一种低毒含五条脂肪酸链的Kdo2-单磷酸类脂A的制备与应用

摘要

本发明公开了一种低毒含五条脂肪酸链的Kdo2-单磷酸类脂A的制备与应用，属于生物工程领域。本发明改造大肠杆菌，合成了一种具有特殊结构、低毒的、五链Kdo2-单磷酸类脂A，这种Kdo2-类脂A分子不连有核心多糖长链、仅由两个2-酮-3-脱氧辛酸、五条脂肪酸链和C4’位单个磷酸构成。该Kdo2-类脂A具有双亲性质，便于分离提取和纯化，能够被实施检测和直接鉴定，且保持了类脂A部分的生物免疫活性，较野生型W3110的LPS也有明显的减毒作用，是极具发展潜力的疫苗佐剂。同时，本发明提供的提取和纯化该Kdo2-类脂A的方法，步骤简单明了，易于操作。

说明书

技术领域

本发明涉及一种低毒含五条脂肪酸链的Kdo₂-单磷酸类脂A的制备与应用，属于生物工 程领域。

背景技术

脂多糖(LPS)，即细菌内毒素，是构成大多数革兰氏阴性细菌外膜外层的主要成分，主 要由Kdo₂-类脂A(Kdo₂-Lipid A)，核心多糖(Core)和O-抗原(O-antigen)三部分组成； 其中Kdo₂-类脂A是LPS的疏水端，其结构非常保守，连接着亲水的核心多糖和O-抗原并协 助二者粘附于细胞表面构成完整细胞壁，核心多糖和O-抗原部分具有异构性，不同的革兰氏 阴性菌株甚至同一菌株内糖基种类、个数、位置都有多种组合形式。革兰氏阴性菌侵入宿主 后会释放其表层的LPS，LPS可以被宿主免疫细胞表面的Toll样受体4(Toll Like Receptor 4， TLR-4)识别，继而引发细胞内一系列的生理生化反应，产生TNF-α、IL-6、IL-8等多种炎性 细胞因子。其中，Kdo₂-类脂A是与TLR-4受体结合的主要部分，尤其是类脂A部分的精细 结构决定了LPS刺激细胞后释放的细胞因子种类和数量。

野生型大肠杆菌和沙门氏菌的LPS中，类脂A部分包含六条或七条脂肪酸链，并在C1 位和C4’位有两个磷酸基团，具有较高的细胞毒性。某些特殊结构、低毒性的类脂A可作为 疫苗佐剂，非特异性地增强机体对抗原的免疫应答反应，提高疫苗效率。但是，由于类脂A 分子水溶性非常低，在水相中不能展现有效的生物活性，所以近几十年至今，基础科研或者 临床上还是使用LPS粗样来对相应的类脂A衍生物生物活性进行研究。然而，LPS由于分子 量大、核心糖及O抗原部分结构多样化，无法通过质谱或核磁共振的方法进行实时检测和快 速鉴定，也暂无标准化的提取纯化方法。且实际类脂A疫苗佐剂生产中，现用到的沙门氏菌 是致病菌，具有一定的安全隐患，且沙门氏菌同时生产多种不同结构的类脂A，提取过程繁 琐、能耗高。

大肠杆菌W3110是非致病菌，其LPS部分不包含O-抗原，只有Kdo₂-类脂A与核心多 糖，且其Kdo₂-类脂A部分结构单一，是优于沙门氏菌的工业生产出发菌株。本发明改造大 肠杆菌，合成了一种具有特殊结构、低毒的Kdo₂-类脂A，这种Kdo₂-类脂A不连接核心多糖 长链、仅由两个2-酮-3-脱氧辛酸、五条脂肪酸链和C4’位单个磷酸构成。这种特别的Kdo₂- 类脂A具有双亲性质，便于分离提取和纯化，能够被实施检测和直接鉴定，且保持了类脂A 部分的生物活性，较野生型W3110的LPS也有明显的减毒作用，是优于类脂A和LPS分子 的、极具发展潜力的疫苗佐剂。同时，本发明提供一种提取和纯化Kdo₂-类脂A的标准化方 法，步骤简单明了，易于操作。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种具有特殊结构、低毒的、五脂肪酸链Kdo₂- 单磷酸类脂A，其化学式为C₉₆H₁₇₅N₂O₃₅P，分子质量为1947.17，其结构包含2个α-酮基-3- 脱氧-D-甘露辛酸(Kdo)、2个氨基葡萄糖、1个磷酸基团和5条脂肪酸链，是以β-(1’-6)连 接的D-葡萄糖胺二糖为骨架，6’位连接二α-酮基-3-脱氧-D-甘露辛酸(Kdo₂)，4’位被磷酸化， 2’位氨基连接(R)-3-(十二烷氧基)十四烷基，3’位、3位和2位氨基分别连接十四烷氧基而构成， 具体结构式如式I所示。该化合物具双亲性，能够被有机体系直接提取同时可被ESI质谱直 接检测鉴定；在水相体系有较好溶解度，能特异性地通过TLR4/MD2受体激活先天性免疫 系统，但同时展现出低细胞毒性，具有作为免疫佐剂的潜力。

本发明要解决的第二个技术问题是提供一种能直接生产所述减毒Kdo₂-类脂A的大肠杆 菌基因工程菌E.coli W3110△waaCF△lacI△lpxMlacZ::FnlpxE。该基因工程菌敲除了lacI 基因编码lac操纵子中的调节蛋白；在染色体lacZ位点处敲入FnlpxE基因，其编码的蛋白酶 可以水解类脂A分子1位上的磷酸；敲除了编码的蛋白质可以在类脂A结构3’位添加十四 碳羟基脂肪酸链的lpxM基因，敲除waaCF基因簇，得到不含核心多糖的目的物。

所述大肠杆菌基因工程菌的构建方法是将E.coli W3110染色体基因组中waaCF、lacI、 lpxM基因发生缺失突变失活，lacZ基因内部敲入表达异源的FnlpxE基因。

所述方法主要包括以下步骤：首先，敲除野生型大肠杆菌W3110染色体上的lacI基因， lacI基因编码lac操纵子中的调节蛋白，敲除该基因可以解除调节蛋白对后期插入lacZ位点 的外源基因表达的阻遏作用；其次，在W3110△lacI菌株的基础上，在染色体lacZ位点处敲 入FnlpxE基因(lpxE来源于弗朗西斯菌，其编码的蛋白酶可以水解类脂A分子1位上的磷 酸)，使之形成组成型表达，构建中间菌株HW001；再次，在HW001的基础上敲除染色体上 的lpxM基因，其编码的蛋白质可以在类脂A结构3’位添加十四碳羟基脂肪酸链，构建中间 菌株HW002；最后，在HW002的基础上，敲除waaCF基因簇，构建出直接生产合成特殊结 构的五脂肪酸链Kdo₂-单磷酸类脂A目的基因工程菌BW002。

在本发明的一种实施方式中，构建的lacI敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，构建的FnlpxE-Fkan插入片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2 所示。

在本发明的一种实施方式中，构建的lpxM敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在本发明的一种实施方式中，构建的waaCF敲除片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供一种方便快捷的应用所述大肠杆菌基因工程菌生产减毒Kdo₂-类脂A的方 法，主要包括以下步骤：

(1)培养菌体：采用一般摇瓶发酵培养，将种子菌液转接培养至稳定期初期。

(2)提取分离：收集菌体，采用氯仿/甲醇/水混合相萃取法提取所述减毒Kdo₂-类脂A。

(3)DEAE纤维柱纯化：所述减毒Kdo₂-类脂A粗样混合着膜磷脂，通过上样于DEAE 纤维柱再经梯度洗脱可洗除磷脂杂质，得到高纯度的Kdo₂-类脂A。

传统类脂A的获得是先用苯酚提取脂多糖，再进行一系列水解、层析、纯化等过程。本 发明通过无痕敲除lpxM基因，直接合成只含有五条脂肪酸链的Kdo₂-类脂A分子，通过插入 表达FnlpxE基因，其编码的蛋白酶将五脂肪酸链Kdo₂-类脂A分子修饰成五脂肪酸链Kdo₂- 单磷酸类脂A分子，随后通过无痕敲除waaCF基因，使得菌株中由于缺乏外膜庚糖转移酶 而在内膜中无法将核心多糖的第一、第二个庚糖与完成结构修饰的、含有五条脂肪酸链的 Kdo₂-单磷酸类脂A分子相连，在生长过程中五脂肪酸链Kdo₂-单磷酸类脂A被直接翻转出外 膜外侧而生产出来。此特殊结构的Kdo₂-类脂A无需化学水解、层析便可直接提取获得。通 过常规摇瓶发酵得到的低毒的五脂肪酸链Kdo₂-单磷酸类脂A可被氯仿-甲醇体系直接提取， 方法类似于膜磷脂的提取，不用添加苯酚，也无需经过酸/碱水解，较类脂A的提取过程更为 简单。并且此新型Kdo₂-类脂A可直接通过薄层层析(TLC)和电喷雾质谱(ESI/MS)检测、 分析，而通常脂多糖由于其含大量亲水性糖链，分子量过大，脂溶性极低无法直接通过TLC 和EIS/MS分析。总的来说，本发明构建的大肠杆菌基因工程菌，在生产过程中无需诱导剂， 产物无需进一步的化学处理裂解糖链，菌株可用于直接提取获得低毒的、五脂肪酸链Kdo₂- 单磷酸类脂A的大规模生产；且此株工程菌生产的特殊结构Kdo₂-类脂A产物单一，具有双 亲性，在有机相和水相均有一定溶解度，更有利于与不同疫苗以多种形式结合，具有很好的 疫苗佐剂潜力。

附图说明

图1基因工程菌BW002所生产五链Kdo₂-单磷酸类脂A的TLC分析

1:WBB06Kdo₂-类脂A样品；2:基因工程菌BW002Kdo₂-类脂A样品

图2基因工程菌BW002所生产五链Kdo₂-单磷酸类脂A的ESI/MS分析

A:WBB06Kdo₂-类脂A样品；B:基因工程菌BW002Kdo₂-类脂A样品

图3野生型大肠杆菌W3110LPS与基因工程菌BW002五链Kdo₂-单磷酸类脂A刺激小 鼠巨噬细胞RAW264.7毒性分析

图4野生型大肠杆菌W3110LPS与基因工程菌BW002五链Kdo₂-单磷酸类脂A刺激人 巨噬细胞THP-1毒性分析

图5野生型大肠杆菌W3110与基因工程菌BW002的疏水性与自凝集特性分析

图6野生型大肠杆菌W3110与基因工程菌BW002的抗生素抗性分析

具体实施方式

实施例1基因工程菌BW002所生产的Kdo₂-类脂A的提取与结构分析

W3110所产生、含有长糖链的LPS无法直接提取，且由于质量太大、在有机相的溶解性 低也无法通过薄层层析(TLC)和ESI/MS分析直接分析结构。因此，我们选取大肠杆菌WBB06 (W3110waaCF::tet6)，W3110的庚糖缺失突变株作为结构分析的对照。WBB06被证实可 直接合成类脂A部分为六条脂肪酸链、双磷酸的Kdo₂-类脂A。

1、Kdo₂-类脂A的提取

对照菌WBB06和基因工程菌BW001所生产的Kdo₂-类脂A提取采用的是氯仿/甲醇/水 混合相萃取法。具体操作如下：将过夜培养的种子菌液按初始OD₆₀₀＝0.02转接到400mL LB 液体培养基中，37℃培养至OD₆₀₀＝1时8000rpm离心10min收集菌体，ddH₂O洗涤菌体一次 后用Bligh-Dyer一相体系(氯仿/甲醇/水，1:2:0.8，v/v/v)悬浮菌体，磁力搅拌1h，2000rpm 离心20min分相，取上相，再加入适量氯仿和水配成Bligh-Dyer二相体系(氯仿/甲醇/水， 2:2:1.8，v/v/v)，2000rpm离心10min，取下相移入旋蒸瓶中，旋转蒸发；最后加入氯仿/甲醇 溶液(2:1，v/v)将Kdo₂-类脂A洗出。

2、基因工程菌BW002所生产的Kdo₂-类脂A的薄层层析(TLC)分析

将洗出的WBB06与BW002生产的Kdo₂-类脂A样品用玻璃毛细管点于Gel 60TLC板 上，展层剂为氯仿/甲醇/冰醋酸/水(25：15：4：4，v/v/v/v)。层析结束后吹干板上残留的展 层剂，用溶于乙醇的10％硫酸进行碳化，置于加热板上显色(图1)。根据展层剂的性质，疏 水性越高的样品迁移速度越快，因此磷酸基团越少、脂肪酸链数量越多的样品应具有较高迁 移速率。TLC结果显示类脂A部分未经修饰的WBB06生产的Kdo₂-类脂A(泳道1)结构 比较单一，迁移速度较慢；基因工程菌BW002的Kdo₂-类脂A(泳道2)结构同样非常单一， 样品迁移速度略快于WBB06，推断其类脂A部分为含有五条脂肪酸链的Kdo₂-单磷酸类脂A 形式。TLC结构说明，经过定向改造，基因工程菌BW002能生产单一的、特殊结构的Kdo₂- 类脂A。

3、Kdo₂-类脂A结构的ESI/MS分析

ESI/MS分析：类脂样品溶于氯仿/甲醇溶液(2:1，v/v)中，在WATERS SYNAPT Q-TOF  Mass Spectrometer质谱仪上进行质谱检测。采用ESI离子源，阴离子检测模式，检测范围小 于m/z 2500(图2)。对照菌WBB06生产的Kdo₂-类脂A主要[M-H]^-峰m/z值为2236.0，说 明WBB06生产的Kdo₂-类脂A的确切分子量是2237；m/z值在2258.0和2279.9处的质谱峰 是样品离子化过程加上仪器中钠离子所产生的[M+Na-2H]^-和[M+2Na-3H]^-峰，实为同一物质。 基因工程菌BW002所生产的Kdo₂-类脂A，其类脂A部分五条脂肪酸链的Kdo₂-单磷酸类脂 A形式，在类脂A部分缺失了C1位磷酸基团(m/z值为80)以及C3’位次级脂肪酸链(m/z 值为210)，主要[M-H]^-峰m/z值为1946.2，说明BW002生产的特殊结构Kdo₂-类脂A的确切 分子量是1947.2；同样，m/z值在1968.2是加上钠离子后所产生的[M+Na-2H]^-峰，实为同一 物质。MS结果鉴定了基因工程菌BW002所生产Kdo₂-类脂A的确切结构，进一步说明基因 工程BW002可以直接产生结构非常单一的含有五条脂肪酸链的Kdo₂-单磷酸类脂A。

实施例2基因工程菌BW002所生产的五链Kdo₂-单磷酸类脂A的毒性分析

直接提取的Kdo₂-类脂A样品因混有多种膜磷脂，需要纯化去除磷脂干扰后再进行细胞 毒性分析。Kdo₂-类脂A的纯化主要通过DEAE纤维柱梯度洗脱完成。细胞刺激实验中，野 生型出发菌W3110脂多糖(LPS)纯化样品作为阳性对照，PBS作为硬性对照；另引入由基 因工程菌BW001(E.coli W3110△waaCF△lacIlacZ::FnlpxE)生产的减毒的、单磷酸六条 脂肪酸链Kdo₂-类脂A进行比较。

1、Kdo₂-类脂A的DEAE纤维柱纯化

基因工程菌BW002及对照工程菌BW001分别扩大接种800mL体系，过夜培养，按照实 施例1中所述方法提取所生产的Kdo₂-类脂A。将保存于氯仿/甲醇/2.4M醋酸铵(v/v/v 2:3:1) 中的DEAE-cellulose加到玻璃管中制成吸附分离柱，控制柱体积为20ml作用；用6倍体积的 氯仿/甲醇/水(v/v/v 2:3:1)平衡柱子；用一倍体积氯仿/甲醇/水(v/v/v 2:3:1)溶液洗出Kdo₂-类 脂A粗样，上样到柱子中；待样品流至填料上端时，用氯仿/甲醇/醋酸铵(v/v/v 2:3:1)溶液进 行阶段洗脱，其中水相醋酸铵的浓度梯度分别取60mM、120mM、240mM、360mM、480mM； 收集洗脱液并添加适量的氯仿和水，使洗脱液变成Bligh-Dyer二相体系，静置30mins左右， 取下相，氮吹。磷脂杂质主要在醋酸铵浓度为60mM、120mM、240mM时洗出，两株工程 菌生产的Kdo₂-类脂A样品均主要在醋酸铵浓度为360mM、480mM时洗出。

2、野生型大肠杆菌W3110LPS的提取及纯化

LPS的提取采用热酚法。将过夜培养的W3110菌液按初始OD₆₀₀＝0.02转接到800mL LB 液体培养基中，37℃培养12小时后8000rpm离心10min收集菌体，ddH₂O洗涤菌体一次后 称量菌体湿重，每3g湿菌体溶于10mL ddH₂O中，68℃预热。加入等体积预热的90％苯酚， 68℃剧烈振荡1小时。低温冷却后，4℃，4000rpm离心20分钟，上清液用ddH₂O透析三天 以去除苯酚，真空冷冻干燥得到LPS粗品。粗品用适量ddH₂O重悬后，加入RNaseA(终浓 度50μg/ml)和DNase I(终浓度100μg/ml)37℃处理2小时，再加入蛋白酶K(终浓度100μg/ml) 37℃处理过夜。酶处理后的样品中加入5mL水饱和苯酚，混匀，4000rpm离心30分钟，上 清液用ddH₂O透析一天，真空冷冻干燥得到LPS。将LPS复溶到氯仿/甲醇溶液(2:1，v/v)， 涡旋振荡30秒，12000rpm离心10分钟，移除上清，沉淀复溶在水中，真空冷冻干燥得到 LPS纯品。

3、Kdo₂-类脂A刺激小鼠巨噬细胞白血病细胞RAW264.7后产生炎性细胞因子的分析

小鼠细胞RAW264.7接种于96孔板，每孔10⁵个细胞，37℃，5％CO₂培养12小时后， 细胞贴壁，换新鲜培养液，加入不同浓度LPS(终浓度分别为0.1、1、10、100ng/ml)，刺激 24小时后取上清液，使用ELISA试剂盒(R&D Systems，DY406，DY410)分别检测白介素 -6(IL-6)与肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量(图3A,B)。所以样品的刺激结果利用最小显着 差法进行了差异分析，***P<0.001,**P<0.01，*P<0.1。在各个刺激浓度下，基因工程菌BW002 和减毒的工程菌BW001产生的Kdo₂-类脂A样品，均较野生型W3110LPS对细胞的刺激效 果有不同程度上的减弱，诱导细胞后产生的预炎症细胞因子IL-6和TNF-α也不同程度上降低； 其中基因工程菌BW002产生的Kdo₂-类脂A样品类脂A部分在缺失了C1位磷酸基团的同 时也减少了C3’位次级脂肪酸链，其细胞毒性减弱非常明显。例如，在样品浓度为100ng/ml 时，野生型W3110LPS包含六条脂肪酸链和两个磷酸基团的Kdo₂-类脂A，其刺激细胞产生 的IL-6和TNF-α分别高达3871.5pg/ml和14164.7pg/ml，BW001生产的单磷酸六条脂肪酸链 Kdo₂-类脂A刺激细胞产生的IL-6和TNF-α较低，分别为1533.2pg/ml和12067.1pg/ml。而基 因工程菌BW002产生的单磷酸五条脂肪酸链的Kdo₂-类脂A样品类脂A部分在同时缺失了 C1位磷酸基团和C3’位次级脂肪酸链后细胞毒性更加明显地减弱，细胞被刺激后产生的预炎 症细胞因子IL-6和TNF-α均较野生型W3110LPS刺激的产量要低得多，也低于C1位磷酸基 团的单磷酸六条脂肪酸链的样品诱导量。在样品浓度为100ng/ml时，BW002产生的Kdo₂-类 脂A样品诱导IL-6的产量为814.0pg/ml，仅为野生型W3110LPS诱导的21％，其诱导TNF-α 的分泌量也只有9059.9pg/ml，占野生型W3110LPS诱导的66％。因此，基因工程菌BW002 产生的Kdo₂-类脂A对小鼠细胞具有明显的减毒的效果，适宜应用于后续动物疫苗佐剂的开 发。

4、Kdo₂-类脂A刺激人急性白血病单核细胞THP-1后产生炎性细胞因子的分析

人细胞THP-1按每孔10⁵个细胞接种于96孔板，添加PMA至20ng/ml，37℃，5％CO₂诱导48小时使之分化为贴壁的巨噬细胞，继而更换新鲜培养液，同时加入不同浓度LPS(终 浓度分别为0.1、1、10、100ng/ml)，刺激24小时后取上清液，使用ELISA试剂盒(R&D Systems， DY208，DY210)分别检测白介素-8(IL-8)与肿瘤坏死因子α(TNF-α)含量(图4A,B)。 所以样品的刺激结果利用最小显着差法进行了差异分析，***P<0.001，**P<0.01，*P<0.1。 与小鼠细胞中刺激结果类似，基因工程菌BW002产生的Kdo₂-类脂A样品诱导人细胞THP-1 产生的IL-8与TNF-α与野生型W3110LPS、BW001Kdo₂-类脂A的诱导产量相比较，也有明 显的下降。在样品浓度为100ng/ml时，BW002产生的特殊结构Kdo₂-类脂A诱导产生的IL-8 仅为7379.1pg/ml，而野生型W3110LPS诱导量为19347.3pg/ml，六条脂肪酸链的BW001 Kdo₂-类脂A样品诱导量为14782.5pg/ml。基因工程菌BW002产生的Kdo₂-类脂A与野生型 W3110LPS、BW001Kdo₂-类脂A刺激人细胞THP-1后产生的TNF-α较小鼠细胞RAW264.7 低一个数量级，BW002产生的特殊结构Kdo₂-类脂A诱导产生的TNF-α也明显低于W3110 LPS、BW001Kdo₂-类脂A的诱导量，只有野生型W3110LPS诱导产量的46％。可见，基因 工程菌BW002产生的Kdo₂-类脂A对人细胞也有明显的减毒效果，也适宜应用于后续人的疫 苗佐剂的开发。

实施例3低毒的五链Kdo₂-单磷酸类脂A生产基因工程菌BW002疏水性和自凝集能力分析

1、基因工程菌BW002和野生型大肠杆菌W3110疏水性的比较

菌株疏水性测定方法为：过夜培养菌液离心(7000g，10min)收集菌体；菌体用PBS7.4 洗2次；然后用PBS7.4悬浮菌体使OD₆₀₀＝1.0(记为A₀，保留3位小数)；最后将2mL菌悬 液与800μL二甲苯混合，混旋2min，室温静置1h后测定水相的OD₆₀₀(记为A，保留3位 小数)，计算细胞表面疏水性:H％＝(A₀-A)/A₀*100。

由于LPS是大肠杆菌外膜表面的主要大分子，waaCF敲除后，LPS亲水性核心多糖链的 缺失会使细胞表面疏水性增强(图5A)。经测定，野生型大肠杆菌W3110的疏水性为39.6％， 而基因工程菌BW002的疏水性上升至78.7％，与对照的工程菌BW001的疏水性(82.8％)比 较接近，均为野生型的2倍左右。已有文献证明，菌株自凝集性与细胞表面疏水性正相关 (r＝0.71)，较强的细胞表面疏水性有利于增强细胞之间的疏水相互作用，使细胞在水溶液中 较易凝集而沉降下来。

2、基因工程菌BW002和野生型大肠杆菌W3110自凝集能力的比较

菌株自凝集能力测定方法为：离心(7000g，5min)过夜培养菌液以收集菌体，PBS7.4 洗菌体2次；然后用PBS7.4悬浮菌体使OD₆₀₀＝2.0(记为A₀，保留3位小数)；取12mL该 菌液加入试管或者刻度管中，于22℃静置；分别测定0h、1.5h、3h、6h、9h、12h、15h、 18h、24h的OD₆₀₀值(记为A_i，保留3位小数)；计算自凝集百分数AAg％＝[(A₀-A_i)/A₀]×100。 AAg％越大表明菌体的自凝集能力越强。绘制曲线表明自凝集能力大小随时间的动态变化。

如图5B，静置6小时后BW002自凝集百分数明显高于W3110，静置12小时后，W3110、 BW001、BW002的自凝集百分数分别为17.7％、72.6％、39.8％，BW002自凝集能力较较野 生型高出一倍有多，但低于BW001。菌体自凝集强的菌株在工业生产中更加有利于被迅速收 集，增加生产效率。

实施例4低毒的五链Kdo₂-单磷酸类脂A生产基因工程菌BW002的抗生素抗性分析

细菌外膜作为天然屏障，在抵御抗生素进入细胞中发挥着重要作用。LPS结构变化后， 考虑到工程菌株实际生产使用时的安全性，采用微量肉汤稀释法分别测定基因工程菌株和野 生型大肠杆菌对红霉素和新生霉素的最小抑菌浓度(MIC)。红霉素(Erythromycin)是大环 内酯类抗生素，可与23SrRNA的特异性区域结合，产生结构破坏效应，使肽酰tRNA从核糖 体上较早的解离，从而影响肽链的生成和延长；新生霉素(Novobiocin)是香豆素类抗生素， 可以抑制DNA聚合酶。影响核酸代谢。

MIC测定方法为：抗生素用LB液体培养基稀释，将倍比稀释的红霉素和新生霉素加到 96孔板中，每孔加100μL，其中红霉素浓度梯度为500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、 3.9μg/mL，新生霉素浓度梯度为1000、500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8μg/mL，最后 一孔不加药作为生长对照。

测定结果显示，基因工程菌株BW002菌株对红霉素(Erythromycin)和新生霉素 (Novobiocin)的敏感性基本一致，抗性均非常低。红霉素对W3110、BW001与BW002菌 株的MIC分别为125μg/mL、7.8μg/mL和3.9μg/mL；新生霉素对W3110、BW001与BW002 菌株MIC分别为500μg/mL、31.2μg/mL、7.8μg/mL。BW002菌株对红霉素和新生霉素的敏 感性明显增强，均降低到约为野生型的1/32，也明显低于BW001，说明同时缺失C1位磷酸 基团以及核心多糖后，细胞外膜渗透性大大提高从而抗生素更容易进入细胞，而在此基础上 再去除C2’位次级脂肪酸链，则更进一步增加了细胞外膜渗透性，使基因工程菌BW002对各 种抗生素都高度敏感。总而言之，对抗生素的高敏感性和低抗性表明基因工程菌株BW002 菌株是非常安全可控的工业生产菌株。

本发明构建的基因工程菌株能直接生产特殊结构、低毒、含五条脂肪酸链链的Kdo₂-单磷 酸类脂A，避免了使用致病菌生产LPS或类脂A，同时避免的苯酚的使用和繁琐的化学水解、 层析，菌株自身无抗生素筛选标记并显示较高抗生素敏感性和较高的自凝集能力，更有利于 安全的、绿色的、大规模的工业化生产。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人， 在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以 权利要求书所界定的为准。