莱鲍迪苷D的生物催化合成及相关糖基转移酶的结晶条件研究

摘要

莱鲍迪苷D（Rebaudioside D，RD）是源自甜叶菊（Stevia Rehaudiana Bertoni）叶片中的四环二萜类化合物。与其他来自甜叶菊中的主要成分相比较而言，RD不仅保有甜度高（约为蔗糖的200～220倍）、低热量以及安全无毒的特点，更具有较好的口感、无后苦味，是一种新型甜菊糖类甜味剂。但该类化合物来源稀少，只有甜叶菊Stevia phlebophylla和Stevia rebaudiana两个品种能够生产，且其在甜叶菊中含量甚微，仅占干叶的约0.5％。该化合物在植物体内合成的后期是在一系列的葡萄糖基转移酶的催化作用下完成。本研究一方面对RD微生物异源合成方法进行了研究，期望能够定向、高效地合成RD；另一方面拟从结构生物学角度去探索RD合成途径中相关葡萄糖基转移酶的底物识别机制，基于这些糖基转移酶多步糖基化修饰过程中对结构高度类似的相关化合物的底物识别机制，这对于未来开发各种新型糖基化修饰产物具有重要的科学意义。
　　本研究以水稻cDNA为模板，扩增得到葡萄糖基转移酶基因eugt11，构建了重组菌株E.coli BL21（pETDuet-eugt11），并成功表达了重组蛋白6His-EUGT11。将此重组菌E.coli BL21（pETDuet-eugt11）用于在底物二磷酸尿苷葡糖（Uridine diphosphate glucose，UDPG）存在情况下全细胞催化莱鲍迪苷A（Rebaudioside A， RA）合成RD研究。本研究探讨了反应体系pH、温度、柠檬酸钠浓度、菌体密度、二价金属离子、二甲苯体积分数、UDPG添加浓度对反应效率的影响。单因素考察结果显示，在菌体密度0.16 g湿细胞/mL反应液，底物RA浓度为1.0 mmol/L，pH=8.0，60 mmol/L柠檬酸钠，1%（v/v）二甲苯，0.1 mmol/L ZnCl2，12.0 mmol/L UDPG，反应温度42℃，反应时间1 d的条件下，RD产量为123.6 mg/L（约0.1 mmol/L）。
　　我们然后（第四章工作）涉及对大肠杆菌BL21（DE3）进行了糖配体UDPG代谢通径改造，获得了内源性UDPG富集的生产菌株E.coli SG4。以E.coli SG4为宿主表达pYF09质粒上的eugt11基因，获得高效催化RA生产RD的工程菌E.coli SG4（pETDuet-eugt11）。我们接着探讨了反应体系pH、时间、温度、柠檬酸钠浓度、菌体量、二价金属离子、表面活性剂、蔗糖添加浓度对反应效率的影响。单因素考察结果显示，在菌体量50 mL培养菌液离心所收集菌，底物RA浓度为1.0 mmol/L，pH=8.0，80 mmol/L柠檬酸钠，1%（v/v）二甲苯，5 mmol/L ZnCl2，50%（w/v）蔗糖，反应温度42℃，反应时间1 d的条件下，RD产量为1112.21 mg/L（转化率98.5%）。
　　第五章研究RD合成糖基化过程中有五个关键糖基转移酶（ UGT74G1、UGT76G1、UGT85C2、UGT91D2以及UGT91D2同源的EUGT11），目前这些糖基转移酶均没有晶体结构报道，因此首先需要获得UGT74G1、UGT76G1、UGT85C2、UGT91D2和EUGT11蛋白的晶体，并利用X射线（X-ray）衍射的方法来解析它们的蛋白质结构以及它们与底物复合物的空间结构，以便于找出糖基化位点以及它们与底物的结合区域。研究工作中将甜叶菊来源的UGT74G1、UGT76G1、UGT85C2、UGT91D2和UGT91D2同源的EUGT11装载到大肠杆菌表达载体中。将构建好的表达质粒转化至E.coli BL21（DE3）宿主中进行表达可溶性目的蛋白。大量表达蛋白的细胞经高压均质机破碎，所得粗酶液依次通过镍（Ni）亲和层析、阴离子交换以及分子筛纯化得到较纯的目的蛋白，筛选蛋白结晶条件，并优化结晶条件。通过大量的初筛和一系列优化，我们目前为止得到了UGT91D2的多个结晶条件和2.5?分辨率的EUGT11晶体。

目录

声明

第一章 引 言

1 .1萜类化合物

1 .2二萜类化合物

1 .3甜菊糖苷类化合物

1.4 糖基转移酶的研究

1.5 面临的问题和对策

1.6 本论文主要研究内容及意义

第二章 实验材料与主要试剂

2.1 实验材料

2.2 实验常用试剂的配制

第三章 建立重组大肠杆菌全细胞催化合成莱鲍迪苷D方法

3.1 引言

3.2 实验方法

3.3 结果与讨论

3.4 本章小结

第四章 改造内源尿苷二磷酸葡萄糖代谢途径提高全细胞转化率

4.1引言

4.2 实验方法

4.3 结果与讨论

4.4 本章小结

第四章 莱鲍迪苷D合成相关糖基转移酶的结晶条件研究

5.1 引言

5.2 实验方法

5.3 结果与分析

5.4 本章小结与讨论

总结与展望

参考文献

附录

致谢