免疫抑制剂雷帕霉素在提高出芽短梗霉普鲁兰多糖产量中的应用及方法

摘要

本发明公开了免疫抑制剂雷帕霉素在提高出芽短梗霉普鲁兰多糖产量中的应用及方法，具体方法是将出芽短梗霉活化后在含5～80mg/L雷帕霉素的条件下发酵，其方法简单，直接在发酵培养基中加入雷帕霉素，添加雷帕霉素后可以有效抑制聚苹果酸的合成，调节碳代谢流大幅度向普鲁兰多糖合成方向，大幅度提高普鲁兰多糖产量，具有发酵成本低、产量高、技术经济性强等优点，可应用于普鲁兰多糖工业生产。

说明书

技术领域

本发明属于发酵领域，具体涉及免疫抑制剂雷帕霉素在提高出芽短梗霉普鲁兰多糖产量 中的应用，还涉及利用免疫抑制剂雷帕霉素提高出芽短梗霉普鲁兰多糖产量的方法。

背景技术

出芽短梗霉(Aureobasidum pullulan)是一类酵母真菌，具有菌丝体和酵母样两种形态。 该菌种在自然界中存在较为广泛。通常出芽短梗霉发酵过程会同时产生聚苹果酸和普鲁兰多 糖两个大分子代谢产物。聚苹果酸和普鲁兰多糖的合成共同的前体有葡萄糖-1-磷酸，如碳代 谢流进入TCA循环或者乙酸循环积累苹果酸，将最终聚合生成聚苹果酸；而碳代谢流经葡萄 糖-1-磷酸转化UDPG-葡萄糖，将最终合成普鲁兰多糖。

现有的专利报道希望能同时生产两种高分子聚合物，如乔长晟等一种出芽短梗霉联产聚 苹果酸和普鲁兰多糖的方法(专利授权号ZL201110430053.3)，但是由于两种聚合物的具有不 同的物理性质和产品附加值，同时生产两种高分子聚合物，会对下游提取纯化造成困难。因 此，从生产实践上，更希望获得单一目标的聚合物产品。现有技术报道了0.1％，0.5％和1％ 的吐温-80能够提高出芽短梗霉产普鲁兰多糖的能力；但是未见其他物质提高普鲁兰多糖的报 道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于针对现有聚苹果酸和普鲁兰多糖发酵生产工艺技术的不足， 经过大量研究发现出芽短梗霉生长受氮源调节，且在氮限制条件下有利于聚苹果酸和普鲁兰 多糖合成。通常微生物适应外界营养环境完成的复杂转录、翻译和后翻译修饰等过程，主要 依赖于营养感应和信号传导，其中雷帕霉素靶蛋白(Target of rapamycin，TOR)信号途径被 认为是感应氮信号的重要途径，TOR信号通路在真核生物感受外界营养物质和逆境胁迫、调 控细胞生长中起重要作用，通过响应外界氮及氨基酸、渗透压、热、氧化应激、以及碳饥饿 等信号，调节翻译、转录、核糖体生物合成、营养物质的运转以及自噬作用调控细胞生长。 雷帕霉素是雷帕霉素靶蛋白(TOR)的特异性抑制剂，本发明采用雷帕霉素靶蛋白(TOR) 特异性抑制剂雷帕霉素，通过抑制TOR途径靶蛋白的活性，调节代谢流向普鲁兰多糖合成方 向进行，实现对出芽短梗霉合成的聚苹果酸和普鲁兰多糖合成的代谢流转换，实现高效合成 普鲁兰多糖。本发明使用的产聚苹果酸菌种为Aureobasidium pullulans CCTCC M 2012223， 或者来源于美国农业部菌种保藏中心(NRRL)，美国典型培养物保藏中心(ATCC),中国普 通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)等机构保藏或自然分离的Aureobasidium属菌种。

优选的，所述雷帕霉素的浓度为5～80mg/L；更优选的，所述雷帕霉素的浓度为10～70 mg/L。

本发明还公开了利用免疫抑制剂雷帕霉素提高出芽短梗霉普鲁兰多糖产量的方法，将出 芽短梗霉活化后在含5～80mg/L雷帕霉素的条件下发酵。

优选的，所述发酵是在温度为23-30℃、转速为180-300rpm条件下培养96-150小时；

或在温度为23-30℃、转速为300-1000rpm、通气比1:0.8-1:1.6条件下培养72-200小时。

更优选的，所述发酵是在温度为25℃、转速为220rpm条件下培养96小时；

或在温度为25℃、转速为600rpm、通气比1:1.2条件下培养96小时。

优选的，所述发酵使用的培养基各组分如下：糖50-200g/L，硫酸铵、氯化铵、硝酸钾 或硝酸钠1-5g/L，KH₂PO₄0.005-0.3g/L，ZnSO₄0.005-0.3g/L，MgSO₄0.005-0.3g/L，玉米浆 0.05-3g/L和CaCO₃10-50g/L，溶剂为水。

更优选的，所述出芽短梗霉活化的方法是将出芽短梗霉接种于种子培养基中，然后在温 度为23-30℃、转速180-300rpm条件下培养36-96小时；所述种子培养基各组分如下：葡萄 糖40-100g/L、硝酸铵1-5g/L、KH₂PO₄0.005-0.3g/L、ZnSO₄0.005-0.3g/L、MgSO₄0.005-0.3g/L、 玉米浆0.05-3g/L和CaCO₃10-50g/L，溶剂为水。

更优选的，所述出芽短梗霉活化的方法是将出芽短梗霉接种于种子培养基中，然后在温 度为25℃、转速为220rpm条件下培养96小时；所述种子培养基为葡萄糖90g/L、硝酸钾3 g/L、KH₂PO₄0.2g/L、ZnSO₄0.15g/L、MgSO₄0.2g/L、玉米浆2g/L和CaCO₃20g/L，溶剂 为水。

本发明的有益效果在于：本发明根据出芽短梗霉合成聚苹果酸和普鲁兰多糖的合成特点， 采用雷帕霉素靶蛋白特异性抑制剂雷帕霉素，建立操作简单的定向调控策略，可以实现对聚 苹果酸和普鲁兰多糖合成的碳代谢流流向调节，抑制聚苹果酸的合成，转向大幅度合成普鲁 兰多糖。同时添加此范围浓度的雷帕霉素对出芽短梗霉细胞生长不会造成抑制。本发明具有 发酵成本低、产量高、技术经济性强等优点，可应用于普鲁兰多糖的工业实际放大生产。

具体实施方式

下面将结合具体实施例，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

本发明使用的种子培养基为：葡萄糖40-100g/L、硝酸铵1-5g/L、KH₂PO₄0.005-0.3g/L、 ZnSO₄0.005-0.3g/L；MgSO₄0.005-0.3g/L、玉米浆0.05-0.3g/L和CaCO₃10-50g/L；种子培养 条件是采用500mL摇瓶装液量30-120mL，在温度为23-30℃，摇床转速为180-300rpm条件 下培养时间为36-96小时。

本发明使用的发酵培养基为葡萄糖、木糖或其他可利用糖50-200g/L、氮源为硫酸铵、 氯化铵、硝酸钾或硝酸钠1-5g/L、KH₂PO₄0.005-0.3g/L、ZnSO₄0.005-0.3g/L；MgSO₄0.005-0.3 g/L、玉米浆0.05-3g/L、CaCO₃10-50g/L。发酵培养条件是采用500mL摇瓶装液量30-120mL， 培养温度为23-30℃，摇床转速为180-300rpm，培养时间为96-150小时；5L发酵罐发酵工 艺为装液量3L，培养温度23-30℃，转速300-1000rpm，通气比1:0.8-1:1.6，培养时间为60-200 小时。

实施例1

取保藏号为CCTCC NO：M 2012223的出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)接种于含 50mL种子培养基的摇瓶中(摇瓶体积为500mL)，在温度为25℃，转速为220rpm条件下 培养48小时；然后取培养液按接种量为10％接种于500mL摇瓶中，摇瓶含有50mL含10mg/L 的雷帕霉素的发酵培养基，然后在温度为25℃、转速为220rpm条件下培养120小时；然后 检测培养液中聚苹果酸和普鲁兰多糖的含量。结果显示，本实施例聚苹果酸的产量为 48.01g/L，普鲁兰多糖产量为38.6g/L，出芽短梗霉细胞量为19.5g/L。

同时按照与上述相同的方法进行对比试验，区别在于发酵培养基中未加入雷帕霉素，发 酵结束检测培养液中聚苹果酸和普鲁兰多糖的含量。结果显示，实验组与对比实施实验相比， 聚苹果酸产量比对照组降低了28.7％；普鲁兰多糖产量比对照组提高了69％，出芽短梗霉细 胞量比对照组提高了21.87％。

本实施例中种子培养基为：葡萄糖60g/L、硝酸铵3g/L、KH₂PO₄0.2g/L、ZnSO₄0.1g/L、 MgSO₄0.15g/L、玉米浆2g/L和CaCO₃20g/L，溶剂为水。

发酵培养基为：葡萄糖90g/L、硫酸铵3g/L、KH₂PO₄0.2g/L、ZnSO₄0.15g/L、MgSO₄0.2g/L、3玉米浆1g/L和CaCO₃0g/L，溶剂为水。

实施例2

取保藏号为CCTCC NO：M 2012223的出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)接种于含 50mL种子培养基的摇瓶中(摇瓶体积为500mL)，在温度为23℃，转速为300rpm条件下 培养96小时；然后取培养液按接种量为10％接种于500mL摇瓶中，摇瓶含有50mL含20mg/L 的雷帕霉素的发酵培养基，然后在温度为23℃、转速为300rpm条件下培养150小时；然后 检测培养液中聚苹果酸和普鲁兰多糖的含量。结果显示，本实施例聚苹果酸的产量为47.9g/L， 普鲁兰多糖产量为39.8g/L，出芽短梗霉细胞量为21g/L。

同时按照与上述相同的方法进行对比试验，区别在于发酵培养基中未加入雷帕霉素，发 酵结束检测培养液中聚苹果酸和普鲁兰多糖的含量。结果显示，实验组与对比实施实验相比， 聚苹果酸产量比对照组降低了28.9％；普鲁兰多糖产量比对照组提高了74.2％，出芽短梗霉 细胞量比对照组提高了31.3％。

本实施例中种子培养基为：葡萄糖40g/L、硝酸铵1g/L、KH₂PO₄0.3g/L、ZnSO₄0.3g/L、 MgSO₄0.3g/L、玉米浆3g/L和CaCO₃50g/L，溶剂为水。

发酵培养基为：葡萄糖50g/L、硫酸铵1g/L、KH₂PO₄0.3g/L、ZnSO₄0.3g/L、MgSO₄0.3g/L、 玉米浆3g/L和CaCO₃50g/L，溶剂为水。

实施例3

取保藏号为CCTCC NO：M 2012223的出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)接种于含 50mL种子培养基的摇瓶中(摇瓶体积为500mL)，在温度为30℃，转速为180rpm条件下 培养36小时；然后取培养液按接种量为10％接种于500mL摇瓶中，摇瓶含有50mL含40mg/L 的雷帕霉素的发酵培养基，然后在温度为30℃、转速为300rpm条件下培养96小时；然后检 测培养液中聚苹果酸和普鲁兰多糖的含量。结果显示，本实施例聚苹果酸的产量为24.26 g/L，普鲁兰多糖产量为42g/L，出芽短梗霉细胞量为19g/L。

同时按照与上述相同的方法进行对比试验，区别在于发酵培养基中未加入雷帕霉素，发 酵结束检测培养液中聚苹果酸和普鲁兰多糖的含量。结果显示，实验组与对比实施实验相比， 聚苹果酸产量比对照组降低了63.9％；普鲁兰多糖产量比对照组提高了83.8％，出芽短梗霉 细胞量比对照组提高了18.75％。

本实施例中种子培养基为：葡萄糖100g/L、硝酸铵5g/L、KH₂PO₄0.05g/L、ZnSO₄0.05g/L、MgSO₄0.005g/L、玉米浆0.05g/L和CaCO₃10g/L，溶剂为水。

发酵培养基为：葡萄糖200g/L、硫酸铵5g/L、KH₂PO₄0.05g/L、ZnSO₄0.05g/L、MgSO₄0.05g/L、玉米浆0.05g/L和CaCO₃10g/L，溶剂为水。

实施例4

取保藏号为CCTCC NO：M 2012223的出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)接种于含 50mL种子培养基的摇瓶中(摇瓶体积为500mL)，在温度为25℃，转速为220rpm条件下 培养48小时；然后取培养液按接种量为10％接种于装液量5L发酵罐中，发酵罐含有3L含 70mg/L的雷帕霉素的发酵培养基，然后在温度为25℃、转速500rpm，通气比1:1.2条件下 培养120小时；然后检测培养液中聚苹果酸和普鲁兰多糖的含量。结果显示，本实施例聚苹 果酸的产量为10.9g/L，普鲁兰多糖产量为48.3g/L，出芽短梗霉细胞量为19.7g/L。

同时按照与上述相同的方法进行对比试验，区别在于发酵培养基中未加入雷帕霉素，发 酵结束检测培养液中聚苹果酸和普鲁兰多糖的含量。结果显示，实验组与对比实施实验相比， 聚苹果酸产量比对照组降低了83.8％；普鲁兰多糖产量比对照组提高了111.3％，出芽短梗霉 细胞量比对照组提高了23.1％。

本实施例中种子培养基为：葡萄糖60g/L、硝酸铵3g/L、KH₂PO₄0.2g/L、ZnSO₄0.1g/L、 MgSO₄0.15g/L、玉米浆2g/L和CaCO₃20g/L，溶剂为水。

发酵培养基为：葡萄糖120g/L、硫酸铵3g/L、KH₂PO₄0.2g/L、ZnSO₄0.15g/L、MgSO₄0.2g/L、玉米浆1g/L和CaCO₃30g/L，溶剂为水。

实施例5

取保藏号为CCTCC NO：M 2012223的出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)接种于含 50mL种子培养基的摇瓶中(摇瓶体积为500mL)，在温度为25℃，转速为220rpm条件下 培养48小时；然后取培养液按接种量为10％接种于装液量5L发酵罐中，发酵罐含有3L含 5mg/L的雷帕霉素的发酵培养基，然后在温度为30℃、转速1000rpm，通气比1:1.6条件下 培养60小时；然后检测培养液中聚苹果酸和普鲁兰多糖的含量。结果显示，本实施例聚苹果 酸的产量为54.2g/L，普鲁兰多糖产量为31.1g/L，出芽短梗霉细胞量为18.3g/L。

同时按照与上述相同的方法进行对比试验，区别在于发酵培养基中未加入雷帕霉素，发 酵结束检测培养液中聚苹果酸和普鲁兰多糖的含量。结果显示，实验组与对比实施实验相比， 聚苹果酸产量比对照组降低了19.6％；普鲁兰多糖产量比对照组提高了36.1％，出芽短梗霉 细胞量比对照组提高了14.4％。

本实施例中种子培养基为：葡萄糖60g/L、硝酸铵3g/L、KH₂PO₄0.2g/L、ZnSO₄0.1g/L、 MgSO₄0.15g/L、玉米浆2g/L和CaCO₃20g/L，溶剂为水。

发酵培养基为：葡萄糖120g/L、硫酸铵3g/L、KH₂PO₄0.2g/L、ZnSO₄0.15g/L、MgSO₄ 0.2g/L、玉米浆1g/L和CaCO₃30g/L，溶剂为水。

实施例6

取保藏号为CCTCC NO：M 2012223的出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)接种于含 50mL种子培养基的摇瓶中(摇瓶体积为500mL)，在温度为25℃，转速为220rpm条件下 培养48小时；然后取培养液按接种量为10％接种于装液量5L发酵罐中，发酵罐含有3L含 80mg/L的雷帕霉素的发酵培养基，然后在温度为23℃、转速300rpm，通气比1:0.8条件下 培养120小时；然后检测培养液中聚苹果酸和普鲁兰多糖的含量。结果显示，本实施例聚苹 果酸的产量为6.4g/L，普鲁兰多糖产量为49.3g/L，出芽短梗霉细胞量为18.4g/L。

同时按照与上述相同的方法进行对比试验，区别在于发酵培养基中未加入雷帕霉素，发 酵结束检测培养液中聚苹果酸和普鲁兰多糖的含量。结果显示，实验组与对比实施实验相比， 聚苹果酸产量比对照组降低了90.5％；普鲁兰多糖产量比对照组提高了115.7％，出芽短梗霉 细胞量比对照组提高了15％。

本实施例中种子培养基为：葡萄糖60g/L、硝酸铵3g/L、KH₂PO₄0.2g/L、ZnSO₄0.1g/L、 MgSO₄0.15g/L、玉米浆2g/L和CaCO₃20g/L，溶剂为水。

发酵培养基为：葡萄糖120g/L、硫酸铵3g/L、KH₂PO₄0.2g/L、ZnSO₄0.15g/L、MgSO₄0.2g/L、玉米浆1g/L和CaCO₃30g/L，溶剂为水。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述 优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和 细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。