白刺种子或其提取物中ss或/和rsMTCA的检测方法

摘要

本发明提供了白刺种子中(1S，3S)或/和(1R，3S)构型的1-甲基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧基酸的检测方法，它是采用HPLC技术进行测定的。本发明首次在唐古特白刺种子中发现了rsMTCA，基于MTCA在食物、医药领域的实用性，对白刺种子或其提取物中的ssMTCA和rsMTCA的检测也显得十分必要。本发明利用特定的流动相洗脱条件，首次实现了分别或同时对白刺种子或其提取物中的ssMTCA、rsMTCA的检测，为白刺种子或其提取物的开发利用提供了保障。

说明书

技术领域

本发明涉及从白刺种子或其提取物中同时检测两种手性生物碱的方法。

背景技术

白刺种子中含有多种活性成分，目前从白刺种子中分离得到了很多活性 物质，主要有以下几类物质，黄酮类：槲皮素、异鼠李素-7-O-α-L-鼠李糖甙、 山奈素-7-O-α-L-鼠李糖甙、异鼠李素-7-O-β-D-葡萄糖甙、槲皮素-7-O-α-L-鼠 李糖甙、异鼠李糖、尿囊素、胡萝卜苷、异鼠李糖；生物碱类：L-色氨酸、 尿囊素和1-甲基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧基酸 (1-Methyl-1，2，3，4-tetrahydro-β-carboline-3-carboxylic acid，简称MTCA)。

MTCA属于吲哚类生物碱，目前吲哚类生物碱的研究已成为抗肿瘤药物 活性的热点。特别是在新药及其新药先导化合物发现中起着不可替代的作用。 吲哚类生物碱抗肿瘤成分主要对卵巢癌、淋巴癌和消化道系统癌如肝癌、结 肠癌等有较显著的疗效。此外，吲哚类生物碱抗肿瘤成分在诱导肿瘤细胞分 化、促进肿瘤细胞凋亡以及提高机体免疫方面亦表现出一定的作用。MTCA 活性实验表明MTCA具有较强的清除羟基自由基的能力，在细胞浓度低于 30μg/mL时对人表皮细胞Hucat时有一定的促进作用，同时对人肝癌细胞7221 细胞有促进凋亡的作用。

研究表明MTCA广泛的存在于食品中如小麦、黑麦面粉、大豆蛋白、牛 乳以及酒精饮料如啤酒和红酒中。从食品、酒精饮料以及生物样品分离出来 的MTCA通常会包括两种类型(1S，3S)-1-甲基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧基酸 (简称ssMTCA)和(1R，3S)-1-甲基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧基酸(简称 rsMTCA)。在两个MTCA的非对映体中，ssMTCA的含量是rsMTCA含量的 四倍之多。对两种异构体的提取分离研究，可以为更好地认识各异构体生理 活性打下基础。

目前，还未见对白刺种子或其提取物中的ss、rsMTCA进行HPLC检测 报道。

发明内容

本发明的目的就在于提供一种对白刺种子或其提取物中ssMTCA或/和 rsMTCA进行检测的方法。

具体地，本发明提供了白刺种子中(1S，3S)或/和(1R，3S)构型的1-甲基 -1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧基酸的检测方法，它是采用HPLC技术进行测定的， 具体操作如下：

(1)供试品溶液的制备：

取白刺种子，以乙醇水溶液为溶剂进行提取，提取液回收乙醇至无醇味， 加入石油醚进行萃取，取水层，上大孔吸附树脂柱，依次用水、10％V/V乙醇 溶洗脱，收集10％V/V乙醇洗脱液，浓缩、干燥即得粗提物，取粗提取物制 备供试品溶液即可；

(2)将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，对(1S，3S)或/和(1R，3S)构型 的1-甲基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧基酸进行测定即可，其中，色谱条件如下：

色谱柱：十八烷基键合硅胶柱；

流动相A：甲醇；流动相B：水；梯度洗脱条件：0-16min，10％-27％V/VA； 16-21min，27％-29％V/VA；21-35min，29％-45％V/VA；检测波长：254～280nm， 优选为254nm。

本发明一个具体实施方式中，使用的色谱柱型号为Agilent Eclipse  XDB-C18。

其中，步骤(1)中，提取所用乙醇的浓度为65％～95％，进一步为70％～80％， 优选为75％V/V。

进一步地，所述大孔吸附树脂为非极性大孔吸附树脂。

更进一步地，所述大孔吸附树脂为D101树脂。

其中，供试品溶液的溶剂为水。

其中，步骤(2)中，流动相流速为0.5～1mL/min，优选为1mL/min；柱 温为25～30℃，优选为30℃。

其中，步骤(2)中，采用面积归一法或者外标法对(1S，3S)或/和(1R，3S) 构型的1-甲基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧基酸进行测定。

本发明还提供了白刺种子提取物中(1S，3S)或/和(1R，3S)构型的1-甲基 -1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧基酸的检测方法，它是采用HPLC技术进行测定的， 具体操作如下：

(1)供试品溶液的制备：

取白刺种子提取物，溶解后制备成供试品溶液；其中，白刺种子提取物 由如下方法制备得到：

取白刺种子，以乙醇水溶液为溶剂进行提取，提取液回收乙醇至无醇味， 加入石油醚进行萃取，取水层，上大孔吸附树脂柱，依次用水、10％V/V乙醇 溶洗脱，收集10％V/V乙醇洗脱液，浓缩、干燥即得粗提物；取正丁醇∶0.5％ 甲酸＝5∶6V/V，置于分液漏斗中配制两相溶剂系统，取上相为固定相，下相为 流动相；取粗提物，溶解于适量固定相和流动相的混合液中，得到样品溶液； 以20～40mL/min的流速将固定相泵入主机并充满分离螺线管，保持温度 25～30℃，主机正向旋转，转速为800～1000r/min，以1.5～3.0mL/min的速度泵 入流动相，待流动相从管柱口流出且基线稳定后，注入样品溶液，在 254～280nm波长下进行检测，收集出峰时间300～350min的成分，即得白刺种 子提取物；

(2)将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，对(1S，3S)或/和(1R，3S)构型 的1-甲基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧基酸进行测定即可，其中，色谱条件如下：

流动相A：甲醇；流动相B：水；梯度洗脱条件：0-16min，10％-27％V/VA； 16-21min，27％-29％V/VA；21-35min，29％-45％V/VA；检测波长：254nm。

进一步地，步骤(1)中，固定相的流速为30mL/min，温度为30℃，主 机转速为900r/min，流动相的流速为1.7mL/min。

进一步地，步骤(2)、(3)中，检测波长为254nm。

本发明的有益效果：

(1)本发明首次在唐古特白刺种子中发现了rsMTCA，基于MTCA在食 物、医药领域的实用性，对白刺种子或其提取物中的ssMTCA和rsMTCA的 检测也显得十分必要。本发明利用特定的流动相洗脱条件，首次实现了分别 或同时对白刺种子或其提取物中的ssMTCA、rsMTCA的检测，为白刺种子或 其提取物的开发利用提供了保障。

(2)ssMTCA和rsMTCA互为光学异构体，两者仅只有在1位的甲基取 代构象不同，两者的化学性质极为相近。毋庸置疑，两者的极性也十分接近， 高效液相色谱是利用不同化合物在流动相和固定相之间的极性选择差异来对 不同化合物进行分离从而实现检测的，若是希望使用液相色谱技术将两个极 性极为相似的化合物进行分离，是极其困难的。梯度洗脱是面对复杂分离过 程的首选洗脱方式，然而，梯度洗脱过程中，流动相种类、梯度程序(即时 间和相对应的流动相配比)的选择是无限的，如何选择一种适合于ssMTCA 和rsMTCA的梯度洗脱条件，是需要发明人付出大量的实践和总结、分析才 能得到的。本发明最终发现的流动相梯度洗脱条件，能够有效将白刺种子中 的多种化学成分分离，更重要的是，能够将ssMTCA和rsMTCA分开，为两 者化合物的分别测定提供了基础。

附图说明

图1 白刺种子中ssMTCA和rsMTCA的HPLC检测图谱

图2 白刺种子提取物制备过程中的逆流色谱图

图3 白刺种子提取物中ssMTCA和rsMTCA的HPLC检测图谱

图4 ssMTCA对照品的HPLC图谱

图5 rsMTCA对照品的HPLC图谱

图6 半制备色谱图

图7 流动相梯度为0-16-21-35min(10％-29％-29％-45％甲醇)时的色谱图， 其检测的供试品溶液同实施例1

本发明图谱中，标注为数字“2”的色谱峰为ssMTCA，标注为数字“3”的色谱峰 为rsMTCA。

具体实施方式

实施例1 白刺种子中ss、rsMTCA的检测方法

1、供试品溶液的制备

白刺种子经高速万能粉碎机粉碎后，中药煎煮机中以1∶10kg/L的料液比 进行提取，提取时间2h，提取溶剂75％的乙醇，提取次数为3次。3次提取 后将提取溶液合并，回收乙醇至无醇味，加入石油醚进行反复萃取。将经过 石油醚萃取后的水层于旋转蒸发仪上浓缩蒸干，加水溶解，上D101大孔树脂 进行初步分离。对大孔树脂进行洗脱，洗脱溶液及浓度依次是：水、10％V/V 乙醇溶液，收集10％乙醇洗脱液部分，于旋转蒸发仪上浓缩蒸干，再溶于水 中，即为供试品溶液。

2、HPLC检测

将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，采用如下色谱条件进行检测，即可 实现对ss、rsMTCA的测定：

流动相A：甲醇；流动相B：水；梯度洗脱条件如下：0-16min，10％-27％A； 16-21min，27％-29％A；21-35min，29％-45％A流速：1mL/min，柱温：30℃， 检测波长：254nm，色谱柱的型号：Agilent Eclipse XDB-C18。

检测结果可以使用面积归一法或外标法进行计算。例如，本发明采用面 积归一法，计算出的各色谱峰面积比及ss、rsMTCA含量如下(色谱图见图1)：

根据上述检测数据，按照峰面积百分比计算，本实施例所用白刺种子中 测得的ssMTCA含量为39.113％，rsMTCA的含量为7.023％。

实施例2 白刺种子提取物中ss、rsMTCA的检测方法

1、白刺种子提取物的制备：

白刺种子经高速万能粉碎机粉碎后，中药煎煮机中以1∶10kg/L的料液比 进行提取，提取时间2h，提取溶剂75％的乙醇，提取次数为3次。3次提取 后将提取溶液合并，回收乙醇至无醇味，加入石油醚进行反复萃取。将经过 石油醚萃取后的水层于旋转蒸发仪上浓缩蒸干，加水溶解，上D101大孔树脂 进行初步分离。对大孔树脂进行洗脱，洗脱溶液及浓度依次是：水、10％V/V 乙醇溶液，收集10％乙醇洗脱液部分，于旋转蒸发仪上浓缩蒸干，粗提物备 用。

取正丁醇∶0.5％甲酸＝5∶6V/V，置于分液漏斗中配制两相溶剂系统，取上 相为固定相，下相为流动相；取粗提物，溶解于适量固定相和流动相的混合 液中，得到样品溶液；以30mL/min的流速将固定相泵入主机并充满分离螺线 管，保持温度30℃，主机正向旋转，转速为900r/min，以1.7mL/min的速度 泵入流动相，待流动相从管柱口流出且基线稳定后，注入样品溶液，在254nm 波长下进行检测，收集出峰时间300～350min的成分，即得白刺种子提取物(逆 流色谱图见图2)；

2、供试品溶液的制备

取步骤1制备的白刺种子提取物，溶于溶剂水中，即为供试品溶液。

3、HPLC检测

将供试品溶液注入高效液相色谱仪中，采用如下色谱条件进行检测，即 可实现对ss、rsMTCA的测定：

流动相A：甲醇；流动相B：水；梯度洗脱条件如下：0-16min，10％-27％A； 16-21min，27％-29％A；21-35min，29％-45％A；流速：1mL/min，柱温：30℃， 检测波长：254nm。

检测结果可以使用面积归一法或外标法进行计算。例如，本发明采用面 积归一法，计算出的各色谱峰面积比及ss、rsMTCA含量如下(色谱图见图3)：

根据上述检测数据，按照峰面积百分比计算，本实施例所用白刺种子提 取物中测得的ssMTCA含量为76.948％，rsMTCA的含量为20.252％。

本发明HPLC检测过程中，ssMTCA和rsMTCA对照品的图谱见图4、5， 所用对照品可以购买市售品获得，也可以按照已知方法制备，或者采用下述 方式自制：

(1)粗提物制备

白刺种子经高速万能粉碎机粉碎后，中药煎煮机中以1∶10kg/L的料液比 进行提取，提取时间2h，提取溶剂75％的乙醇，提取次数为3次。3次提取 后将提取溶液合并，回收乙醇至无醇味，加入石油醚进行反复萃取。将经过 石油醚萃取后的水层于旋转蒸发仪上浓缩蒸干，加水溶解，上D101大孔树脂 进行初步分离。对大孔树脂进行洗脱，洗脱溶液及浓度依次是：水、10％V/V 乙醇溶液，收集10％乙醇洗脱液部分，于旋转蒸发仪上浓缩蒸干备用。

(2)采用高速逆流色谱法分离：

取正丁醇∶0.5％甲酸＝5∶6V/V，置于分液漏斗中配制两相溶剂系统，取上 相为固定相，下相为流动相；取粗提物，溶解于适量固定相和流动相的混合 液中，得到样品溶液；以30mL/min的流速将固定相泵入主机并充满分离螺线 管，保持温度30℃，主机正向旋转，转速为900r/min，以1.7mL/min的速度 泵入流动相，待流动相从管柱口流出且基线稳定后，注入样品溶液，在254nm 波长下进行检测，收集出峰时间300～350min的成分，即得初步纯化物；

(3)半制备液相色谱分离：

取初步纯化物，上半制备液相色谱，在254nm下检测，依次收集第一大 峰和第二大峰(制备色谱图见图6)，除去溶剂即可同时得到ssMTCA和 rsMTCA，色谱条件如下：

流动相：甲醇-水：30∶70。

结构鉴定

上述方法自制的ssMTCA的鉴定数据为：白色粉末，m.p.290-293℃，¹H  NMR(DMSO-d₆)δ：11.18(1H，s，9-NH)，7.43(1H，d，J＝7.8Hz，H-5)，7.34 (1H，d，J＝8.1Hz，H-8)，7.08(1H，dd，J＝7.5，15.0Hz，H-7)，7.00(1H，dd，J ＝7.8，15.0Hz，H-6)，4.53(1H，m，H-1)，3.66(1H，dd，J＝4.5，11.4Hz，H-3)， 3.19(1H，dd，J＝3.6，12.3Hz，H-4a)，2.79(1H，t，J＝13.5Hz，H-4b)，1.63(3H， d，J＝6.6Hz，CH₃)。¹³C NMR(DMSO-d₆)δ：17.04(q，CH₃)，49.02(d，C-1)， 132.41(s，C-1a)，57.55(d，C-3)，23.26(t，C-4)，106.62(s，C-4a)，117.88(d， C-5)，126.10(s，C-5a)，118.74(d，C-6)，121.62(d，C-7)，111.16(d，C-8)，136.38 (s，C-8a)，169.87(s，COOH)。以上数据与文献1、2对照一致，确定其结构为 (1S，3S)-1-甲基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧基酸(ssMTCA)。经检测，该化合物 的纯度可达99.5％。

上述方法自制的rsMTCA的鉴定数据为：白色粉末，mp240-243℃，¹H NMR (DMSO-d₆)δ：11.02(1H，s，9-NH)，7.42(1H，d，J＝7.8Hz，H-5)，7.32(1H，d，J ＝7.8Hz，H-8)，7.09(1H，t，J＝7.2Hz，H-7)，7.00(1H，t，J＝7.5Hz，H-6)，4.61 (1H，br，H-1)，3.80(1H，br，H-3)，3.07(1H，dd，J＝4.8，15.9Hz，H-4a)，2.95 (1H，m，H-4b)，1.57(3H，d，J＝6.6Hz，CH₃)。¹³C NMR(DMSO-d₆)δ：18.57 (q，CH₃)，46.35(d，C-1)，134.00(s，C-1a)，52.73(d，C-3)，22.88(t，C-4)，105.54 (s，C-4a)，117.76(d，C-5)，126.19(s，C-5a)，118.52(d，C-6)，121.05(d，C-7)， 112.00(d，C-8)，136.09(s，C-8a)。以上数据与文献2对照一致，确定其结构为 (1R，3S)-1-甲基-1，2，3，4-四氢-β-咔啉-3-羧基酸(rsMTCA)。经检测，该化合物 的纯度可达97.8％。

当然，本发明除了采用面积归一法对上述两种化合物进行检测外，也可 以采用外标法来对两种化合物进行测定，外标法的使用参照常规方法即可。

小结与讨论：

(1)本发明首次在唐古特白刺种子中发现了rsMTCA，基于MTCA在食 物、医药领域的实用性，对白刺种子或其提取物中的ssMTCA和rsMTCA的 检测也显得十分必要。本发明利用特定的流动相洗脱条件，首次实现了分别 或同时对白刺种子或其提取物中的ssMTCA、rsMTCA的检测，为白刺种子或 其提取物的开发利用提供了保障。

(2)除了本发明实施例1中使用的流动相条件外，本发明前期也试用了 其他条件，如流动相梯度为0-16-21-35min(10％-29％-29％-45％甲醇)，由于 白刺种子提取物中成分较多，该条件下峰1、2和3分离度不好，没有完全分 开(如图7)，导致无法较好地对各成分进行检测。除此之外，本发明还试用 了如下多种条件，但均出现了上述问题：

0-16-21-35min(10％-27％-27％-45％甲醇)；

0-16-21-35min(10％-28％-28％-45％甲醇)；

0-5-15-25-35min(10％-27％-27％-45％甲醇)；

0-5-15-25-35min(10％-29％-29％-45％甲醇)；

0-5-15-25-35min(10％-29％-29％-45％甲醇)；

0-5-15-25-35min(10％-27％-29％-45％甲醇)；

0-5-20-25min(10％-27％-27％-45％甲醇)；

0-5-20-25min(10％-27％-27％-45％甲醇)；

0-5-20-25min(10％-28％-28％-45％甲醇)；

0-5-20-25min(10％-29％-29％-45％甲醇)；

0-5-20-25min(10％-27％-29％-45％甲醇)。

综合上述各流动相条件的分离效果，本发明最终选取的流动相洗脱条件 为：0-16min，10％-27％甲醇；16-21min，27％-29％甲醇；21-35min，29％-45％ 甲醇。

参考文献：

[1]Li X N，Chu C，Cheng D P，et al.Two Alkaloids from Asparagus cochinchinensis[J]. Chemistry of Natural Compounds，2014，50(2)：326-328.

[2]Li G，Deng Z，Li J，et al.Chemical constituents from starfish Asterias rollestoni[J]. JOURNAL OF CHINESE PHARMACEUTICAL SCIENCES.，2004，13：81-86.