绿色木霉发酵提取物提高酒精发酵产量的方法

摘要

本发明公开了一种绿色木霉发酵提取物提高酒精发酵产量的方法，至少包括如下步骤：（1）以秸秆为原料进行固态发酵，发酵桶中加入秸秆粉，再加入水和硝酸铵，并充分搅拌，然后接入绿色木霉CGMCC3.6619，使菌种与秸秆粉充分接触；连续培养一个月，发酵结束后干燥，得发酵基质备用；（2）提取物醇升的提取及纯化，用NaOH溶液浸泡发酵基质，恒温处理后过滤，滤液经浓缩后即制得原液；然后调节原液至pH 2.0，静置、离心、除沉淀，清液经喷雾干燥后得到产品醇升；（3）酒精发酵，取淀粉加入清水，搅拌使淀粉在水中分散均匀，然后加入液体高温淀粉酶，氯化钙，调pH，再加入液体糖化酶，糖化结束后冷却，并加入活化好的酿酒酵母和醇升，恒温室中发酵。

说明书

技术领域

    本发明属于通过微生物菌种制备具有生物活性的混合物来提高酒精发酵产量的方法。

背景技术

    燃料酒精（乙醇）是21世纪三大新能源之一，而高浓度酒精发酵是行业发展的必然趋势和技术瓶颈之一，利用合理工艺条件提高酵母对高浓度酒精的耐受能力从而提高酵母产酒精能力受到广泛关注。影响高浓度酒精发酵的因素是多种多样的，而针对这些限制性因子，人们的对策也是千方百计。在进行选育菌种、改良设备、优化培养基等方面的开创性研究基础上，有人着眼于现有设备及工艺的高效利用，采用完全间歇发酵方式，实现高浓度酒精发酵。也有研究者通过向发酵醪液中添加酵母菌厌氧生长增值所必需的物质，提供增强酵母菌细胞抵抗不良环境因素的物质，从而优化发酵醪液的组成，最终实现高浓度酒精发酵。

   目前，市场上酒精发酵助剂因其使用方便，效益较高而广受好评。屈慧鸽等人发现法国Lallemand公司生产的发酵助剂可加快山葡萄酒的发酵进程，提高了糖的转化率。但其价格较高，且使用之后总酸含量有所增加。酒精发酵助剂还包括表面活性剂如Tween-20，或者酵母营养盐如安琪发酵促进剂，用于提高发酵醪液中的酒精浓度。也有如酵奇发酵增效剂和酿酒发酵增效剂等可以提高酒精发酵效率，但因生产成本高和产品使用效果有限，很少有在实际生产中得到广泛应用。

发明内容

    本发明针对上述问题，提供一种绿色木霉发酵提取物提高酒精发酵产量的方法。

本发明所述的一种绿色木霉发酵提取物提高酒精发酵产量的方法至少包括如下步骤：

（1）以秸秆为原料进行固态发酵

发酵桶中加入秸秆粉，再加入水和硝酸铵，并充分搅拌，然后接入绿色木霉CGMCC3.6619，使菌种与秸秆粉充分接触；于28℃恒温室内连续培养一个月，发酵结束后干燥，得发酵基质备用；

（2）提取物醇升的提取及纯化

用质量分数为3.5%的NaOH溶液浸提步骤（1）得到的干燥备用发酵基质，60℃恒温水浴1h后过滤，滤液经浓缩后即制得原液；然后用盐酸调节原液至pH 2.0，静置10 min 后经4 000rpm 离心15min，去除沉淀，经喷雾干燥后得到醇升产品；

（3）酒精发酵

    取淀粉1kg放入不锈钢罐中，加入清水3L，搅拌使淀粉在水中分散均匀，然后加入液体高温淀粉酶1mL，氯化钙1g，将体系的pH调至6.5，将料液加热至90℃，保温30min后冷却至60℃，调节体系pH至4.5，再加入2mL液体糖化酶，维持60℃糖化60min，糖化结束后冷却到30℃，并加入活化好的酿酒酵母和醇升15g，于28℃恒温室中发酵48h，得发酵醪液，测得发酵醪液中的酒精浓度为17%（v/v）。

进一步地，所述的秸秆粉用新鲜水稻秸秆，经风干后粉碎，过1mm筛。

进一步地，所述的秸秆粉、水、硝酸铵的比例为：秸秆粉1kg、水3kg、硝酸铵10g；所述的绿色木霉CGMCC3.6619接种量为秸秆干重的1%。

本发明的有益效果是：本发明以秸秆为原料制备醇升，然后加入到酒精发酵培养基中，以提高酵母耐受性，增加酒精产量。醇升使用方便，在降低酒精的生产成本的同时提高了酒精产量，使用效果明显，是一种真正具有产业化应用价值的酒精发酵助剂。除此之外，它还通过加入高效降解菌株绿色木霉CGMCC3.6619，显著提高基质的生物转化效率，这使得在制备醇升过程中秸秆转化率高达75%以上，转化效率和发酵速度均处领先水平，而得到的醇升产品价格便宜。

附图说明

 图1 为不同浓度醇升对酵母生长的影响（10⁷个 ∕ ml）图。

 图2 为不同浓度醇升对酵母产乙醇的影响图。

 图3为不同浓度醇升对葡萄糖消耗的影响表。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。

 如图所示：本发明所述的一种绿色木霉发酵提取物提高酒精发酵产量的方法至少包括如下步骤：

（1）以秸秆为原料进行固态发酵

发酵桶中加入秸秆粉，再加入水和硝酸铵，并充分搅拌，然后接入绿色木霉CGMCC3.6619，使菌种与秸秆粉充分接触；于28℃恒温室内连续培养一个月，发酵结束后干燥，得发酵基质备用；

（2）提取物醇升的提取及纯化

用质量分数为3.5%的NaOH溶液浸提步骤（1）得到的干燥备用发酵基质，60℃恒温水浴1小时后过滤，滤液经浓缩后即制得原液；然后用盐酸调节原液至pH 2.0，静置10 min 后经4 000转 /分 离心15分钟，去除沉淀，经喷雾干燥后得到醇升产品；

（3）酒精发酵

    取淀粉1kg放入不锈钢罐中，加入清水3L，搅拌使淀粉在水中分散均匀，然后加入液体高温淀粉酶1mL，氯化钙1g，将体系的pH调至6.5，将料液加热至90℃，保温30min后冷却至60℃，调节体系pH至4.5，再加入2mL液体糖化酶，维持60℃糖化60min，糖化结束后冷却到30℃，并加入活化好的酿酒酵母和醇升15g，于28℃恒温室中发酵48h，得发酵醪液，测得发酵醪液中的酒精浓度为17%（v/v）。

所述的秸秆粉用新鲜水稻秸秆，经风干后粉碎，过1mm筛。

 所述的秸秆粉、水、硝酸铵的比例为：秸秆粉1kg、水3kg、硝酸铵10g；所述的绿色木霉CGMCC3.6619接种量为秸秆干重的1%。

 醇升对酵母生长速度的影响试验：

配制YPD液体培养基，每1L水中含有20g蛋白胨、20g葡萄糖、10g酵母膏。额外添加醇升的量按浓度0g/L，0.1g/L，0.2g/L，0.4g/L，0.5g/L，1g/L，1.25g/L，1.7g/L，2.5g/L，5g/L，10g/L加入到摇瓶内。接种等量酵母液体菌种，于摇床上170r/min、28℃下恒温培养，每1h检测一次其酵母数量及OD值以分析醇升对酵母生长速度的影响。

酒精是酵母生长时的代谢产物，酵母生长状况对酒精发酵有决定性影响，对数生长期的酵母产酒精能力最强。因此，测定了厌氧发酵时发酵液中酵母数量变化，考察不同浓度醇升对酵母生长的影响。结果表明（图1），醇升对酵母生物量的变化有显著影响，随着发酵液中醇升用量的增加，酵母数量相应增加，并且，酵母增殖速度提高，缩短了适应期，对数生长期提前。当醇升的用量达到5.0 g/L时，酵母生物量可以增加100%，最大生物量提前2 d；当醇升的用量达到10.0 g/L时，酵母生物量不再增加。

醇升对酵母产乙醇和乙醇耐受力的影响试验：

配制葡萄糖浓度达25%的发酵培养基，分装280mL左右发酵培养基于250mL规格的摇瓶中（培养基液面离瓶口约1cm），添加的醇升按设置浓度0g/L，0.1g/L，0.5g/L，1.65g/L，2.5g/L，3.3g/L，5g/L，10g/L加入到发酵瓶中，接种等量活化的酵母菌液后静置于恒温箱28℃无氧发酵，每隔24h检测一次各个发酵瓶中发酵液酵母数量、葡萄糖残量、酒精度及最后所能达到的最大酒精度，用以分析醇升对酵母产乙醇及耐乙醇的影响。

高浓度酒精发酵的关键是解决酵母对乙醇的耐受问题。研究结果表明，不同浓度的醇升对酵母产乙醇都有促进作用，发酵液中酒精浓度均有显著提高。当醇升用量达到5.0 g/L时，最高酒精浓度可以从7.1%提高到15.8%，酒精含量增加了123%。而增加醇升用量至10.0 g/L，最高酒精浓度不再增加（图2）。由此可知，醇升对酵母产酒精及乙醇耐受能力均有显著提升作用。

通过对发酵过程的葡萄糖浓度检测，葡萄糖的消耗和酵母生物量的增加是耦合的，酵母生长速度快时，葡萄糖的消耗速度也快，酵母生物量增加得越多，葡萄糖消耗的量也越多（图3）。结合酒精浓度变化发现，酵母生长停止后还会继续发酵产酒精，并且最高酒精浓度出现的时间晚于酵母最大生物量2d。