一种应用BLU-V PMA技术快速判定奶及奶制品中副结核分枝杆菌存活状态的方法

摘要

本发明公开了一种应用BLU-V PMA技术快速判定奶及奶制品中副结核分枝杆菌存活状态的方法。根据GenBank已公布Map的（登录号：AF286339）ISMAV2基因组序列，选取该基因的保守序列，设计TaqMan荧光探针及引物。将BLU-V系统作为光源应用于PMA技术中结合荧光定量PCR技术的优点，成功建立了一种快速检测奶及奶制品中MAP活菌的方法。该方法操作简单，快速且比较精确。

说明书

技术领域

本发明一种应用BLU-V PMA技术快速判定奶及奶制品中副结核分枝杆菌存活状态的方法，属于微生物检测技术领域。

背景技术

副结核病（Paratuberculosis）是由副结核分枝杆菌，即鸟分枝杆菌副结核亚种（Mycobacteriumaviumsubsp.Paratuberculosis,MAP）引起的一种以反刍动物为主的慢性消耗性传染病，也称Johne,s病。该病很难净化，而且与人类的克罗恩氏（Crohn,s）病存在潜在的联系，有研究表明人的这种严重的疾病可能是由于奶的巴氏消毒法不能够完全杀灭该菌，且研究中发现几乎44%的奶制品中都检出副结核菌为阳性。随着我国国民生活水平的不断提高，牛奶需求量呈正指数增长，急需大量的优质、高产奶牛，促使近年来进口种牛骤增，迫切需要建立早期的快速、准确的副结核病诊断方法，以预防、净化和根除该病，保护我国畜牧业的健康快速发展。

目前检测副结核分枝杆菌的常见方法有细菌学诊断、免疫学诊断、分子生物学诊断。其中涂片镜检法不能鉴别出感染者体内的病原菌是否存活，细菌培养法存在难于培养且耗时长至少4-6周，药敏试验也耗时比较长的问题。补体结合实验（CF）虽然对有临床症状的病畜检出率较高，但用于潜伏感染病例时效果不佳。琼脂扩散试验（AGID）方法敏感性低，不宜用作筛选和鉴定亚临床感染病例。酶联免疫吸附试验（ELISA）比较敏感，有希望作为常用的诊断法。近几年，Nogva等人应用EMA-PCR技术来区分活菌和死菌。但是EMA具有一定的毒性，如果与细胞作用时间稍长就会嵌入活细胞的细胞膜与其DNA结合，从而影响，检测结果。单叠氮丙啶（propidium mono azide,PMA）能够通过细胞膜破损的死菌， 与 DNA 结合， 使死菌 DNA 在 PCR 时不再扩增， 进而检测活菌的信号。Tomas Garc?a-Cayuela[53]等利用PMA-qPCR方法对乳制品中的四种乳酸菌进行了定量检测，PMA-PCR技术是目前最具应用前景的活菌检测技术。目前未有人应用BLU-V PMA结合荧光定量PCR技术进行副结核分支杆菌的存活性的快速判定。

然而，光源类型也是影响PMA处理的一个重要因素，在以往实验中对PMA进行处理时，所使用的光源都是600W的卤素灯，虽然其造价合理，照明度充分，但是它达到峰值亮度的时间短，且受到空气介质和样品浊度的影响，都会使PMA的处理效果降低，导致试验出现假阳性和假阴性的结果。

发明内容

本发明克服现有技术的不足，所要解决的技术问题是将BLU-V系统作为光源应用于PMA技术中，结合荧光定量PCR技术的优点，成功建立了一种快速检测奶及奶制品中MAP活菌的方法。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种应用BLU-V PMA技术快速判定奶及奶制品中副结核分枝杆菌存活状态的方法，将BLU-V系统作为光源应用于PMA技术中；

所述的将BLU-V系统作为光源应用于PMA技术判定奶及奶制品中副结核分枝杆菌存活状态的方法包括如下步骤：

a取待测样品，液体样品直接离心，固体样品加蒸馏水溶解离心，14500r离心5min；离心完毕后，弃去上清，加入EBBuffer于沉淀中，混匀得菌悬液；

b向步骤a的菌液中加单叠氮丙啶，使单叠氮丙啶的终浓度为10μg/mL，充分混匀，并设不加PMA的菌悬液作为对照；将EP管置于避光盒中，避光10min；取出EP管，将其放入BLU-V系统中(仪器的光强为100)，作用20min，使PMA与死菌的DNA双链结合；每隔2min取出EP管在漩涡振荡仪上振荡混悬一次，以增加结合率；

c步骤b结束后，取出EP管，14500r离心5min；离心完毕后，弃去上清（注意要弃充分）；最后加入400μL的TE，再次重悬混匀；后续进行常规的DNA提取；

d以步骤c中提取的DNA为模板，进行荧光定量PCR检测样品中的目标菌，上下游引物及探针序列分别为

上游：5’-AACGAGGGGACGATGAGG-3’

下游：5’-CTGTGATGTAACGCGATTCG-3’

探针5’-FAM-CACGGCGTTGCTGATGTCCACC-TAMRA

荧光定量PCR反应体系为10×PCRBuffer500mM,Kcl,100mMTris-cl(pH8.3)室温下2.5μL，Mgcl225mM1.5μL，dATP,dCTP,dTTP,dGTP各3.2μmol2.0μL，上下游引物10pmol各1.0μL，TaqDNA酶5U/μL2.5μL，探针3pmol1.0μL，模板DNA2.0μL，ddH2O11.5μL，总反应体系25.0μL。

所述的一种应用BLU-V PMA技术快速判定奶及奶制品中副结核分枝杆菌存活状态的方法，荧光定量PCR反应条件：93℃变性15s；56℃退火15s，68℃延伸30s，40个循环。

所述的一种应用BLU-V PMA技术快速判定奶及奶制品中副结核分枝杆菌存活状态的方法，确定TaqMan荧光定量PCR检测的Ct值＜25时，结果判定为阳性；与未经PMA处理组相比， PMA处理后的Ct值比未经PMA处的Ct值要大于6个以上，判定奶样中不含有活菌。

与现有技术相比本发明具有以下有益效果。

与以往PMA进行处理时所使用的光源都600W的卤素灯相比，而本发明所使用的BLU-V系统是一种能够持续生成稳定光刺激量的激光热稳定设备，即该设备具有特定的波长和持续稳定的激光照射强度，它可以将检测样品置于密闭空间中同时对12份经过PMA处理的样本进行光化激活反应。不仅避免了空气介质及样品浊度的影响，而且提高了样品检测的效率。

本发明使用BLU-V系统，结合PMA和荧光定量PCR技术的优点，成功建立了一种快速检测奶及奶制品中MAP活菌的方法。该方法操作简单，快速且比较精确。并使之成为奶及奶制品是否符合生物安全的一个重要指标，对预防、净化和清除该病，保护我国人民生命安全与畜牧业的健康快速发展具有重要的意义。

附图说明

图1为实施例1中的荧光定量扩增图谱；

图2 实施例2中不同光照时间处理所对应的荧光定量ct值；

图3 实施例2中不同质量浓度PMA处理所对应的荧光定量ct值；

图4实施例3 经PMA处理及无PMA处理的MAP标准菌株P18荧光定量扩增图谱；

图5实施例3 经PMA处理及无PMA处理的MAP标准菌株P18 荧光定量Ct值报告；

图6实施例3经PMA处理及无PMA处理的 MAP标准菌株P10荧光定量扩增图谱；

图7实施例3经PMA处理及无PMA处理的 MAP标准菌株P10荧光定量Ct值报告。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

引物特异性验证

提取Map（P10和P18）、金黄色葡萄球菌，沙门氏菌，大肠杆菌，草分枝杆菌6种标准菌株基因组DNA，进行TaqMan荧光定量PCR扩增，检测本发明方法的特异性。（副结核分枝杆菌（M.paratuberculosis）标准菌株：P18（美国），P10（日本）（都为牛型副结核标准菌株），均由吉林兽医研究所提供。金黄色葡萄球菌，沙门氏菌，大肠杆菌，草分枝杆菌均由山西出入境检验检疫局技术中心实验室保存。）

1.DNA的制备

取50 μL菌液，加入400 μL TE中，混匀。提取DNA模板的具体步骤如下：

（1）80 ℃水浴加热20 min，冷却至室温，使之灭活；

（2）加50 μL溶菌酶，37 ℃气浴震荡培养1 h；

（3）加75 μL SDS/蛋白酶K，混匀，65 ℃水浴加热10 min；

（4）加100 μL 5 mol/L的Nacl和100 μL 65 ℃预热5 min的CTAB/Nacl，上下颠倒混匀，直至液体变为白色（奶状），65 ℃水浴加热10 min；

（5）加750 μL三氯甲烷∶异戊醇（24∶1），混匀，12000 r/min，室温离心5 min；

（6）取上层水相（上清）于新管中，加等体积的三氯甲烷∶异戊醇（24∶1），混匀，12000 r/min，室温离心5 min；

（7）取上层水相于新管中，小心加入0.6体积的异丙醇，沉淀核酸，小手摇混匀，-20 ℃放置30 min，12000 r/min，室温离心15 min；

（8）弃上清，加入500 μL预冷的70%的乙醇，12000 r/min，室温离心5 min，；

（9）小心吸走液体，室温下干燥10 min左右，用50 μL TE溶解，4 ℃保存。

2.TaqMan荧光定量PCR反应体系及循环条件

荧光定量PCR反应体系为10×PCRBuffer500mM,Kcl,100mMTris-cl(pH8.3)室温下2.5μL，Mgcl225mM1.5μL，dATP,dCTP,dTTP,dGTP各3.2μmol2.0μL，上下游引物10pmol各1.0μL，TaqDNA酶5U/μL2.5μL，探针3pmol1.0μL，模板DNA2.0μL，ddH2O11.5μL，总反应体系25.0μL。

荧光定量PCR反应条件：93℃变性15s；56℃退火15s，68℃延伸30s，40个循环。

结果如图1所示，只有用Map（P10和P18）的模板DNA才可以获得特异性扩增曲线，而金黄色葡萄球菌，沙门氏菌，大肠杆菌，草分枝杆菌的模板DNA不能获得特异性扩增曲线，表明该方法的特异性良好。

实施例2

PMA作用MAP标准菌株最佳反应条件的优化

1. MAP标准菌株（P10和P18）膜损伤菌的制备

分别取1 mL的P10和P18菌液（尽量多取菌块）于放有50个磁珠的2 mL EP管中，并用封口膜封好，放到核酸提取仪（每5 s作用一次），使菌液充分混悬；混悬后，置于80 ℃水浴中灭活20 min。

2. PMA对MAP标准菌株（P10和P18）的处理

将0.5 mg的PMA溶解于1 mL的无RNA酶水中，配成0.5 mg/mL的PMA原液，-20 ℃保存。将灭活完的菌液置于离心机中，14500 r离心5 min；离心完毕后，弃去上清；然后加入500 μL的EB Buffer于剩余菌体中，混匀。

3 .PMA质量浓度的优化

向0.5 mL灭活菌悬液中加入一定量的PMA，使其终浓度分别为0.0、0.5、1.0、3.0、5.0、10.0、20.0 μg/mL，并设不加PMA的灭活菌悬液作为对照。在避光盒中处理10 min后，用BLU-V系统（光强为100）光照处理20 min，每隔2 min取出EP管在漩涡振荡仪上振荡混悬一次，结束后，取出EP管，14500 r离心5 min，弃去上清，加入400 μL的TE，进行常规的DNA提取，通过TaqMan荧光定量PCR确定最佳PMA质量浓度。

4 .PMA光照处理时间的优化

在0.5 mL灭活菌悬液中加入PMA，使其终浓度为10 μg/mL。避光处理10 min后，用BLU-V系统(光强为100)对菌液分别光照处理0、5、10、15、20、25、30 min。每隔2 min取出EP管在漩涡振荡仪上振荡混悬一次，结束后，取出EP管，14500 r离心5 min，弃去上清，加入400 μL的TE，进行常规的DNA提取，通过TaqMan荧光定量PCR确定最佳PMA质量浓度。

由图2可以看出，Ct值随着光照时间的延长而不断的增大，当光照时间超过20 min时，Ct值变化的幅度越来越小，说明当光照时间超过20 min时，PMA可以完全与死菌DNA结合，并且使奶样中游离的PMA完全钝化，因此，本实验以20 min为最佳光照处理时间。

从图3中可知，活菌（未用PMA处理）的荧光定量反应Ct值基本不变，说明PMA不影响活菌的扩增，而随着PMA质量浓度的增大，热灭活菌（死菌）TaqMan荧光定量PCR的Ct值也显著增大，当PMA的质量浓度增大到10 μg/mL时，Ct值开始保持稳定，随浓度增大的幅度逐渐减小，因此，为了使菌液中游离的PMA被完全钝化，本实验以10 μg/mL为最佳PMA反应浓度。

实施例3

最佳PMA反应条件下奶及奶制品中活菌的定量检测

1.人工污染MAP奶样中（P10和P18）膜损伤菌的制备

分别取1 mL的P10和P18菌液（尽量多取菌块）于放有50个磁珠的2 mL EP管中，并用封口膜封好，放到核酸提取仪（每5 s作用一次），使菌块充分混悬呈菌悬液；无菌操作取应用荧光PCR、普通PCR及电泳未检出MAP的阴性奶样本，即酸奶各取1 mL，奶粉各取0.5 g于灭菌的2 mL EP管中；往所取得的奶样中各加入500 μL菌悬液，在漩涡振荡仪上充分混匀；混匀后，置于80 ℃水浴中灭活20 min。通过该处理，使菌种的细胞壁与细胞膜发生不同程度的损伤，以达到人工制备巴氏灭菌奶（一种是将牛奶加热到62~65℃，保持30分钟。第二种方法将牛奶加热到75~90℃，保温15~16秒）的目的。

2. PMA对人工污染MAP奶样中（P10和P18）膜损伤菌的处理

将灭活完的奶样置于离心机中，14500 r离心5 min；离心完毕后，弃去上清；然后加入500 μL的EB Buffer于剩余菌体中，混匀；在用EB Buffer混匀的菌液中，加入10 μg/mL PMA，充分混匀，并设不加PMA的菌液作为对照；将EP管置于避光盒中，避光10 min；取出EP管，将其放入BLU-V系统中(仪器的光强为100)，作用20 min，使PMA与死菌的DNA双链结合；每隔2 min取出EP管在漩涡振荡仪上振荡混悬一次，以增加结合率；结束后，取出EP管，14500 r离心5 min；离心完毕后，弃去上清（注意要弃充分）；最后加入400 μL的TE，再次重悬混匀；后续进行常规的DNA提取。

3.DNA模板的提取同实施例1

4.TaqMan荧光定量PCR反应体系及循环条件同实施例1

PMA作用MAP标准菌株（P10和P18）后的TaqMan PCR结果如图4、5、6、7。从图4和图6可见，P10和P18通过TaqMan荧光定量PCR得到了很好的扩增曲线；图5和图7中，经过PMA处理后的MAP标准菌株（P10和P18）的Ct值比未经PMA处理的菌株的Ct值要大于6个以上，说明MAP的活菌和死菌得到了很好的区分，且PMA在对MAP的预处理过程中，与该菌的死菌细胞得到了有效结合。

本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何变化，都应认为是包括在权利要求书的范围内。