％10.22％1.47％2303-490.04％0.75％0.21％0.26％8.78％1.37％2304-430.09％1.18％0.33％0.39％2.28％0.59％2303-020.04％1.13％0.31％0.55％6.88％0.47％2305-180.07％1.62％0.48％0.65％8.62％0.87％2303-180.03％1.07％0.26％0.47％6.56％0.70％

如表7所见，在从经受第二轮伽马诱变的种子产生的植物中出现了具有升高的rebD、rebM和/或rebN含量的植物。