阿普洛尔对中央记忆性T细胞体外扩增中的应用

摘要

本发明提供了阿普洛尔对中央记忆性T细胞在体外扩增上的应用，所述阿普洛尔的浓度为5~20uM，最适浓度为10uM，所述中央记忆性T细胞为CD4

说明书

技术领域

本发明属于中央记忆性T细胞体外扩增技术领域，更具体地，涉及阿普洛尔对中央记忆性T细胞体外扩增中的应用。

背景技术

阿普洛尔（英语：Alprenolol），有肾上腺素β受体部位竞争性地抑制儿茶酚胺的作用。通过减弱或防止β受体兴奋而使心脏的收缩力与收缩速度下降,通过传导系统的传导速度减慢,使心脏对运动或应激的反应减弱。因此，用于心绞痛的治疗，减低心肌氧耗，增加运动耐量。由于阻滞心脏起搏点电位的肾上腺素能兴奋故用于治疗心律失常。阿普洛尔通过中枢、肾上腺素能神经元阻滞、抗肾素活性以及心排血量减低等降低血压，适用于治疗高血压。用于治疗嗜铬细胞瘤及甲状腺机能亢进，使β1和β2受体的活动均处于抑制状态。

由于T细胞在免疫系统中起着重要的作用，越来越多的研究小组尝试运用T细胞的过继治疗的方式来进行肿瘤治疗。中央记忆性T细胞（TCM）具有自我更新的能力，而且应答时间短，作用时间长，对人体的副作用小。今年来，多个研究组报道，发现具有记忆功能的T细胞回输肿瘤患者体内以后，治疗效果明显并且持续治疗时间长，可以减少患者的痛苦以及降低细胞体外培养次数过多的生物安全风险。但是在人体内相对数量较少，且由于体外长时间培养的T细胞会使T细胞失去活力，绝大部分细胞分化为终末分化的效应细胞，使得回输体内的T细胞存活时间过短，无法产生持续的杀伤肿瘤细胞的功能，因此如何在体外获得大量的记忆性T细胞是细胞免疫治疗的一个新的研究热点。

目前，国外的许多研究小组通过构建人工抗原提呈细胞，将其应用于T细胞的体外培养，提高T细胞的存活时间，用于过继免疫治疗，但要获得足够量的T细胞，技术要求复杂，培养的成功率较低。在进行T细胞治疗时，主要策略是先通过克隆扩增，得到足够量的具有杀伤功能的T细胞，可以与DC等提呈细胞共培养，也可以直接用相关肿瘤抗原刺激细胞克隆扩增，得到具有特定肿瘤抗原特异性的T细胞。此种办法培养得到的T细胞未经过任何转基因修饰，安全性较高。但这种肿瘤高反应性的细胞需要扩增至临床需要的10⁹~10¹¹治疗剂量的数量数，过程持续时间比较长，对于肿瘤患者来说时间也是一个需要更多考虑的因素。而且体外培养的时间长，细胞容易变老，活力下降，多为终末分化的细胞，在体外有较好的效果，但是在体内存活时间较短，治疗效果受影响。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有中央记忆性T细胞体外扩增技术的不足，提供阿普洛尔对中央记忆性T细胞体外扩增中的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了阿普洛尔对中央记忆性T细胞在体外扩增上的应用。

优选地，所述阿普洛尔的浓度为5~20uM。

更优选地，所述阿普洛尔的浓度为10uM。

优选地，所述中央记忆性T细胞为CD4⁺ T细胞。

优选地，所述中央记忆性T细胞的提取方法是先将外周成分血与含2% BSA和0.5% EDTA的PBS按1:4混合均匀；然后将稀释后的血液缓慢加入淋巴细胞分离液的上方，二者的比例为1:1；离心300×g 30 min；小心吸取单核细胞，置入另一离心管中，加入5倍体积的含0.5% BSA和2% EDTA 的PBS稀释，混合均匀后，300×g 15 min；重复上一步骤一次；孵育CD4+ T细胞阴选一抗，15 min；用10倍体积的含0.5% BSA和2% EDTA 的PBS稀释，混合均匀后，300×g 12 min；孵育带有磁珠的二抗，30 min；过柱进行细胞分选，得到CD4⁺ T细胞。

优选地，所述中央记忆性T细胞的培养方法是在5% CO₂、饱和湿度及37^oC条件下将5×10⁵个/孔的CD4⁺ T细胞置于1 mL含10%胎牛血清的RPMI1640中培养

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

本发明首次公开了阿普洛尔在体外T细胞培养中的应用，方法安全有效，成本低廉，为过继免疫治疗的广泛开展提供了良好的技术支持。

附图说明

图1为阿普洛尔浓度为10uM时对CD4⁺ T细胞中CD4⁺ TCM所占比例的检测。

图2为不同浓度的阿普洛尔对中央记忆性CD4⁺ T细胞的比例扩增效果。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

实施例1

1、试验材料准备

人的外周成分血由广州市血液中心提供，试验中随机选取了24份正常人的血液样本。

主要试剂：胎牛血清购自于GIBCO公司；RPMI1640培养基购自于INVERTROGEN公司；阿普洛尔购自于INVERTROGEN公司；流式细胞仪检测抗体anti-CD45RA-Texas Red、anti-CCR7-AF700\ anti-CD62L-PE-cy7购自于BD公司；淋巴细胞分离液购自于天津灏阳生物制品有限责任公司；CD4⁺ T细胞阴性选择磁珠购自于BD公司。

主要的实验仪器：台式高速离心机（Eppendorf Centrifuge 5810R）、流式细胞仪（Beckman Coulter公司）、CO₂细胞培养箱（Thermo SCIENTIFIC）、生物安全柜（Thermo SCIENTIFIC）、倒置生物显微镜（Leica）、磁珠分选磁力架（BD Pharmigen）。

细胞培养

2.1细胞提取分离

将外周成分血与PBS缓冲液（含2% BSA、0.5% EDTA）按1:4混合均匀；然后将稀释后的血液缓慢加入淋巴细胞分离液的上方，二者的比例为1:1；离心300×g 30 min；小心吸取单核细胞，置入另一离心管中，加入5倍体积的PBS（含0.5% BSA、2% EDTA）稀释，混合均匀后，300×g 15 min；重复上一步骤一次；孵育CD4+ T细胞阴选一抗，15 min；10倍体积的PBS（含0.5% BSA、2% EDTA）稀释，混合均匀后，300×g 12 min；孵育带有磁珠的二抗，30 min；过柱进行细胞分选，得到CD4+ T细胞，加入含10%胎牛血清的RPMI1640重悬细胞，计数细胞后调整细胞至所需浓度。

2.2培养条件

在5% CO₂、饱和湿度及37^oC下，将5×10⁵个/孔的CD4⁺ T细胞置于1 mL含10%胎牛血清的RPMI1640中培养。

细胞铺板及加药处理

3.1铺板

将分选出来的CD4⁺T细胞铺在12孔板中，按照实验设计，每孔预期的细胞数为5×10⁵。

3.2加药处理

对铺板后的CD4⁺T细胞进行4种不同的处理，每种处理设置三个复孔作为平行对照，并在细胞培养的第4天，第7天，第10天，第13天施加相应刺激。

细胞亚群分析及细胞数量的检测

细胞培养15 天后，分别吸取不同供体（n=24）的培养孔中的细胞，用细胞计数仪进行计数；从相对应的培养孔中吸取5×10⁵个细胞、300×g 15 min，用PBS洗涤细胞两次，孵育检测CD4⁺ TCM的流式抗体（CD45RA、CCR7、CD62L）半个小时；洗掉流式抗体，加入PBS稀释到相应浓度，运用流式细胞仪检测。对照组与实验组均为同一供体的CD4⁺ T 细胞，每个时间点分别取不同供体的细胞进行检测。

统计学软件及统计方法

采用SPSS13.0分析软件进行统计学分析。计量资料所有结果均用均数±标准差表示。实验组与对照组比较采用t检验，P<0.01为有显著性差异。

实验结果

6.1 阿普洛尔对CD4+TCM在CD4+T细胞中所占比例的流式检测

为了确定加入阿普洛尔刺激的CD4+ T细胞中TCM的起始比例，将CD4⁺  T cells以5×10⁶个/孔铺于24孔板中，加入anti-CD3抗体、anti-CD28抗体、IL-7以及IL-15。对照组(NC)和实验组在15 d时使用流式抗体标记细胞，然后将样本通过流式细胞仪进行检测。从CD45RA阴性的细胞中，选取CD62L与CCR7双阳性的细胞为所要观察的CD4⁺ TCM。按照上述通过流式细胞仪分选CD4⁺ TCM的方法，对CD4⁺ TCM在CD4⁺ T细胞中的比例进行检测，如图1所示。

6.2 不同浓度的阿普洛尔对于CD4⁺ T细胞扩增效果的检测

选取阿普洛尔处理第15天的时间点进行检测，不加入阿普洛尔的对照组(NC)的CD4⁺ TCM细胞占总CD4⁺ T细胞的比例为 16.06%；阿普洛尔浓度为5uM比例为27.26%；阿普洛尔浓度为10uM的比例为32.81%；阿普洛尔浓度为20uM的比例为34.44%。实验结果表明，不同浓度的阿普洛尔对于CD4⁺ T细胞的扩增作用在低于10uM的情况下存在剂量依赖的趋势，如图2所示。

结果分析

我们首次利用小分子药物阿普洛尔促进CD4⁺ TCM细胞在体外的扩增。实验组较对照组相比CD4⁺ TCM细胞的比例在CD4⁺ T细胞中有显著的抬高。

T细胞的免疫过继治疗当中，如果大量的过继转移T细胞会产生过激反应，在实验过程中，我们找到了在T细胞总数不变的情况下，将大量的初始T细胞转化为CD4⁺ TCM细胞的方法。实验中我们也进一步找出了阿普洛尔可促进CD4⁺ TCM在体外扩增的最适浓度：20uM。我们发现，使用较低剂量的阿普洛尔处理细胞后，CD4+ TCM细胞在CD4⁺ T细胞中的比例上抬存在显著的剂量依赖趋势；而当阿普洛尔的浓度达到20uM时，比例上抬效果明显趋于平缓（图2），这可能是由于药物浓度过大使得细胞的生长环境发生了较大的改变而影响了细胞的正常生长。在本实验中，选取阿普洛尔处理细胞的15天以后进行计数和检测是由于在外周血中CD4⁺ TCM的起始数量非常少，CD4⁺ T细胞需要较长的时间才能在anti-CD3与anti-CD28共同刺激下逐渐形成较多的CD4⁺ TCM。实验结果也表明选择培养较长时间后方进行检测可获得更好的效果（图2）。

阿普洛尔在临床上常用于高血压、心绞痛、心律失常，本发明中首次阐述了阿普洛尔在体外T细胞培养中全新的应用，为过继免疫治疗的广泛开展提供了良好的技术支持，其分子机制有待后续的进一步研究。