一种虾青素酯酶生产菌株及其在游离虾青素制备中的应用

摘要

本发明的目的是提供一种虾青素酯酶生产菌株及其在游离虾青素制备中的应用，本发明的生产脂肪酶和酯酶的菌株为寡养单胞菌，保藏编号为CGMCC NO.10672。本发明提供了一株高效利用雨生红藻油和/或水生动物(如虾及蟹)有机溶剂提取物生产游离虾青素的寡养单胞菌菌株，该菌株能够高效的降解虾青素酯制备游离虾青素。而且，本发明通过实验，确定发酵液中吐温80添加量、接种量、发酵液初始pH、发酵时间条件，从而提供了一种高效的制备游离虾青素的方法。

说明书

技术领域

本发明属于功能微生物筛选技术领域，具体涉及一种虾青素酯酶生产菌株及 其在游离虾青素制备中的应用。

背景技术

虾青素(Astaxanthin，又称3,3’-二羟基-4,4’-二酮基-β,β-胡萝卜素)是萜烯 类不饱和化合物，是类胡萝卜素的一种，广泛存在于生物体内，特别是虾、蟹、 藻类和鱼类等水生生物。虾青素为紫红色，易氧化，氧化后为虾红素(Astacene)。 虾青素不溶于水，具有脂溶性，易溶于氯仿、丙酮、苯和二硫化碳。

大量研究发现，虾青素具有良好的生物学功能，如抗衰老、抗氧化、增强 机体免疫力、抗肿瘤等。虾青素独特的分子结构，使其成为自然界最强的抗氧 化剂，其抗氧化能力是其他类胡萝卜素的10倍，维生素E的500倍，被誉为“超 级抗氧化剂”或“超级维生素E”。目前，虾青素已凭借其良好的生物学功能，成 为众多行业的“宠儿”，比如食品、水产养殖、医药及化妆品等行业。

目前，虾青素的生产主要分为两类，一类是化学合成法，另一类是生物法。 与生物法相比，化学合成法不仅工艺过程繁琐复杂，而且合成过程中可能被其 它有害物质污染，产品中还含有非天然的异构体，影响其安全性。不仅如此， 化学合成的虾青素在结构、生理功能、应用等方面与天然虾青素有着很大的区 别，使得化学合成虾青素的应用受到进一步的限制。在结构方面，化学合成的 虾青素主要为顺式结构，而天然虾青素主要为反式结构。目前，世界各国越来 越重视对化学合成虾青素的管理，其中美国食品与药物管理局(FDA)已明确 禁止化学合成的虾青素进入保健食品市场，仅允许反式结构的虾青素作为水产 养殖的添加剂。因此，生物法将取代化学合成法，成为生产虾青素的主要方法。

在生物法制备过程中，主要是从水生动物(如虾及蟹)的壳内以及培养的 雨生红球藻中提取虾青素。水生动物和雨生红球藻中的虾青素多以虾青素酯的 形式存在，通过将虾青素酯水解可获得游离虾青素。目前水解虾青素酯主要采 用皂化的方法，该方法虽然具有反应迅速的优点，但反应过程过于剧烈，难以 对产物进行控制，高浓度的碱也会对虾青素造成破坏，产生较多的副产物，如 产生虾红素和半虾红素等。不仅如此，反应过程采用大量的碱和有机溶剂，不 仅破坏了环境，而且造成了极大的浪费，不符合国家发展的战略。另外一种是 采用脂肪酶酶解的方法，通过使用脂肪酶降解虾青素酯来制备游离虾青素，这 为游离虾青素的生产提供了一条新的思路，但酶解过程复杂，需预先水解甘油 三酯，并移除游离脂肪酸后，再利用脂肪酶水解虾青素酯，耗时长、成本高。 而且由于虾青素酯的水不溶性和成分复杂等特点，导致脂肪酶酶解效率较低， 使其在大规模制备过程中会受到限制。利用发酵法制备游离虾青素被认为是一 个有效的方法，但目前存在的混菌发酵法并不能实现虾青素酯的完全水解，游 离虾青素生产的工业化进程依旧无法实现。

发明内容

本发明的目的是提供一种虾青素酯酶生产菌株及其在游离虾青素制备中的 应用，即一种能高效降解虾青素酯的菌株，及该菌株在生产游离虾青素中的应 用，从而弥补现有技术的不足。

本发明首先提供一种寡养单胞菌(Stenotrophomonas sp.)OUC-LH15，该菌株 于2015年03月30日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院 微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General  Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，保藏编号为CGMCC  NO.10672。

上述的寡养单胞菌用于发酵生产游离虾青素；

本发明还提供一种生产游离虾青素的方法，是在添加有虾青素酯或提供虾 青素酯的原料的培养基中接种寡养单胞菌来发酵制备游离虾青素。

作为优选，所述的含有虾青素酯的原料为雨生红球藻油和/或含有虾青素酯 的水生动物(如虾及蟹)的有机溶剂提取物。

作为优选，发酵培养基的组成如下(g/mL质量体积比)：雨生红球藻油和/ 或含有虾青素酯的水生动物(如虾及蟹)有机溶剂提取物、KH₂PO₄ 0.025％、 MgSO₄·7H₂O 0.025％、FeSO₄·7H₂O 0.001％、牛肉膏0.1％、蛋白胨1％、pH 7.0，

上述的培养基中优选添加Tween-80，其添加量依据实施过程的发酵优化结 果来定；

本发明提供了一株高效利用雨生红藻油和/或水生动物(如虾及蟹)有机溶 剂提取物生产游离虾青素的寡养单胞菌菌株，该菌株能够高效的降解虾青素酯 制备游离虾青素。而且，本发明通过实验，确定发酵液中吐温80添加量、接种 量、发酵液初始pH、发酵时间条件，从而提供了一种高效的制备游离虾青素的 方法。

附图说明

图1：Tween-80添加量对发酵的影响图；

图2：种龄对发酵的影响图；

图3：接种量对发酵的影响；

图4：发酵液初始pH对发酵的影响；

图5：菌株发酵曲线图；

图6：本发明微生物发酵法制备的游离虾青素HPLC图谱

图7：皂化法制备的游离虾青素的HPLC图谱

图8：雨生红球藻油中虾青素酯的HPLC图谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

一、降解虾青素酯菌株的筛选

本发明所使用的培养基配方如下：

1)富集培养基

NH₄NO₃ 0.1％，KH₂PO₄ 0.025％，MgSO₄·7H₂O 0.025％，FeSO₄·7H₂O 0.001％， 胆固醇油酸酯0.1％，自来水配，pH 7.0，115℃灭菌30min。

2)筛选平板固体培养基(固体筛选平板)

NH₄NO₃ 0.1％，KH₂PO₄ 0.025％，MgSO₄·7H₂O 0.025％，FeSO₄·7H₂O 0.001％， 胆固醇油酸酯(1.0％Triton X-100助溶)0.1％，琼脂2％，自来水配，pH 7.0， 115℃灭菌30min。

3)发酵培养基

雨生红球藻油发酵培养基：KH₂PO₄ 0.025％，MgSO₄·7H₂O 0.025％， FeSO₄·7H₂O 0.001％，牛肉膏0.1％，蛋白胨1％，雨生红球藻油(0.4％Tween80 助溶)0.5％，自来水配，pH 7.0，115℃灭菌30min。

胆固醇油酸酯发酵培养基：KH₂PO₄ 0.025％，MgSO₄·7H₂O 0.025％， FeSO₄·7H₂O 0.001％，牛肉膏0.1％，蛋白胨1.0％，胆固醇油酸酯0.1％，Tween  80 0.4％，pH 7.0，115℃高压灭菌30min。

4)种子培养基

牛肉膏0.3％，蛋白胨1％，NaCl 0.3％，自来水配，pH 7.0，115℃高压灭菌 30min。

1、菌株的筛选过程

1.1富集培养

将配制的富集培养基100mL于250mL三角瓶中，灭菌备用。将3g取自 屠宰场的土样加入到三角瓶中，混合均匀后，在37℃180rpm下培养24h。

1.2平板初筛

取富集培养的菌液进行100倍的适度稀释，涂布于固体筛选平板上；置于 37℃培养箱中，静置培养48h。

1.3发酵复筛

(1)菌株富集挑选平板初筛得到的阳性菌株于灭菌的种子培养基中，在 37℃180rpm下富集培养24h。

(2)发酵培养取富集培养后的菌液1mL，接种至灭菌的含雨生红球藻油发 酵培养基的三角瓶(100mL/250mL)中，然后将三角瓶置于恒温培养箱内，于 37℃180rpm下震荡培养48h，取发酵液进行产物检测。

A、薄层层析法检测

发酵结束后，取1mL发酵液用二氯甲烷反复萃取，直至水相为无色。用毛 细管吸取萃取液，点样于硅胶板上，置于用层析液(正己烷/丙酮＝4/1)平衡后 的层析缸中，以虾青素标准品作为对照，根据R_f值判断是否有虾青素单体产生。

B、HPLC法检测

取1mL发酵液，加1mL二氯甲烷，反复震荡萃取，静置分层，弃上层水 相，下层有机相用氮气吹干，并加1mL有机溶剂(甲醇：甲基叔丁基醚＝1:1) 进行溶解，过0.22μm有机膜，上柱分析。为了避免萃取不充分而导致的误差， 发酵效果以液相谱图中虾青素与虾青素酯的面积比作为因变量进行考察，面积 比数值大，说明发酵效果好，面积比数值小，说明发酵效果欠佳。

色谱柱：Develosil C30-UG-5；

流动相：A为甲醇；B为甲基叔丁基醚；C为超纯水；

流速：1mL/min；

检测器：DAD；

检测波长：476nm；

温度：25℃；

进样量：20μL。

采用梯度洗脱程序，洗脱条件如表1所示。

表1：虾青素分离梯度洗脱程序

C、脂肪酶酶活检测

脂肪酶酶活通过405nm下，检测脂肪酶降解对硝基苯基棕榈酸酯(pNPP) 生成的对硝基苯酚(pNP)的量进行确定。3mg pNPP溶解于1mL异丙醇中， 并与9mL含有1％Triton X-100的pH 7.550mM的Tris-HCl缓冲液混合，得到 底物溶液。向1.5mL底物溶液中加入0.5mL适当稀释的酶液开始反应，于37℃ 下孵育10min。单位脂肪酶酶活定义为每分钟生成1μmol pNP所需要的酶量。

D、酯酶酶活检测

配制pH 7.5的50mM Tris-HCl缓冲溶液，添加脱氧胆酸钠和阿拉伯胶，分 别到4.4g/L和1.1g/L。向上述溶液中添加对硝基苯基丁酸酯(pNPC)至1mM， 形成底物溶液。向底物溶液中添加酶液开始反应，置于37℃下孵育10min。405 nm下通过检测生成的pNP的量，进行确定。单位酯酶酶活定义为每分钟生成1 μmol pNP所需要的酶量。

2、筛选结果

取阳性菌株接种于发酵培养基中进行复筛，发酵结束后，对发酵液进行TLC 法检测，通过与虾青素标准品进行对比，发现1号菌和10号菌的发酵液中，有 虾青素单体产生，而2-7号菌的发酵液中则无虾青素单体产生。

通过TLC结果，初步断定1，10号菌可以降解虾青素酯，产生游离虾青素， 而2，3，4，5，6，7号菌不能通过发酵得到游离虾青素。

HPLC分析结果表明，其中1号，10号菌发酵液中虾青素单体在8min左右 出峰，而在8min-11min出峰的为虾青素异构体，20min后出峰的为虾青素酯。 证明了1号，10号菌可以较好的降解虾青素酯产生虾青素单体，而2，3，4，5， 6，7号菌不能通过发酵产生游离虾青素。

通过脂肪酶和酯酶酶活力检测，发现1号菌具有脂肪酶活力，脂肪酶活力 为84.3U/mL。而10号菌同时具有酯酶和脂肪酶活力，脂肪酶活力为45.7U/mL， 酯酶活力为13.3U/mL。结合其他鉴定实验，最终确定1号菌只能产生脂肪酶， 而10号菌可同时产生酯酶和脂肪酶。通过对结果的分析，确定10号菌可同时 产生脂肪酶和酯酶，并对虾青素酯具有较好的降解效果，最终决定将10号菌作 为进一步实验的实验用株。经16S同源序列比对，鉴定该菌株为寡养单胞菌， 将10号菌最终命名为OUC-LH15，并进行了保藏。该菌株保藏于中国普通微生 物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)，编号为CGMCC NO.10672。

用该菌株发酵雨生红球藻油的方法可以较好的降解藻油中的虾青素酯，生 产游离虾青素，与传统皂化法相比，可明显降低虾红素、半虾红素等副产物的 产生。与单纯的脂肪酶酶解法相比，利用微生物进行发酵的方法不仅提高了转 化率，而且减少了脂肪酶的使用，降低了生产成本。与已有的混菌发酵法相比(附 件专利)，利用单菌脂肪酶和酯酶共同水解，虾青素酯的降解率大幅度提高。

二、用寡养单胞菌发酵雨生红球藻油制备游离虾青素

采用发酵培养基(g/mL)：KH₂PO₄ 0.025％，MgSO₄·7H₂O 0.025％，FeSO₄·7H₂O  0.001％，牛肉膏0.1％，蛋白胨1％，雨生红球藻油(0.4％Tween80助溶)0.5％， pH 7.0，115℃灭菌30min，其中Tween80的添加量由发酵优化结果来定。其中 雨生红球藻油的制备方法是常规文献可以检索到的，具体如下：①利用沉降法 收集雨生红球藻孢子体；②沉降后的孢子体离心除去大部分水分；③加入果胶 酶和纤维素酶软化细胞壁；④利用高压均质机进行破壁处理；⑤使用干燥技术 对破壁后的孢子体进行干燥；⑥向得到的藻粉或藻饼中加入乙醇溶解，并进入 制粒机进行制粒；⑦颗粒通风烘干；⑧使用二氧化碳超临界设备进行提取。利 用筛选的寡养单胞菌发酵雨生红球藻油来制备游离虾青素；对于发酵的各个条 件进行了优化，具体结果如下：

1)Tween 80添加量对发酵的影响

采用上述的发酵培养基，其他因素不变的条件下，考察Tween80的添加量， 对菌株发酵的影响。Tween80的添加量(g/mL)分别设置为0，0.2％，0.4％， 0.6％，0.8％，1.0％。发酵结束后，利用HPLC方法，检测发酵产物，以液相谱 图中虾青素与虾青素酯的面积比作为作为因变量进行考察。所有实验均重复三 次，取平均值进行表示。

图1结果可以看出，随着Tween 80添加量的增加，虾青素与虾青素酯的面 积比逐渐减小，说明发酵效果受到抑制，故Tween 80的添加量应控制在低添加 量水平上。但是当添加量为0时，2d后发酵液颜色由红色变为黄色，经检测， 虾青素含量很低，遭到严重破坏。猜测由于未添加乳化剂，红藻油不能很好地 溶解在水相，暴露在空气中被氧气等破坏。

综上分析，发酵液应添加少量的Tween 80来提高虾青素的终产量，最终决 定Tween 80的添加量为0.2％。

2)种龄对发酵的影响

采用发酵培养基，其他因素不变的条件下，考察种子液培养时间对菌株发 酵的影响，种龄分别设置为24h，36h，48h，60h，72h。发酵结束后，操作 同上。

由图2结果可以看出，种龄对发酵有显著的影响，随着种龄的提高，虾青 素与虾青素酯的面积比先升高后降低，说明发酵效果先提高后降低，并在36h 时，虾青素与虾青素酯的面积比有一个最大值。最终选定36h为中间点。

3)接种量对发酵的影响

采用发酵培养基，其他因素不变的条件下，考察接种量对菌株发酵的影响， 接种量分别设置为1％，3％，5％，7％，9％。发酵结束后，操作同上。

由图3实验结果可以看出，接种量对发酵结果有一个较为显著的影响，随 着接种量的提高，虾青素与虾青素酯的面积比先升高后降低，说明发酵效果先 提高后降低，并在接种量为5％处有一个最高值。

4)发酵液初始pH对发酵的影响

采用发酵培养基，其他因素不变的条件下，考察发酵液初始pH对菌株发酵 的影响，发酵液初始pH分别设置为4，5，6，7，8，9，10。发酵结束后，操 作同上。

由图4结果可以看出，在pH 4-pH 8时，虾青素与虾青素酯的面积比先升高 后降低，在pH>8时，虾青素与虾青素酯的面积比又逐渐提高。分析原因，推测 pH<8时，受菌株发酵的影响，pH 6左右为最适初始pH，故发酵效果先升高后 降低；当pH>8时，虽然高pH影响了菌株的发酵效果，但碱的作用逐渐明显， 碱会使虾青素酯酯键断裂，生成较多的虾青素单体，皂化逐渐开始占据主导地 位，使得虾青素与虾青素酯的面积比升高。确定发酵液pH应控制在中性或酸性 条件下，故选取pH在5与7之间。

根据上面确定的发酵条件，利用发酵培养基(0.2％Tween 80助溶，pH 6.80)， 接种5.92％种龄为37.79h的种子液，并于24h，36h，48h，60h，72h，84h 下分别取样进行检测。以发酵时间为横坐标，以液相谱图中虾青素与虾青素酯 的面积比为纵坐标，绘制菌株发酵曲线，结果如图5所示。

由图5可以看出，虾青素与虾青素酯的面积比先逐渐升高后略有降低。72h 前，虾青素与虾青素酯的面积比逐渐升高，说明寡养单胞菌很好地将虾青素酯 降解为游离虾青素，发酵效果逐渐改善；72h后，虾青素与虾青素酯的面积比 略有降低，通过分析液相谱图发现，较之72h的发酵结果，84h的发酵液中， 虾青素的含量有了较明显的降低。故可以推断，过长的发酵时间，使得虾青素 酯降解的同时，分解了部分游离虾青素，从而导致最终比值的降低。

通过对结果的分析，最终确定最佳的发酵时间为72h，72h时虾青素酯得 到较大程度的降解，并产生较高含量的游离虾青素，其中虾青素酯基本完全降 解。

虾青素酯的降解率，以HPLC谱图中虾青素酯的面积减少率表示，计算公 式如下：

本发明通过筛选的寡养单胞菌利用红藻油生产游离虾青素的发酵条件进行 了优化，通过单因素实验以及Box-Behnken实验设计，最终确定最佳发酵条件 为：发酵液中Tween 80的添加量为0.2％，种龄为37.79h，接种量为5.92％，发 酵液初始pH为6.80。在此条件下，通过绘制菌株发酵曲线对发酵效果进行了验 证，并最终确定最佳的发酵时间为72h，此时，虾青素酯(图8)基本完全降解 为游离虾青素(图6)，降解率达到98％，且产物中虾红素等副产物的量大幅减 少。与传统皂化法相比(图7)可以看出，利用发酵法生产天然游离虾青素，可 明显降低虾红素、半虾红素等副产物的产生，减少了虾青素的破坏。与已有的 混菌发酵法和单纯的脂肪酶酶解法相比，利用同时生产酯酶和脂肪酶的菌株进 行发酵，不仅提高了转化率(降解率)，而且减少了脂肪酶的使用，简化了操作 进程，降低了生产成本。

三、用寡养单胞菌发酵虾头(壳)有机溶剂提取物制备游离虾青素

采用发酵培养基(g/mL)：KH₂PO₄ 0.025％，MgSO₄·7H₂O 0.025％，FeSO₄·7H₂O  0.001％，牛肉膏0.1％，蛋白胨1％，虾头(壳)乙醇提取物1％，pH 7.0，115℃ 灭菌30min。其中虾头(壳)乙醇提取物的制备方法是常规文献可以检索到的， 具体如下：①新鲜虾头切碎至2～10mm，冷藏备用；②将虾头(壳)在90℃下 用4％NaOH溶液浸泡1h，脱除上面的蛋白质；③用4％盐酸在室温下浸泡1h， 脱除上面的灰分物质；④取出固体用蒸馏水洗净，过滤取固体部分；⑤在30℃ 下以固液比1:6提取60min，重复操作两次，合并提取液；⑥利用筛选的寡养单 胞菌发酵虾头(壳)乙醇提取夜来制备游离虾青素，虾青素酯降解率达到98％， 且产物中虾红素等副产物的量大幅减少。

四、用寡养单胞菌发酵蟹壳有机溶剂提取物制备游离虾青素

采用发酵培养基(g/mL)：KH₂PO₄ 0.025％，MgSO₄·7H₂O 0.025％，FeSO₄·7H₂O  0.001％，牛肉膏0.1％，蛋白胨1％，蟹壳乙醇提取物1％，pH 7.0，115℃灭菌 30min。其中蟹壳乙醇提取物的制备方法按照常规文献记载进行，具体如下：① 蟹壳切碎至2～10mm备用；②将蟹壳在90℃下用4％NaOH溶液浸泡1h，脱 除上面的蛋白质；③用4％盐酸在室温下浸泡1h，脱除上面的灰分物质；④取出 固体用蒸馏水洗净，过滤取固体部分；⑤在30℃下以固液比1:6提取60min， 重复操作两次，合并提取液；⑥利用筛选的寡养单胞菌发酵蟹壳乙醇提取夜来 制备游离虾青素，虾青素酯降解率达到96％，且产物中虾红素等副产物的量大 幅减少。