一种对T细胞和造血干细胞具有高效感染和促增殖能力的慢病毒载体

摘要

本发明提供了一种用于构建具有高效转染能力和表达高效生物活性的慢病毒载体方法。实验结果表明，该技术能够提高病毒感染效率达30-70％，而且发明人意外地发现，使用本发明的技术方案还能够有效刺激T细胞的增殖，进而简化CAR-T细胞治疗的流程，降低成本。

说明书

技术领域

本发明属于医学生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种用于构建具有高效转染能力和表达高效生物活性的慢病毒载体方法。

背景技术

随着生物技术的发展，基因工程(genetic engineering)在医学上的应用越来越广泛。基因工程是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品的技术。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。

对于哺乳动物细胞的遗传改造，需要使用合适的载体，将外源基因导入宿主细胞中并实现其应有的功能。常用的载体包括慢病毒载体、腺病毒载体以及逆转录病毒载体等。但是，仍然存在着感染效率低、实验流程复杂的问题。因此，本领域技术人员致力于开发新的感染效率高，且生物活性强的哺乳动物细胞遗传改造技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于构建具有高效转染能力和表达高效生物活性的慢病毒载体方法及其应用。

本发明的第一方面，提供了一种重组病毒包膜糖蛋白，所述蛋白具有式I所示的结构：

N端’ B-A C端’ (I)

其中，

元件A为衍生自野生型病毒包膜糖蛋白的蛋白元件；

元件B为辅助蛋白元件，并且所述辅助蛋白元件可特异性识别细胞膜表面蛋白；

“-”表示连接上述各元件的肽键或肽接头。

在另一优选例中，所述病毒为慢病毒、腺病毒、或腺相关病毒。

在另一优选例中，所述慢病毒为水疱口炎病毒。

在另一优选例中，所述野生型病毒包膜糖蛋白为水疱口炎病毒包膜糖蛋白。

在另一优选例中，所述元件A为VSVG(水疱口炎病毒糖蛋白)。

在另一优选例中，所述元件A的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示，优选地，所述元件A的编码多核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

在另一优选例中，所述细胞膜表面蛋白为表达于T细胞细胞膜表面的蛋白； 优选地，所述细胞膜表面蛋白选自：VLA-4、VLA-5、或其组合。

在另一优选例中，所述细胞膜表面蛋白为表达于造血干细胞细胞细胞膜表面的蛋白。

在另一优选例中，所述元件B衍生自纤连蛋白、VCAM-1或其活性片段(能够与VLA-4和/或VLA-5特异性结合的多肽片段)。

在另一优选例中，所述元件B选自：FN-p及其活性片段、CS1及其活性片段、或其组合。

在另一优选例中，所述元件B的序列如SEQ ID NO.:4、或SEQ ID NO.:6所示。

在另一优选例中，所述元件B的编码多核苷酸序列如SEQ ID NO.:3、或SEQ ID NO.:5所示。

在另一优选例中，所述重组病毒包膜糖蛋白选自下组：

(i)具有SEQ ID NO:19、21所示氨基酸序列的多肽；

(ii)具有与SEQ ID NO:19、21所示氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥

90％的同源性；等优选地≥95％的同源性；最优选地，≥97％的同源性， 

如98％以上，99％以上)的多肽，且所述多肽具有与(A)中多肽相似的活

性；

(iii)将(i)中任一所示氨基酸序列经过1-5个氨基酸残基的取代、缺失或

添加而形成的，且保留(i)中多肽活性的衍生多肽。

在另一优选例中，所述重组病毒包膜糖蛋白具有选自下组的一个或多个特性：

a)具有特异性识别细胞膜表面蛋白的活性；

b)具有促进T细胞增殖的活性。

本发明的第二方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述的多核苷酸编码本发明第一方面所述的重组病毒包膜糖蛋白。

本发明的第三方面，提供了一种载体，它含有本发明第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述载体中含有编码式I所示结构的融合蛋白的多核苷酸序列，

B-A     (I)

其中，

A为VSVG(水疱口炎病毒糖蛋白)蛋白元件；

B为辅助蛋白元件，并且所述辅助蛋白元件可特异性识别细胞膜表面蛋白；

“-”表示连接上述各元件的肽键或肽接头。

在另一优选例中，所述元件A的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示，优选地，所述元件A的编码多核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

在另一优选例中，所述细胞膜表面蛋白为表达于T细胞细胞膜表面的蛋白； 优选地，所述细胞膜表面蛋白选自：VLA-4、VLA-5、或其组合。

在另一优选例中，所述元件B衍生自纤连蛋白或VCAM-1。

在另一优选例中，所述元件B选自：FN-p及其活性片段、CS1及其活性片段、或其组合。

在另一优选例中，所述元件B的氨基酸序列如SEQ ID NO.:4、或SEQ ID NO.:6所示。

在另一优选例中，所述元件B的编码多核苷酸序列如SEQ ID NO.:3、SEQ ID NO.:5所示。

在另一优选例中，所述载体为质粒。

在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体、腺病毒载体、或腺病毒相关载体。

本发明的第四方面，提供了一种基因工程化的重组病毒，所述病毒具有本发明第一方面所述的重组病毒包膜糖蛋白。

在另一优选例中，所述病毒为慢病毒、腺病毒、或腺相关病毒。

在另一优选例中，所述病毒的基因组中具有外源基因。

在另一优选例中，所述外源基因包括表达CAR(嵌合抗原受体)的外源基因。 

在另一优选例中，所述病毒具有至少两种权利要求1所述的重组病毒包膜糖蛋白(优选为具有相同的元件A和不同的元件B)。

在另一优选例中，所述病毒的包膜糖蛋白中具有SEQ ID NO:19、和SEQ ID NO.:21所示的氨基酸序列的多肽。

本发明的第五方面，提供了一种宿主细胞，它含有本发明第三方面所述的载体或基因组中整合有本发明第二方面所述的多核苷酸。

在另一优选例中，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞(如CHO细胞、NS0细胞、或293细胞)。

本发明的第六方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括本发明第一方面所述的重组病毒包膜糖蛋白、本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的重组病毒、和/或本发明第五方面所述的宿主细胞。

在另一优选例中，所述试剂盒中包括编码本发明第一方面所述的重组病毒包膜糖蛋白的载体；和，野生型载体，所述野生型载体编码与所述重组病毒包膜糖蛋白相对应的野生型病毒包膜糖蛋白或其片段。

在另一优选例中，所述试剂盒中包括本发明第四方面所述的重组病毒。

本发明的第七方面，提供了本发明第一方面所述的重组病毒包膜糖蛋白、本发明第二方面所述的多核苷酸、本发明第三方面所述的载体的用途，用于慢病毒、或腺病毒的包装。

本发明的第八方面，提供了一种重组病毒的包装方法，所述方法包括步骤：

(1)提供一包装细胞；

(2)配制转染体系，所述转染体系中包括表达本发明第一方面所述的重组病毒包膜糖蛋白的载体；和

(3)转染包装细胞，进行病毒包装。

在另一优选例中，所述步骤(2)中，所述转染体系包括至少两种表达不同的重组病毒包膜糖蛋白的重组型载体；优选地，所述转染体系中还包括野生型载体，所述野生型载体编码与所述重组病毒包膜糖蛋白相对应的野生型病毒包膜糖蛋白或其片段。

在另一优选例中，所述重组型载体为FN-p-VSVG，和/或CS1-VSVG；所述野生型载体为野生型载体H2。

在另一优选例中，所述步骤(2)所述转染体系中包括重组型载体

FN-p-VSVG，和CS1-VSVG；以及野生型载体H2；优选地，所述重组型载体

(FN-p-VSVG和CS1-VSVG之和)与所述野生型载体的数量比为7：3-6。

在另一优选例中，所述重组型载体中FN-p-VSVG：CS1-VSVG为1：1。

在另一优选例中，所述包装细胞为HEK-293T细胞。

本发明的第九方面，提供了本发明第四方面所述的重组病毒的用途，用于制备生产CAR-T细胞的试剂。

本发明的第十方面，提供了一种制剂，所述制剂含有本发明第四方面所述的重组病毒和任选的赋形剂。

在另一优选例中，所述的制剂为药物制剂。

在另一优选例中，所述的赋形剂为药学上可接受的赋形剂。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了野生型H2质粒的结构图谱。

图2显示了经重组的FN-p–VSVG质粒的结构图谱。

图3显示了经重组的CS1-VSVG质粒的结构图谱。

图4中A图显示了转染体系中不同类型H2质粒配比对病毒产量的影响，B图显示了成功表达的病毒颗粒的免疫印迹检测结果。

图5显示了本发明中经改造的慢病毒对T细胞的感染效率的检测结果。

图6显示了本发明中经改造的慢病毒能够显著的促进T细胞扩增。

图7显示了本发明中经改造的慢病毒对不同类型的细胞均表现出了较高的 感染效率效率。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，获得一种能够高效转染哺乳动物细胞的技术，实验结果表明，该技术能够提高病毒感染效率达30-70％，而且发明人意外地发现，使用本发明的技术方案还能够有效刺激T细胞的增殖，进而简化CAR-T细胞治疗的流程，降低成本。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

具体地，本发明涉及一种新型的慢病毒包膜质粒，可应用于慢病毒的包装及哺乳动物细胞的感染实验，包括CAR-T细胞治疗T细胞活化及感染实验。目前常规实验所使用的慢病毒都是使用VSVG作为包膜糖蛋白的，但是该型包膜糖蛋白的慢病毒在感染一些难感染的哺乳动物细胞时，效率较低。本发明中通过重组人纤连蛋白的细胞结合域或CS1功能域，与VSVG融合表达，从而使新型的慢病毒获得特异性靶向VLA-5、VLA-4抗原的能力，进一步提高病毒感染效率。同时，重组的纤连蛋白还能刺激T淋巴细胞的增殖。在CAR-T细胞治疗T细胞活化阶段，使用该新型慢病毒可在活化T细胞的同时即转入外源基因，简化实验流程，降低成本。而普通的慢病毒并无此功能。

将纤连蛋白的细胞识别域与CS1功能域分别与慢病毒的包膜质粒H2的VSVG基因融合表达，与载体质粒、辅助质粒H1共转染293T细胞，从而得到可靶向细胞表面的VLA-4、VLA-5抗原的新型慢病毒颗粒。与传统方法相比，可极大提高慢病毒感染哺乳动物细胞的效率(可达30-70％)，此外还能促使T淋巴细胞成千上万倍的增殖。

VSVG

在本发明中，术语VSVG指水疱性口炎病毒糖蛋白，在本发明的一个优选的实施方式中，所述VSVG的氨基酸序列如下：

MKCLLYLAFLFIGVNCKFTIVFPHNQKGNWKNVPSNYHYCPSSSDLNWHNDLIGTALQVKMPKSHKAIQADGWMCHASKWVTTCDFRWYGPKYITHSIRSFTPSVEQCKESIEQTKQGTWLNPGFPPQSCGYATVTDAEAVIVQVTPHHVLVDEYTGEWVDSQFINGKCSNYICPTVHNSTTWHSDYKVKGLCDSNLISMDITFFSEDGELSSLGKEGTGFRSNYFAYETGGKACKMQYCKHWGVRLPSGVWFEMADKDLFAAARFPECPEGSSISAPSQTSVDVSLIQDVERILDYSLCQETWSKIRAGLPISPVDLSYLAPKNPGTGPA FTIINGTLKYFETRYIRVDIAAPILSRMVGMISGTTTERELWDDWAPYEDVEIGPNGVLRTSSGYKFPLYMIGHGMLDSDLHLSSKAQVFEHPHIQDAASQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK(SEQ ID NO.:2，含可选地信号肽)；

其编码多核苷酸序列为：

atgaagtgccttttgtacttagcctttttattcattggggtgaattgcaagttcaccatagtttttccacacaaccaaaaaggaaactggaaaaatgttccttctaattaccattattgcccgtcaagctcagatttaaattggcataatgacttaataggcacagccttacaagtcaaaatgcccaagagtcacaaggctattcaagcagacggttggatgtgtcatgcttccaaatgggtcactacttgtgatttccgctggtatggaccgaagtatataacacattccatccgatccttcactccatctgtagaacaatgcaaggaaagcattgaacaaacgaaacaaggaacttggctgaatccaggcttccctcctcaaagttgtggatatgcaactgtgacggatgccgaagcagtgattgtccaggtgactcctcaccatgtgctggttgatgaatacacaggagaatgggttgattcacagttcatcaacggaaaatgcagcaattacatatgccccactgtccataactctacaacctggcattctgactataaggtcaaagggctatgtgattctaacctcatttccatggacatcaccttcttctcagaggacggagagctatcatccctgggaaaggagggcacagggttcagaagtaactactttgcttatgaaactggaggcaaggcctgcaaaatgcaatactgcaagcattggggagtcagactcccatcaggtgtctggttcgagatggctgataaggatctctttgctgcagccagattccctgaatgcccagaagggtcaagtatctctgctccatctcagacctcagtggatgtaagtctaattcaggacgttgagaggatcttggattattccctctgccaagaaacctggagcaaaatcagagcgggtcttccaatctctccagtggatctcagctatcttgctcctaaaaacccaggaaccggtcctgctttcaccataatcaatggtaccctaaaatactttgagaccagatacatcagagtcgatattgctgctccaatcctctcaagaatggtcggaatgatcagtggaactaccacagaaagggaactgtgggatgactgggcaccatatgaagacgtggaaattggacccaatggagttctgaggaccagttcaggatataagtttcctttatacatgattggacatggtatgttggactccgatcttcatcttagctcaaaggctcaggtgttcgaacatcctcacattcaagacgctgcttcgcaacttcctgatgatgagagtttattttttggtgatactgggctatccaaaaatccaatcgagcttgtagaaggttggttcagtagttggaaaagctctattgcctcttttttctttatcatagggttaatcattggactattcttggttctccgagttggtatccatctttgcattaaattaaagcacaccaagaaaagacagatttatacagacatagagatgaaccgacttggaaagtaa(SEQ ID NO.:1)。

纤连蛋白

纤连蛋白(Fibronectin，FN)，也称纤维连接蛋白，是一种高分子糖蛋白，具有多种生物学功能。FN广泛存在于动物组织和组织液中，分子量约为450KD，具有多种生物活性。

FN-p：纤连蛋白前体(Fibronectin precursor)，可与细胞表面的VLA-5结合，在本发明的一个优选的实施方式中，FN-p的氨基酸序列为

PTDLRFTNIGPDTMRVTWAPPPSIDLTNFLVRYSPVKNEEDVAELSISPSDNAVVLTNLLPGTEYVVSVSSVYEQHESTPLRGRQKTGLDSPTGIDFSDITANSFTVHWIAPRATITGYRIRHHPEHFSGRPREDRVPHSRNSITLTNLTPGTEYVVSIVALNGREESPLLIGQQSTVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTEIDKPS(SEQ ID NO.:4)，

其编码多核苷酸序列为：

cccactgacctgcgattcaccaacattggtccagacaccatgcgtgtcacctgggctccacccccatccattgatttaaccaacttcctggtgcgttactcacctgtgaaaaatgaggaagatgttgcagagttgtcaatttctccttcagacaatgcagtggtcttaacaaatctcctgcctggtacagaatatgtagtgagtgtctccagtgtctacgaacaacatgagagcacacctcttagaggaagacagaaaacaggtcttgattccccaactggcattgacttttctgatattactgccaactcttttactgtgcactggattgctcctcgagccaccatcactggctacaggatccgccatcatcccgagcacttcagtgggagacctcgagaagatcgggtgccccactctcggaattccatcaccctcaccaacctcactccaggcacagagtatgtggtcagcatcgttgctcttaatggcagagaggaaagtcccttattgattggccaacaatcaacagtttctgatgttccgagggacctggaagttgttgctgcgacccccaccagcctactgatcagctgggatgctcctgctgtcacagtgagatattacaggatcacttacggagaaacaggaggaaatagccctgtccaggagttcactgtgcctgggagcaagtctacagctaccatcagcggccttaaacctggagttgattataccatcactgtgtatgctgtcactggccgtggagacagccccgcaagcagcaagccaatttccattaattaccgaacagaaattgacaaaccatcc(SEQ ID NO.:3)。

CS1：纤连蛋白的另一功能域，可与细胞表面的VLA-4结合，在本发明的一个优选的实施方式中，CS1的氨基酸序列为

DELPQLVTLPHPNLHGPEILDVPST(SEQ ID NO.:6)，

其编码多核苷酸序列为：

gacgagcttccccaactggtaacccttccacaccccaatcttcatggaccagagatcttggatgttccttccaca(SEQ ID NO.:5)。

VLA-5：极迟抗原-5，分布于胸腺细胞、单核细胞、血小板、T细胞，配体为纤连蛋白。

VLA-4：极迟抗原-4，分布于胸腺细胞、单核细胞、B细胞、T细胞、NK细胞，配体为纤连蛋白和VCAM-1。

重组病毒包膜糖蛋白

在本发明的一个优选的实施方式中，将FN-p及CS1分别与慢病毒包装辅助质粒中的VSVG融合表达，形成不同的重组质粒FN-p–VSVG、CS1-VSVG，将这两种质粒分别或共同与对应野生型辅助质粒(如H2质粒，购自Addgene，即pVSV-G，图1)进行慢病毒包装，可以增加对哺乳动物细胞的感染效率，同时可以起到促进T细胞扩增的功能。

优选地方案如下：

1.将FN-p与VSVG融合表达，结构为：SS-6His-FN-p-VSVG，该重组质粒命名为FN-p-VSVG；(SS为信号肽，其氨基酸序列为MKCLLYLAFLFIGVNC，SEQ ID NO.:7)

2.将CS1与VSVG融合表达，结构为：SS-6His-CS1-VSVG，该重组质粒命名为CS1-VSVG；

3.将载体质粒(携带外源基因，如增强性绿色荧光蛋白EGFP)、辅助质粒H1(购自Addgene，含有HIV-1的gag/pol基因)、辅助质粒FN-p–VSVG、辅助质粒CS1-VSVG，共转染293T细胞得到病毒颗粒i；

4.将病毒i感染哺乳动物细胞，从而将外源基因导入哺乳动物细胞中。

在本发明优选地实施方式中，SS-6His-FN-p-VSVG融合蛋白的氨基酸序列为：

MKCLLYLAFLFIGVNCHHHHHHPTDLRFTNIGPDTMRVTWAPPPSIDLTNFLVRYSPVKNEEDVAELSISPSDNAVVLTNLLPGTEYVVSVSSVYEQHESTPLRGRQKTGLDSPTGIDFSDITANSFTVHWIAPRATITGYRIRHHPEHFSGRPREDRVPHSRNSITLTNLTPGTEYVVSIVALNGREESPLLIGQQSTVSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYRITYGETGGNSPVQEFTVPGSKSTATISGLKPGVDYTITVYAVTGRGDSPASSKPISINYRTEIDKPSGGGSGGGSSGGGSKFTIVFPHNQKGNWKNVPSNYHYCPSSSDLNWHNDLIGTALQVKMPKSHKAIQADGWMCHASKWVTTCDFRWYGPKYITHSIRSFTPSVEQCKESIEQTKQGTWLNPGFPPQSCGYATVTDAEAVIVQVTPHHVLVDEYTGEWVDSQFINGKCSNYICPTVHNSTTWHSDYKVKGLCDSNLISMDITFFSEDGELSSLGKEGTGFRSNYFAYETGGKACKMQYCKHWGVRLPSGVWFEMADKDLFAAARFPECPEGSSISAPSQTSVDVSLIQDVERILDYSLCQETWSKIRAGLPISPVDLSYLAPKNPGTGPAFTIINGTLKYFETRYIRVDIAAPILSRMVGMISGTTTERELWDDWAPYEDVEIGPNGVLRTSSGYKFPLYMIGHGMLDSDLHLSSKAQVFEHPHIQDAASQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK SEQ ID NO.:19，

其编码多核苷酸序列为：

atgaagtgccttttgtacttagcctttttattcattggggtgaattgccatcatcatcatcat catcccactgacctgcgattcaccaacattggtccagacaccatgcgtgtcacctgggctccacccccatccattgatttaaccaacttcctggtgcgttactcacctgtgaaaaatgaggaagatgttgcagagttgtcaatttctccttcagacaatgcagtggtcttaacaaatctcctgcctggtacagaatatgtagtgagtgtctccagtgtctacgaacaacatgagagcacacctcttagaggaagacagaaaacaggtcttgattccccaactggcattgacttttctgatattactgccaactcttttactgtgcactggattgctcctcgagccaccatcactggctacaggatccgccatcatcccgagcacttcagtgggagacctcgagaagatcgggtgccccactctcggaattccatcaccctcaccaacctcactccaggcacagagtatgtggtcagcatcgttgctcttaatggcagagaggaaagtcccttattgattggccaacaatcaacagtttctgatgttccgagggacctggaagttgttgctgcgacccccaccagcctactgatcagctgggatgctcctgctgtcacagtgagatattacaggatcacttacggagaaacaggaggaaatagccctgtccaggagttcactgtgcctgggagcaagtctacagctaccatcagcggccttaaacctggagttgattataccatcactgtgtatgctgtcactggccgtggagacagccccgcaagcagcaagccaatttccattaattaccgaacagaaattgacaaaccatccggaggcggttcaggaggtggctcgagcggaggcggttcaaagttcaccatagtttttccacacaaccaaaaaggaaactggaaaaatgttccttctaattaccattattgcccgtcaagctcagatttaaattggcataatgacttaataggcacagccttacaagtcaaaatgcccaagagtcacaaggctattcaagcagacggttggatgtgtcatgcttccaaatgggtcactacttgtgatttccgctggtatggaccgaagtatataacacattccatccgatccttcactccatctgtagaacaatgcaaggaaagcattgaacaaacgaaacaaggaacttggctgaatccaggcttccctcctcaaagttgtggatatgcaactgtgacggatgccgaagcagtgattgtccaggtgactcctcaccatgtgctggttgatgaatacacaggagaatgggttgattcacagttcatcaacggaaaatgcagcaattacatatgccccactgtccataactctacaacctggcattctgactataaggtcaaagggctatgtgattctaacctcatttccatggacatcaccttcttctcagaggacggagagctatcatccctgggaaaggagggcacagggttcagaagtaactactttgcttatgaaactggaggcaaggcctgcaaaatgcaatactgcaagcattggggagtcagactcccatcaggtgtctggttcgagatggctgataaggatctctttgctgcagccagattccctgaatgcccagaagggtcaagtatctctgctccatctcagacctcagtggatgtaagtctaattcaggacgttgagaggatcttggattattccctctgccaagaaacctggagcaaaatcagagcgggtcttccaatctctccagtggatctcagctatcttgctcctaaaaacccaggaaccggtcctgctttcaccataatcaatggtaccctaaaatactttgagaccagatacatcagagtcgatattgctgctccaatcctctcaagaatggtcggaatgatcagtggaactaccacagaaagggaactgtgggatgactgggcaccatatgaagacgtggaaattggacccaatggagttctgaggaccagttcaggatataagtttcctttatacatgattggacatggtatgttggactccgatcttcatcttagctcaaaggctcaggtgttcgaacatcctcacattcaagacgctgcttcgcaacttcctgatgatgagagtttattttttggtgatactgggctatccaaaaatccaatcgagcttgtagaaggttggttcagtagttggaaaagctctattgcctcttttttctttatcatagggttaatcattggactattcttggttctccgagttggtatccatctttgcattaaattaaagcacaccaagaaaagacagatttatacagacatagagatgaaccgacttggaaagtaa SEQ ID NO.:18。

在本发明优选地实施方式中，SS-6His-CS1-VSVG融合蛋白的氨基酸序列为：

MKCLLYLAFLFIGVNCHHHHHHDELPQLVTLPHPNLHGPEILDVPSTGGGSGGGSSGGGSKFTIVFPHNQKGNWKNVPSNYHYCPSSSDLNWHNDLIGTALQVKMPKSHKAIQADGWMCHASKWVTTCDFRWYGPKYITHSIRSFTPSVEQCKESIEQTKQGTWLNPGFPPQSCGYATVTDAEAVIVQVTPHHVLVDEYTGEWVDSQFINGKCSNYICPTVHNSTTWHSDYKVKGLCDSNLISMDITFFSEDGELSSLGKEGTGFRSNYFAYETGGKACKMQYCKHWGVRLPSGVWFEMADKDLFAAARFPECPEGSSISAPSQTSVDVSLIQDVERILDYSLCQETWSKIRAGLPISPVDLSYLAPKNPGTGPAFTIINGTLKYFETRYIRVDIAAPILSRMVGMISGTTTERELWDDWAPYEDVEIGPNGVLRTSSGYKFPLYMIGHGMLDSDLHLSSKAQVFEHPHIQDAASQLPDDESLFFGDTGLSKNPIELVEGWFSSWKSSIASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCIKLKHTKKRQIYTDIEMNRLGK SEQ ID NO.:21，

其编码多核苷酸序列为：

atgaagtgccttttgtacttagcctttttattcattggggtgaattgccatcatcatcatcatcatgacgagcttccccaactggtaacccttccacaccccaatcttcatggaccagagatcttggatgttccttccacaggaggcggttcaggaggtggctcgagcggaggcggttcaaagttcaccatagtttttccacacaaccaaaaaggaaactggaaaaatgttccttctaattaccattattgcccgtcaagctcagatttaaattggcataatgacttaataggcacagccttacaagtcaaaatgcccaagagtcacaaggctattcaagcagacggttggatgtgtcatgcttccaaatgggtcactacttgtgatttccgctggtatggaccgaagtatataacacattccatccgatccttcactccatctgtagaacaatgcaaggaaagcattgaacaaacgaaacaaggaacttggctgaatccaggcttccctcctcaaagttgtggatatgcaactgtgacggatgccgaagcagtgattgtccaggtgactcctcaccatgtgctggttgatgaatacacaggagaatgggttgattcacagttcatcaacggaaaatgcagcaattacatatgccccactgtccat aactctacaacctggcattctgactataaggtcaaagggctatgtgattctaacctcatttccatggacatcaccttcttctcagaggacggagagctatcatccctgggaaaggagggcacagggttcagaagtaactactttgcttatgaaactggaggcaaggcctgcaaaatgcaatactgcaagcattggggagtcagactcccatcaggtgtctggttcgagatggctgataaggatctctttgctgcagccagattccctgaatgcccagaagggtcaagtatctctgctccatctcagacctcagtggatgtaagtctaattcaggacgttgagaggatcttggattattccctctgccaagaaacctggagcaaaatcagagcgggtcttccaatctctccagtggatctcagctatcttgctcctaaaaacccaggaaccggtcctgctttcaccataatcaatggtaccctaaaatactttgagaccagatacatcagagtcgatattgctgctccaatcctctcaagaatggtcggaatgatcagtggaactaccacagaaagggaactgtgggatgactgggcaccatatgaagacgtggaaattggacccaatggagttctgaggaccagttcaggatataagtttcctttatacatgattggacatggtatgttggactccgatcttcatcttagctcaaaggctcaggtgttcgaacatcctcacattcaagacgctgcttcgcaacttcctgatgatgagagtttattttttggtgatactgggctatccaaaaatccaatcgagcttgtagaaggttggttcagtagttggaaaagctctattgcctcttttttctttatcatagggttaatcattggactattcttggttctccgagttggtatccatctttgcattaaattaaagcacaccaagaaaagacagatttatacagacatagagatgaaccgacttggaaagtaa SEQ ID NO.:20。

在本发明中，“融合蛋白”、“重组蛋白”、“本发明蛋白”、“本发明融合蛋白”可互换使用，指具有式Ia或Ib所述结构，即含有包括衍生自野生型病毒包膜糖蛋白的蛋白元件；和可特异性识别细胞膜表面蛋白的蛋白元件融合而成的多肽。代表性的例子包括FN-p-VSVG融合蛋白、和CS1-VSVG融合蛋白。此外，应理解，所述术语还包括融合蛋白的活性片段和衍生物，这些活性片段和衍生物能能够特异性结合细胞膜表面蛋白。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白质片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码多肽的功能。

如本文所用，术语“引物”指的是在与模板配对，在DNA聚合酶的作用下能以其为起点进行合成与模板互补的DNA链的寡聚核苷酸的总称。引物可以是天然的RNA、DNA，也可以是任何形式的天然核苷酸。引物甚至可以是非天然的核苷酸如LNA或ZNA等。引物“大致上”(或“基本上”)与模板上一条链上的一个特殊的序列互补。引物必须与模板上的一条链充分互补才能开始延伸，但引物的序列不必与模板的序列完全互补。比如，在一个3'端与模板互补的引物的5'端加上一段与模板不互补的序列，这样的引物仍大致上与模板互补。只要有足够长的引物能与模板充分的结合，非完全互补的引物也可以与模板形成引物-模板复合物，从而进行扩增。

本发明融合蛋白或其元件(如VSVG)的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或融合蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述蛋白质的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组蛋白。一般来说有以下步骤：

(1)用本发明的编码本发明蛋白的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明蛋白的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、NS0、COS7、或293细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获， 用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用RbCl。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

应理解，所述术语还包括本发明融合蛋白的衍生物，指本发明融合蛋白在经过1-3个氨基酸添加或替换、1-2个氨基酸缺失并仍具有肿瘤抑制活性的多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

最初的残基 代表性的取代 优选的取代 Ala(A) Val；Leu；Ile Val Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys Asn(N) Gln；His；Lys；Arg Gln Asp(D) Glu Glu Cys(C) Ser Ser Gln(Q) Asn Asn Glu(E) Asp Asp Gly(G) Pro；Ala Ala His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe Leu Leu(L) Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg Met(M) Leu；Phe；Ile Leu Phe(F) Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Leu Pro(P) Ala Ala Ser(S) Thr Thr Thr(T) Ser Ser Trp(W) Tyr；Phe Tyr Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala Leu

一旦鉴定获得了相关的肽序列，就可以用重组法来大批量地获得相关肽序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到相关肽(融合蛋白)。

此外，还可用化学方法直接合成相关肽序列。

肽接头

本发明提供了一种融合蛋白，它可任选地含有肽接头。肽接头大小和复杂性可能会影响蛋白的活性。通常，肽接头应当具有足够的长度和柔韧性，以保证连接的两个蛋白在空间上有足够的自由度以发挥其功能。同时避免肽接头中形成α螺旋或β折叠等对融合蛋白的稳定性的影响。

连接肽的长度一般为0-20个氨基酸，较佳地1-15个氨基酸。为了保证效果，本发明使用的连接肽为13个氨基酸。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明的技术方案能够显著的提高针对哺乳动物细胞的感染效率；

(2)本发明的技术方案能够极大的促进T细胞的增殖。 

(3)首次发现了在慢病毒颗粒表面融合FN-p和/或CS1能够显著刺激T细胞增殖的功能。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1：构建重组慢病毒载体

重组慢病毒载体的构建是基于携带有VSVG基因的病毒包装辅助质粒H2(购自Addgene，即pVSV-G)进行的。

FN-p-VSVG重组慢病毒载体构建：

a)获得FN-p基因片段： 

全基因合成信号肽-6His-FN-p-柔性肽片段(信号肽核苷酸序列信息为SEQ ID NO.:8，6His核苷酸序列信息为SEQ ID NO.:9，FN-p核苷酸序列信息为SEQ ID NO.:3，柔性肽核苷酸序列信息为SEQ ID NO.:10)，以全基因合成质粒为模板，设计FN-p基因引物，正向引物1(5'TTCCTCGACGGATCCCTCGAGATGAAGTGCCTTTTGTACTTAGCCTTTTTATTCATTGG3'，SEQ ID NO.:11)和反向引物2(5'TGGTGAACTTTGAACCGCCTCCGCTCGAGCCAC3'，SEQ ID NO.:12)，PCR扩增，PCR条件为：98℃变性3分钟；98℃变性10秒，60℃退火10秒，72℃延伸1分钟，30个循环；72℃8分钟；由此获得FN-p基因片段。

b)获得VSVG基因片段： 

以病毒包装辅助质粒H2(参照质粒图1，SEQ ID NO.:1)为模板，设计VSVG基因引物，正向引物3(5'GAGGCGGTTCAAAGTTCACCATAGTTTTTCCAC 3'，SEQ ID NO.:13)和反向引物4(5'TCCTCGACGGATCCCTCGAGTTACTTTCCAAGTCGGTTCATCTC3'，SEQ ID NO.:14)，PCR扩增，PCR条件为：98℃变性3分钟；98℃变性10秒，60℃退火10秒，72℃延伸1分钟30秒，30个循环；72℃8分钟；由此获得VSVG基因片段。

c)获得信号肽-6His-FN-p-柔性肽-VSVG重组基因片段：

以步骤a、b获得的基因片段为模板，正向引物1(5'TTCCTCGACGGATCCCTCGAGATGAAGTGCCTTTTGTACTTAGCCTTTTTATTCATTGG3'，SEQ ID NO.:11)和反向引物4(5'TCCTCGACGGATCCCTCGAGTTACTTTCCAAGTCGGTTCATCTC 3'，SEQ ID NO.:14)，Overlap PCR扩增，PCR条件为：98℃变性3分钟；98℃变性10秒，60℃退火10秒，72℃延伸2分钟30秒，30个循环；72℃8分钟；由此获得信号肽-6His-FN-p-柔性肽-VSVG重组基因片段。

d)病毒包装辅助质粒H2的处理：

用XhoI酶切H2质粒(购自Addgene，即pVSV-G)，获得4.8Kb和1676bp两个片段，凝胶回收纯化4.8Kb的载体片段。

e)In-Fusion(重组酶法)构建FN-p-VSVG重组逆转录病毒载体

将步骤c获得重组基因片段与步骤d获得的酶切载体做In-Fusion同源重组，获得FN-p-VSVG重组逆转录病毒载体，其In-Fusion同源重组体系(购自苏州神洲基因有限公司)和条件如下： 

In-Fusion Enzyme：1μl

In-Fusion Buffer：2μl

重组基因片段：300ng

酶切载体片段：100ng

双蒸水：总体积补到10μl

37℃30分钟。

CS1-VSVG重组慢病毒载体构建：

f)获得CS1基因片段： 

全基因合成信号肽-6His-CS1-柔性肽片段(信号肽核苷酸序列信息为SEQ ID NO.:8，6His核苷酸序列信息为SEQ ID NO.:9，CS1核苷酸序列信息为SEQ ID NO.:5，柔性肽核苷酸序列信息为SEQ ID NO.:10)，以全基因合成质粒为模板，设计CS1基因引物，正向引物5(5'CTTAGCCTTTTTATTCATTGGGGTGAATTGCCATCATCATCATCATCATGACGAGCTTCCCCAACTGGT 3'，SEQ ID NO.:15)和反向引物6(5'GGTTGTGTGGAAAAACTATGGTGAAC 3'，SEQ ID NO.:16)，PCR扩增，PCR条件为：98℃变性3分钟；98℃变性10秒，60℃退火10秒，72℃延伸20秒，30个循环；72℃8分钟；由此获得CS1基因片段。

g)获得VSVG基因片段： 

以病毒包装辅助质粒H2(参照质粒图1，VSVG基因SEQ ID NO.:1)为模板，设计VSVG基因引物，正向引物7(5'GTTCACCATAGTTTTTCCACACAACC 3'，SEQ ID NO.:17)和反向引物4(5'TCCTCGACGGATCCCTCGAGTTACTTTCCAAGTCGGTTCATCTC 3'，SEQ ID NO.:14)，PCR扩增，PCR条件为：98℃变性3分钟；98℃变性10秒，60℃退火10秒，72℃延伸1分钟30秒，30个循环；72℃8分钟；由此获得VSVG基因片段。

h)获得信号肽-6His-CS1-柔性肽-VSVG重组基因片段：

以步骤a、b获得的基因片段为模板，正向引物1(5'TTCCTCGACGGATCCCTCGAGCGCCACCATGAAGTGCCTTTTGTACTTAGCCTTTTTATTCATTGG3'，SEQ ID NO.:11)和反向引物4(5'TCCTCGACGGATCCCTCGAGTTACTTTCCAAGTCGGTTCATCTC 3'，SEQ ID NO.:14)，Overlap PCR扩增，PCR条件为：98℃变性3分钟；98℃变性10秒，60℃退火10秒，72℃延伸1分钟50秒，30个循环；72℃8分钟；由此获得信号肽-6His-CS1-柔性肽-VSVG重组基因片段。

i)病毒包装辅助质粒H2的处理：

用XhoI酶切H2质粒，获得4.8Kb和1676bp两个片段，凝胶回收纯化4.8Kb的载体片段。

j)In-Fusion构建CS1-VSVG重组逆转录病毒载体

将步骤c获得重组基因片段与步骤d获得的酶切载体做In-Fusion同源重组，获得CS1-VSVG重组逆转录病毒载体，其In-Fusion同源重组体系(购自苏州神洲基因有限公司)和条件如下： 

In-Fusion Enzyme：1μl

In-Fusion Buffer：2μl

重组基因片段：300ng

酶切载体片段：100ng

双蒸水：总体积补到10μl

37℃30分钟。

k)转化

取数只TOP10(100μl)感受态置于冰上，待其融化后加入步骤e、j同源重组产物，冰浴30分钟，42℃热激90秒，继续冰浴2-3分钟；加入无抗生素的LB培养基500μl，37℃220rpm培养1小时；5000rpm离心1分钟，超净工作台中弃去450μl上清液，将剩余培养基与菌体吹匀，涂布在相应抗性的LB固体培养基上；37℃过夜培养。

l)阳性克隆鉴定 

通过菌落PCR的方法鉴定阳性克隆并送测序，比对分析结果后最终确定带有正确序列的克隆。

m)质粒抽提

使用碱裂解法或购买质粒抽提试剂盒提取重组的慢病毒质粒FN-p-VSVG、CS1-VSVG，测定浓度后，-20℃冰箱保存。

本发明所用的基因序列说明如下：

信号肽核苷酸序列SEQ ID NO.:8：

atgaagtgccttttgtacttagcctttttattcattggggtgaattgc

6His核苷酸序列SEQ ID NO.:9：CATCATCATCATCATCAT

柔性肽核苷酸序列SEQ ID NO.:10：

GGAGGCGGTTCAGGAGGTGGCTCGAGCGGAGGCGGTTCA

H2质粒带有CMV启动子，该启动子可在真核细胞中大量启动下游基因表达，无组织特异性。在CMV启动子与VSVG之间还有β-Globin序列，在VSVG下游也有一段β-Globin序列，该序列的存在在一定程度上可增强VSVG基因在真核细胞中的转录水平。然而，本领域的技术人员应该理解，插入的PN-p与CS1基因还可以通过本领域公知的分子克隆方法获得，例如，从样品组织中提取总RNA，设计特异性引物，进行RT-PCR可获得目的插入片段。

实施例2：重组慢病毒包装

1.按照24h传代周期供应HEK-293T细胞(购自ATCC)，转染前换液，每盘细胞用电动移液器更换5ml含2％FBS的DMEM培养基。

2.配制转染体系，依次加入质粒H1(购自Addgene公司，12μg/盘，盘指10cm细胞培养皿下同)、质粒H2(H2质粒的总量为10μg/盘，在本实施例中，重组型和野生型H2质粒以不同比例搭配)、载体质粒(包含外源基因的慢病毒载体，购自Addgene公司，24μg/盘)、CaCl₂(50μl/盘)，最后在旋 涡震荡器上边震荡边逐滴加入2×HBS(500μl/盘)，转染体系为1ml/盘。其中重组H2为FN-p-VSVG重组质粒和CS1-VSVG重组质粒1：1混合。

3.小心吹打转染体系，混匀后取1000μl逐滴加入293T细胞，操作保持稳定使转染体系均匀分布于10cm平皿。

4.保持平皿水平，并使平皿内液体前后左右分别各晃动十次，混匀过程要充分，但不能有液体溅出或流到平皿壁外，然后置于37℃，5％CO₂培养箱中培养。转染后8小时，弃去上清液，用电动移液器更换含DMEM培养基。

5.转染结束后28-30小时之间开始第一次收集上清，补齐10ml DMEM培养基。在转染结束后48-50小时开始第二次收集上清。超速离心，重悬于100ul DMEM以备后用。

FN-p-VSVG和CS1-VSVG以1:1的比例加入，与野生型的H2以不同比例搭配及对应慢病毒颗粒产量(严格使用clontech的Lenti-X p24Rapid titer kit进行检测)，结果见图4A。可见，当FN-p-VSVG和CS1-VSVG占所用H2总量为30％时，慢病毒产量最高。采用这一组的条件所得病毒颗粒进行免疫印迹(Western blot)的方法检验，可见经修饰的VSVG正常表达，见图4B。

实施例3：重组慢转录病毒感染T淋巴细胞

感染实验按照本领域技术人员已知的常规方法进行。简述感染步骤如下：

1.外周血单核淋巴细胞(PBMC)的获得，通过血液单采系统获得>1x10⁷的细胞。

2.使用完全培养基(TexMACS培养基+5％的自体血清)调整部分细胞悬液使其终浓度为0.7×10⁶/ml，并加入白介素2(IL-2)，青霉素(penicillin)和链霉素(streptomycin)、OKT3及牛血清白蛋白(BSA)，令其终浓度分别为600IU/ml，100U/ml，100μg/ml和0.2％。

3.将重悬好的细胞轻轻混匀，取出0.4ml的细胞悬液(总细胞量0.28×10⁶)转移至1.5mL离心管中。 

4.加入所需要的病毒，按照MOI为10来计算添加的病毒量。

5.将加入的病毒与细胞悬液轻轻混匀，再将细胞与病毒混合液转移至24-孔板中。

6.将细胞板置于32℃预热的板式离心机1000g离心30分钟。

7.然后放于37℃，5％CO₂的培养箱培养。

8.8-12小时后，向感染过病毒的PBMC细胞补加1mL的完全培养基(TexMACS培养基+5％的自体血清+600IU/ml的白介素2(IL-2)，100U/ml的青霉素(penicillin)，100μg/ml的链霉素(streptomycin)及0.2％牛血清白蛋白(BSA)。

9.在细胞培养过程中每隔一天用完全培养基将细胞进行换液，维持细胞的密度在维持细胞密度维持在0.5-2×10⁶/ml。

10.将胞放于37℃，5％CO₂的培养箱培养中培养4天后进行效果测。

实施例4：重组慢病毒的效果检测

1.感染效率检测 

1.1经细胞计数后收集1×10⁶个细胞，400g离心5min。

1.2弃去培养基，加入500μl流式洗液(PBS，PH7.2，+2％BSA，0.22μm滤膜过滤)，洗涤一次。

1.3去除流式洗液将细胞沉用手指淀轻轻弹散。

1.4加入FACS洗液，4℃400g 5min离心，弃上清；

1.5加入400ul FACS洗液将细胞重悬，再转移到400ul细胞悬液到96- 孔板中，准备上机检测，检测结果见图5。

由图5可见，对T细胞的感染，野生型VSVG包被的慢病毒感染效率明显弱于经改造的VSVG。

实施例5：经改造的慢病毒可促进T细胞增殖

实施例4中的细胞，除了进行流式外，还连续多天进行细胞计数，其生长曲线如图6所示。

由图6可见，改造后的T淋巴细胞扩增倍数明显提高，约为野生型的2倍以上。

实施例6：改造后的慢病毒感染多种哺乳动物细胞

实验按照本领域技术人员已知的常规方法进行。分别感染h CD34+、hMSC和hADSC细胞。直接向细胞培养液中分别加入野生型或改造型VSVG慢病毒，之后通过流式计数判断感染效率。结果如图7所示。

结果表明，对于不同的细胞，改造型的慢病毒均能不同程度的提高感染效率。其中，对于h CD34+细胞的感染效率提高了约55％，对hMSC细胞的感染效率提高了约25％，对hADSC细胞的感染效率提高了约70％。

总结

1)将FN-p及CS1分别与VSVG蛋白融合表达，得到可以与细胞表面蛋白VLA-4和VLA-5相互作用的的VSVG蛋白，进而得到与更宽谱系细胞相互作用的慢病毒。

2)包装过程中，将VLA-4和VLA-5与野生型的辅助质粒混合包装，在确保病毒产量的同时能够获得可以显著提高感染效率的病毒。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

参考文献： 

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