一株米根霉菌株JHSW01在用于发酵有机废液和农林废弃物中的应用

摘要

本发明公开了一株米根霉菌株JHSW01在用于发酵有机废液和农林废弃物中的应用，所述米根霉（Rhizopus oryzae）的保藏编号是CCTCC M 2015189，本发明利用筛选到的米根霉可以用于发酵有机废液降低有机废液带来的污染，还可以用于发酵农林废弃物用于微生物肥料和饲料的生产，发酵后的农林废弃物尤其是农作物秸秆明显软烂，发酵体系pH明显下降。所述米根霉菌株生长条件宽泛，易于培养和存活，生产操作过程也比较简单。有利于发酵过程中生产效率和劳动效率的提高。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一株米根霉菌株JHSW01在用于发酵有机废液和农林废弃物中的应用。

背景技术

农作物秸秆是地球上第一大可再生资源，我国拥有量居世界首位。全国每年产生的大约6亿多吨农作物秸秆中，通过机械化还田和堆沤腐熟还田利用农作物秸秆2亿吨左右，采用青贮、氨化等过腹还田方式利用2亿吨左右，另外还有少量农作物秸秆用于气化和加工等，秸秆总量的2/3已基本实现了综合利用，还有约1/3、即2亿吨左右剩余秸秆尚未得到综合利用，一些农民采取了最简单的处理方式-焚烧，造成了大气污染、土壤矿化、火灾事故等大量的社会经济和生态问题，引起了全社会的广泛关注。

秸秆本身主要有纤维素、半纤维素和木质素三种物质组成，还含有少量蛋白质和矿物元素，是一种良好的微生物生长基质。而米根霉是中国药和酒曲中的重要霉菌之一 ，可产生大量的淀粉酶、糖化酶、蛋白酶，分解秸秆中的纤维素和半纤维素，将其转化为乳酸等有机酸。但是目前该菌种用于农林废弃物的发酵软化处理的应用较少，因此筛选合适的菌株并开发出合适的发酵工艺条件可拓宽米根霉在制浆造纸等领域的应用。

发明内容

针对目前米根霉在农林废弃物处理中应用少、发酵效率慢的状况，本发明的目的是提供了一株米根霉菌株JHSW01在用于发酵有机废液和农林废弃物中的应用，所述菌株JHSW01没有毒副作用，发酵快，菌体生长营养要求简单，本发明利用筛选到的米根霉菌株JHSW01用于发酵农林废弃物，发酵方法简易，具有良好的市场应用前景。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案予以实现：

一株米根霉菌株JHSW01在用于发酵有机废液中的应用，所述米根霉菌株JHSW01，其分类命名为Rhizopus oryzae，其保藏编号为CCTCC M 2015189。

进一步的：将米根霉菌株JHSW01接种到有机废液中，米根霉JHSW01能将有机废液中的糖转化成乳酸。

进一步的：发酵条件为：接种量为质量比0.5~5%，pH4~9，温度15℃~45℃以上，发酵时间控制在24~96h。

本发明还提供了一株米根霉菌株JHSW01在用于发酵农林废弃物中的应用，所述米根霉菌株JHSW01，其分类命名为Rhizopus oryzae，其保藏编号为CCTCC M 2015189。

进一步的：将米根霉菌株JHSW01固体发酵菌剂按质量比0.5%~5%加入到农林废弃物中，控制农林废弃物的湿度为80%-100%进行发酵。

进一步的：所述米根霉菌株JHSW01固体发酵菌剂的制备如下：将米根霉JHSW01接种到种子培养基中进行培养获得种子培养液；将所述种子培养液接种到固体培养基中进行发酵培养，按照质量比干燥农作物秸秆粉末：干燥林业废弃物粉末：氮源=5~8：2~3：1~2将三种组分混合制得固体培养基，将所述种子培养液加水稀释获得种子稀释液，调pH9.0，然后将固体培养基和所述种子稀释液混合堆积培养，固体培养发酵条件为：湿度大于80%，温度20~35℃，pH7~10，发酵48~72小时，当发酵堆表面布满米根霉菌株JHSW01菌丝体后，获得米根霉菌株固体发酵菌剂。

进一步的：所述米根霉菌株JHSW01发酵农林废弃物后的产物用于制备微生物肥料和饲料。

进一步的：所述米根霉菌株JHSW01与枯草芽孢杆菌按照菌体数量2：1复配用于发酵农林废弃物制备微生物肥料和饲料。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明从腐木中筛选到一株米根霉菌株JHSW01，经实验验证其具有产生高糖化酶活的能力，可以有效的分解纤维素和半纤维素；本发明菌种固态法生产中耐受高温，在农林废弃物的堆腐发酵过程中具有较长的繁殖发酵时间；本发明采用的培养基配方简易易于配制，有利于工业生产的成本节省；使用本发明菌种发酵条件比较宽泛，不需要精细调节，节省人力物力成本。

结合本发明的具体实施方式后，本发明的其他特点和优点将变得更加清楚。

附图说明

图1是米根霉菌株JHSW01的平板培养图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

实施例1

一、米根霉菌株JHSW01的分离筛选

2010年7月4日从山东沂南大庄小麦腐烂秸秆中取样50余份，分别取6g样品粉末浸泡在50 mL生理盐水中，20℃条件下，每2h震荡一次。分别取100μL样品悬浮液在营养琼脂平板均匀涂布，28℃恒温培养箱中培养3~7d，挑取形态典型的单菌落用划线法接种到营养琼脂平板上，通过反复多次划线得到纯菌，共筛选出8株霉菌。

将所得到的8株霉菌用接种环接种到液体PDA培养基中进行培养。获得的其中一株菌命名为米根霉JHSW01，其符合米根霉菌的生物学特性，具体为：革兰氏染色阳性；菌落稠密，菌丝匍匐爬行，最初呈白色，后变为黑褐色；假根发达，分枝呈根状，呈黑褐色；孢子丝上有厚坦孢子，孢囊梗2~4成束，孢囊梗直立有分枝，后呈黑色，参见附图1。

二、米根霉菌株JHSW01的细菌分子遗传学分类鉴定

首先提取菌株JHSW01的DNA，以该DNA为模板，18S rDNA通用引物为引物，对18S rDNA片段进行扩增。将扩增的片段直接进行序列测定。将测序的结果输入NCBI网站上的BLAST程序进行比对，结果显示该菌株18S rDNA序列与GenBank基因库中根霉菌属中的Rhizopus oryzae的18s rDNA序列同源度最高，同源率达到100%。通过DNAMAN6.0对Genbank中已有的芽孢杆菌属的18S rDNA序列进行遗传进化分析，结果显示，菌株JHSW01的18S rDNA与Rhizopus oryzae同源性最高，因此可以判定该菌株为根霉菌属的米根霉菌。

经所述生物学特性鉴定和细菌分子遗传学分类鉴定方法鉴定，可以确定所筛选到的菌株JHSW01为根霉属，米根霉菌。将筛选到的米根霉菌株JHSW01进行菌种保藏，保藏单位：中国典型培养物保藏中心（CCTCC）；地址：湖北省武汉市武昌珞珈山，武汉大学保藏中心；保藏日期：2015年4月2日，米根霉（Rhizopus oryzae）的保藏编号为CCTCC M 2015189。

三、米根霉菌株JHSW01的培养方法

1、斜面培养：采用PDA斜面培养基对米根霉菌株JHSW01进行培养；

2、种子培养：将米根霉接种到种子培养基中进行培养获得种子培养液；种子培养基的组成为：农林废弃物提取液1L；添加大豆蛋白胨10~40g，酵母膏10~40g、麦芽糖10~40g，。调整pH7.0~8.0，在10~40℃下进行培养。

所述农林废弃物提取液的配制如下：取20g秸秆粉末加入200mL水，调节pH至9，蒸煮30min，八层纱布过滤，加水至1L。

3、发酵培养：将所述种子培养液接种到固体培养基中进行发酵培养，按照质量比干燥农作物秸秆粉末：干燥林业废弃物粉末：氮源=5~8：2~3：1~2将三种组分混合制得固体培养基，将所述种子培养液加水90~100倍稀释获得种子稀释液，调pH9.0，然后将所述固体培养基和所述种子稀释液按照质量比1：1混合，堆积培养，堆积厚度可在200mm~600mm范围内，发酵过程保持湿度，pH控制在7~9，待秸秆粉末干重差别大于20%时，发酵完成，发酵曲自然晾干或吹干后即得发酵剂。

固体培养发酵条件为：湿度大于80%，温度20~35℃，pH7~10，发酵48~72小时，当发酵堆表面布满米根霉菌株JHSW01菌丝体后，获得米根霉菌株固体发酵菌剂。

四、米根霉菌株JHSW01在发酵过程中产生高糖化酶活的测定

称取麦麸2.4g，大豆蛋白胨1.6g，可溶性淀粉0.8g，K₂HPO₄0.16g，MgSO₄.7H₂O 0.04g，KCl 0.04g溶于80mL的蒸馏水后，置于250mL三角瓶中，121℃灭菌20min。冷却后接种两环斜面米根霉JHSW01菌丝体，置于30℃，190rpm条件下发酵40h，离心取1mL上清液测定酶活。利用DNS法进行米根霉糖化酶酶活的鉴定结果如下。

表1 米根霉JHSW01的糖化酶酶活实验结果

编号123平均酶活米根霉组112.21U/g112.83 U/g113.06 U/g112.7U/g

 由表1可以看出，该米根霉在接种到培养基中发酵可以产生较高的糖化酶活，其糖化酶活经试验证明可以达到110-200 U/mL的糖化酶活。

五、米根霉菌株JHSW01发酵秸秆产纤维素酶活的测定

按照《中华人民共和国轻工业行业标准》QB2583-2003中羧甲基纤维素（还原糖法）酶活力（CMCA-DNS）测定方法测定米根霉产酶能力。

实验方案为：取3g秸秆粉末和0.1g尿素加入到含有100mL蒸馏水的500mL三角瓶中，121℃灭菌，20min。冷却接入2环米根霉JHSW01菌丝体，对照组不接任何菌。发酵体系在30℃，190rpm条件下培养96h，取发酵上清液测定两组发酵体系的纤维素酶活。实验共设置了4组实验，其中三组为接种米根霉的平行实验，另一组为不接菌的对照组，实验结果如表2所示：

表2 米根霉JHSW01的纤维素酶活实验结果

编号123平均酶活米根霉组58.31U/g59.87 U/g59.46 U/g59.21U/g

对照组经过灭菌后内部没有细菌生长，故没有产生纤维素酶酶活，但是对照组可以提供秸秆高温高温灭菌后产生的还原糖量，所以实验酶活测定前均已去除秸秆粉末本身在灭菌过程中产生的还原糖影响，由表2可以看出米根霉发酵过程中能够产生纤维素酶。

六、混合发酵中米根霉JHSW01对纤维素酶产生的促进作用

称取含水率58.3%的100g秸秆粉末两份，分别添加5g尿素和200g水，接种量为按照体积质量比15%（体积质量比如将15mL菌液加入到100g秸秆粉末中），堆置在2L的烧杯中，置于30℃的恒温水浴锅中90h，发酵过程中每24h翻堆一次。发酵共设置一组实验和一组对照（对照组是将15%的米根霉种子液替换为15%的蒸馏水），发酵结束后取1g秸秆粉末加9mL的pH4.8，0.05mol/L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，浸泡30min，离心取上清液测定纤维素酶活。

按照《中华人民共和国轻工业行业标准》QB2583-2003中羧甲基纤维素（还原糖法）酶活力（CMCA-DNS）测定方法测定米根霉产酶能力。实验结果如表3所示：

表3：混合发酵中米根霉对纤维素酶产生的促进作用实验结果

 123平均酶活对照组85.62U/g86.01U/g85.98U/g85.87U/g米根霉组142.31U/g140.87 U/g143.06 U/g142.08U/g

从表3中可以看出，加入米根霉后发酵秸秆中的纤维素酶活达到了142.08U/g，比不加米根霉的发酵体系高出了1.65倍，由于此米根霉自身产纤维素酶酶量较低，由此可看出添加米根霉对于秸秆发酵菌群产纤维素酶的分泌有积极影响作用，这主要是该米根霉菌能够有效利用发酵菌群分解纤维素及半纤维素产生的糖，将其转化为乳酸，降低了底物抑制作用，有利于促进发酵菌群纤维素酶的分泌。

七、米根霉JHSW01在发酵造纸黑液中的应用

取100mLpH10的造纸黑液（含5%~15%的干物质）（干物质是指造纸黑液烘干后剩余的物质），加入适量磷酸一氨调节pH值至8.5，按照1%~5%的体积比加入米根霉JHSW01种子液（液体中密布菌丝团），30℃，180rpm，培养60h，取5mL发酵黑液离心取上清液。测定上清液中总糖和pH的变化。

表4米根霉JHSW01在造纸黑液中的应用

添加量对照1%3%5%最终pH8.27.97.56.8总糖含量62%60%55%50.4%

由表4看出，米根霉JHSW01添加量越大，黑液的pH值下降越大，黑液中的总糖含量越低，这是由于米根霉JHSW01具有发酵糖转化乳酸的能力，能有效降低黑液pH，不仅能减少造纸黑液有机质在储存过程中的腐败，还能有效减少pH调节化学品的使用量。

     八、米根霉JHSW01在发酵秸秆饲料中的应用

将玉米秸秆、花生外壳揉搓粉碎与麦麸混合，按菌体数量2：1（枯草芽孢杆菌菌体量约为1.2*10¹¹~1.5*10¹¹个/mL）的比例喷洒米根霉JHSW01和枯草芽孢杆菌JHSW06（市售菌种）的种子液，并用造纸工业产生亚硫酸盐废液调节发酵体系的湿度，30℃条件下堆置发酵7天后，100g发酵料用等重量水洗涤后干重降低10%，pH值降低到5.6，物料柔软具有很好的适口性。

九、米根霉发酵剂在农作物秸秆及林业废弃物预处理中的应用

    向粉碎成2~5cm的农作物秸秆（玉米秸秆与小麦秸秆的重量比例为1：1）添加质量比为5%的米根霉发酵菌剂（固体发酵菌剂表面布满大量菌丝体），混合均匀，控制发酵湿度90%，发酵条件为：pH7~8，温度30℃，发酵240h后，发酵料坍塌体积减少1/4，取100g发酵料用等体积重量水洗涤后干重降低5%，物料变软具有粘性。经发酵好的农作物秸秆用于碱法造纸蒸煮工序时可减少化学品的使用。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。