一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖GPC3蛋白片段及其应用和制备的杂交瘤细胞株

摘要

本发明涉及一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖GPC3蛋白片段，其具有如SEQ ID No.1的氨基酸序列；本发明的GPC3蛋白片段的抗体特异性强，可用于制备高效价的多克隆或单克隆抗体，或者制备GPC3蛋白标准品，可用于GPC3蛋白检测，包括蛋白含量、活性和蛋白结构的检测。本发明还涉及一种单克隆抗体杂交瘤细胞株GPC3-1H5，分泌的GPC3抗体产量高，效价高，反应灵敏，有利于提高检测的灵敏性和准确性，可以广泛应用于GPC3蛋白表达的检测，降低GPC3抗体的生产成本，有利于GPC3检测的临床推广使用。

说明书

技术领域

本发明涉及一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3GPC3蛋白片段、其应用及其制备的单克隆抗体杂交瘤细胞株GPC3-1H5，具体属于细胞工程领域。

背景技术

我国肝癌的早期诊断中应用最多的检测指标是甲胎蛋白（AFP），吴孟超等检测了5343例肝癌病例中甲胎蛋白的水平，阳性率为69.4%。表明甲胎蛋白是目前诊断肝癌极为重要的血清标志物之一，但是同时仍有3成以上的错、漏检率。寻找新的肝癌特异性标志物是提高临床早期诊断的重要途径之一。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖是硫酸乙酰肝素糖蛋白中的一个家族，参与调控个体发育、细胞增殖和分化等过程。其中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（Glypican-3，GPC3）是1996年Pillia等在研究Simpson-Golabi-Behmel综合症（SGBS）时，从人胚胎cDNA文库中首次克隆。GPC3基因定位于人染色体Xq26[2-3]，结构全长大于900kb，是人类最大的基因之一。其5'端朝向端粒区，3'端朝向中心粒区，由8个外显子和7个内含子组成。启动子区有许多转录因子结合位点。cDNA序列全长为2263bp，1740bp的开放阅读框编码580个氨基酸，分子量为66KDa左右。

Glypican-3的结构具有Glypican家族的共同特点，如中央球状空间结构、C端通过糖基磷脂酰肌醇（glycosyl-phosphatidylinositol, GPI）锚定于细胞膜上等。近期的相关研究表明，Glypican-3与多种肿瘤的发生发展关系密切，特别是在肝细胞癌中特异性高表达，是一种潜在的肝癌血清学和组织学重要诊断标志物。专利CN200880103166.9公开了一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的单克隆抗体，其是以磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的胞外域制备的单克隆抗体，用于肿瘤诊断药物。专利CN201210152819.0则公开了一种以磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3全长片段制备的单克隆抗体，用于肿瘤诊断药物。

发明内容

本发明的目的在于表达出磷脂酰肌醇蛋白聚糖3蛋白片段，同时提供一种所分泌抗体的效价高、特异性强的单克隆抗体杂交瘤细胞株，有利于提高检测的反应灵敏性。

本发明为实现上述发明目的，所采用的技术方案如下：

一种具有如SEQ ID No.1的氨基酸序列的磷脂酰肌醇蛋白聚糖GPC3蛋白片段。

进一步的，所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖GPC3蛋白片段由SEQ ID No.2的cDNA序列编码。

进一步的，所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖GPC3蛋白片段的cDNA序列通过PCR扩增获得，所述PCR的上游引物为SEQ ID No.3：5’-CGGAATTCCTTGGTGGTGGCGATGCT-3’，下游引物为SEQ ID No.4：5’-CGGGATCCCCCGAGGTTGTGAAAGGT-3’。

进一步的，所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖GPC3蛋白片段的表达载体为p3XFLAG-CMV-14，表达质粒为CMV-gpc3。

所述的磷脂酰肌醇蛋白聚糖GPC3蛋白片段在制备癌症检测制剂中的应用。

进一步的，所述的癌症检测制剂包括以GPC3为标记物的检测制剂、含GPC3多克隆抗体的检测制剂或含GPC3单克隆抗体的检测制剂。

分泌所述的GPC3单克隆抗体的杂交瘤细胞株GPC3-1H5，该细胞株于2014年11月28日在中国典型培养物保藏中心进行了保藏，保藏号为：CCTCC C2014211。

所述的分泌GPC3单克隆抗体的杂交瘤细胞株GPC3-1H5的制备以GPC3重组蛋白为抗原免疫小鼠，取血清效价在1:10⁵以上的小鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合，筛选获得杂交瘤细胞株GPC3-1H5；所述GPC3重组蛋白具有如SEQ ID No.1的氨基酸序列。

单克隆抗体杂交瘤细胞株GPC3-1H5的制备方法中所述GPC3重组蛋白由SEQ ID No.2的cDNA序列编码；所述cDNA序列通过PCR扩增获得，所述PCR的上游引物为SEQ ID No.3：5’-CGGAATTCCTTGGTGGTGGCGATGCT-3’，下游引物为SEQ ID No.4：5’-CGGGATCCCCCGAGGTTGTGAAAGGT-3’。

单克隆抗体杂交瘤细胞株GPC3-1H5的制备方法中所述GPC3重组蛋白的表达载体为p3XFLAG-CMV-14，表达质粒为CMV-gpc3。

单克隆抗体杂交瘤细胞株GPC3-1H5分泌的单克隆抗体在制备GPC3蛋白表达检测试剂盒中的应用。

磷脂酰肌醇蛋白聚糖GPC3蛋白片段在制备癌症检测制剂中的应用，其特征在于所述的癌症检测制剂包括以GPC3为标记物的检测制剂、含GPC3多克隆抗体的检测制剂或含GPC3单克隆抗体的检测制剂。

本发明单克隆抗体杂交瘤细胞株GPC3-1H5分泌的单克隆抗体可以应用于制备检测试剂盒，用于检测GPC3蛋白表达，如ELISA检测、免疫荧光分析、western-blot、免疫组织化学检测等。

本发明的有益效果为：

本发明的GPC3蛋白片段的抗体特异性强，可用于制备高效价的多克隆或单克隆抗体，或者制备GPC3蛋白标准品，可用于GPC3蛋白检测、包括含量、活性和蛋白结构的检测。

本发明的单克隆抗体杂交瘤细胞株GPC3-1H5分泌的抗体产量高，效价高，反应灵敏，有利于提高检测的灵敏性和准确性，可以广泛应用于GPC3蛋白表达的检测，降低GPC3抗体的生产成本，有利于GPC3检测的临床推广使用。

生物样品保藏信息

单克隆抗体杂交瘤细胞株GPC3-1H5，分类命名为细胞株（Cell Strain），已于2014年11月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072，菌种保藏号为CCTCC No. C2014211。

附图说明

图1为实施例1中gpc3基因PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图；

图2为实施例1中重组质粒CMV-gpc3的EcoRΙ和BamHΙ双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图；

图3为GPC3真核表达后的SDS-PAGE电泳图。

具体实施方式

本发明结合附图和具体实施例做进一步的说明。

实施例1  gpc3基因的克隆及重组表达质粒的构建

以含gpc3基因的质粒为模板进行PCR扩增。

上游引物：5’-CGGAATTCCTTGGTGGTGGCGATGCT-3’，插入EcoRΙ酶切位点。

下游引物：5’-CGGGATCCCCCGAGGTTGTGAAAGGT-3’，插入BamHΙ酶切位点。

扩增条件：95℃预变性5 min；94℃变性1 min，62℃退火1 min，72℃延伸2 min，共30个循环；72℃延伸10 min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，实验结果如图1所示，扩增所得1650bp的核苷酸片段。

将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，连入pMD18-T载体，产物用T4连接酶在16℃水浴中连接。将连接产物转化至E.coli DH5α菌株，筛选阳性克隆，获得重组表达质粒pMD18-gpc3。

将质粒pMD18-gpc3和质粒p3XFLAG-CMV-14分别用EcoRΙ和BamHΙ双酶切，产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收。取含有酶切位点的目的基因和经双酶切的p3XFLAG-CMV-14用T4连接酶在16℃水浴中连接。将连接产物转化至E.coli DH5α菌株，筛选阳性克隆，获得重组表达质粒CMV-gpc3。

转化E.coli DH5α，挑选阳性克隆，提取质粒，进行EcoRΙ和BamHΙ双酶切，经琼脂糖凝胶电泳检测片段大小，结果如图2所示。质粒CMV-gpc3经测序鉴定，结果表明，插入片段与已经发表的全序列中该片段完全一致，且以正确的方向插入到表达载体的克隆位点。

实施例2融合蛋白的诱导表达和纯化

将状态良好的HEK293细胞以2×10⁵个/孔的密度铺于6孔板中培养。培养24h后，待细胞融合度为80%～90%时进行转染。用PBS冲洗3次，加入无血清DMEM高糖培养基。按照Lipofectamine^TM2000转染试剂说明书进行，以上述步骤获得的重组表达质粒CMV-gpc3进行转染，同时设立空白对照组（HEK293细胞）和阳性对照组（p3XFLAG-CMV-14）。用含有0.5mg/L G418、10%胎牛血清的DMEM高糖培养基加压筛选，采用有限稀释法进行单克隆细胞制备，最终得到稳定表达重组蛋白的细胞株。

实施例3  单克隆抗体杂交瘤细胞株GPC3-1H5的制备

以常规方法扩增上述步骤制备的表达重组蛋白的细胞株，低温离心收集菌体，在冰浴中进行超声波破碎，以4℃、8000r/min离心20min，收集上清，按Anti-FLAG resin 纯化试剂盒纯化获得GPC3重组蛋白。

表达的GPC3重组蛋白经过纯化作为抗原，按照标准免疫程序进行免疫，即第一次免疫为等体积重组蛋白和完全弗氏佐剂混合，小鼠腹腔注射，剂量为100ul/只，其中含重组蛋白50ug。从第二次免疫开始，用等体积重组蛋白和不完全弗氏佐剂混合，重组蛋白免疫剂量同第一次免疫，每两周免疫一次。取小鼠尾静脉血检测抗体滴度，当达到1∶1×10⁵后，无菌条件下取小鼠脾脏，分离脾细胞，与Sp2/0细胞以10∶1 比例进行融合。以重组蛋白为检测原，利用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞效价。通过多轮得有限稀释法筛出阳性杂交瘤细胞株GPC3-1H5，按照常规方法制备腹水，利用Protein G亲和层析柱纯化mAb。用间接ELISA 法测定，其分泌的单抗效价为1∶5.12×10⁶，抗体亚型为IgG1 型。

采用间接ELISA法进行抗体效价测定，具体步骤如下：

（1）抗原包被，采用碳酸盐缓冲液作为包被液，包被原GPC3浓度为0.5ug/ml，96孔酶标板每孔100ul，4℃过夜；洗涤，包被板恢复至室温，倾去包被液，每孔加洗液300ul，每次震荡lmin，洗3-4次，拍干；

（2）封闭，每孔加200ul 10%小牛血清作为封闭液，37℃1h；洗涤，恢复至室温，倾去封闭液，洗涤三次，每次震荡lmin，拍干；

（3）加待测抗体样品，用缓冲溶液将待测血清溶液以200倍开始倍比稀释，每孔加入100uL，并且设置空白对照孔(PBS)和阴性孔(阴性血清)，37℃放置45min；洗涤，洗涤3次，每次震荡lmin，拍干；

（4）加酶标二抗，每孔加入100ul的l:10000稀释的HRP酶标记的山羊抗鼠IgG，37℃放置30min；洗涤，洗涤3次，每次震荡1min，拍干；

（5）显色，每孔加底物显色液 100ul，37℃保温避光反应15min；终止反应，每孔加入50ul 终止液，

（6）终止反应；测定OD_450nm值，用检测波长为450nm的酶标仪读取各孔光密度值。阴性对照孔OD_450nm值为N，阳性为P，以P/N≧2.1，为阳性结果。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  河北省科学院生物研究所

 

<120>  一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖GPC3蛋白片段及其应用和制备的杂交瘤细胞株

 

<130>  2014

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  537

<212>  PRT

<213>  人工序列

 

<400>  1

 

Leu Val Val Ala Met Leu Leu Ser Leu Asp Phe Pro Gly Gln Ala Gln

1               5                   10                  15     

 

 

Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp Ala Thr Cys His Gln Val Arg Ser Phe

            20                  25                  30         

 

 

Phe Gln Arg Leu Gln Pro Gly Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro Val

        35                  40                  45             

 

 

Pro Gly Ser Asp Leu Gln Val Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys Cys

    50                  55                  60                 

 

 

Ser Arg Lys Met Glu Glu Lys Tyr Gln Leu Thr Ala Arg Leu Asn Met

65                  70                  75                  80 

 

 

Glu Gln Leu Leu Gln Ser Ala Ser Met Glu Leu Lys Phe Leu Ile Ile

                85                  90                  95     

 

 

Gln Asn Ala Ala Val Phe Gln Glu Ala Phe Glu Ile Val Val Arg His

            100                 105                 110         

 

 

Ala Lys Asn Tyr Thr Asn Ala Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser Leu

        115                 120                 125            

 

 

Thr Pro Gln Ala Phe Glu Phe Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val Ser

    130                 135                 140                 

 

 

Leu Tyr Ile Leu Gly Ser Asp Ile Asn Val Asp Asp Met Val Asn Glu

145                 150                 155                 160

 

 

Leu Phe Asp Ser Leu Phe Pro Val Ile Tyr Thr Gln Leu Met Asn Pro

                165                 170                 175    

 

 

Gly Leu Pro Asp Ser Ala Leu Asp Ile Asn Glu Cys Leu Arg Gly Ala

            180                 185                 190        

 

 

Arg Arg Asp Leu Lys Val Phe Gly Asn Phe Pro Lys Leu Ile Met Thr

        195                 200                 205            

 

 

Gln Val Ser Lys Ser Leu Gln Val Thr Arg Ile Phe Leu Gln Ala Leu

    210                 215                 220                

 

 

Asn Leu Gly Ile Glu Val Ile Asn Thr Thr Asp His Leu Lys Phe Ser

225                 230                 235                 240

 

 

Lys Asp Cys Gly Arg Met Leu Thr Arg Met Trp Tyr Cys Ser Tyr Cys

                245                 250                 255    

 

 

Gln Gly Leu Met Met Val Lys Pro Cys Gly Gly Tyr Cys Asn Val Val

            260                 265                 270        

 

 

Met Gln Gly Cys Met Ala Gly Val Val Glu Ile Asp Lys Tyr Trp Arg

        275                 280                 285            

 

 

Glu Tyr Ile Leu Ser Leu Glu Glu Leu Val Asn Gly Met Tyr Arg Ile

    290                 295                 300                

 

 

Tyr Asp Met Glu Asn Val Leu Leu Gly Leu Phe Ser Thr Ile His Asp

305                 310                 315                 320

 

 

Ser Ile Gln Tyr Val Gln Lys Asn Ala Gly Lys Leu Thr Thr Thr Ile

                325                 330                 335    

 

 

Gly Lys Leu Cys Ala His Ser Gln Gln Arg Gln Tyr Arg Ser Ala Tyr

            340                 345                 350        

 

 

Tyr Pro Glu Asp Leu Phe Ile Asp Lys Lys Val Leu Lys Val Ala His

        355                 360                 365            

 

 

Val Glu His Glu Glu Thr Leu Ser Ser Arg Arg Arg Glu Leu Ile Gln

    370                 375                 380                

 

 

Lys Leu Lys Ser Phe Ile Ser Phe Tyr Ser Ala Leu Pro Gly Tyr Ile

385                 390                 395                 400

 

 

Cys Ser His Ser Pro Val Ala Glu Asn Asp Thr Leu Cys Trp Asn Gly

                405                 410                 415    

 

 

Gln Glu Leu Val Glu Arg Tyr Ser Gln Lys Ala Ala Arg Asn Gly Met

            420                 425                 430        

 

 

Lys Asn Gln Phe Asn Leu His Glu Leu Lys Met Lys Gly Pro Glu Pro

        435                 440                 445            

 

 

Val Val Ser Gln Ile Ile Asp Lys Leu Lys His Ile Asn Gln Leu Leu

    450                 455                 460                

 

 

Arg Thr Met Ser Met Pro Lys Gly Arg Val Leu Asp Lys Asn Leu Asp

465                 470                 475                 480

 

 

Glu Glu Gly Phe Glu Ser Gly Asp Cys Gly Asp Asp Glu Asp Glu Cys

                485                 490                 495    

 

 

Ile Gly Gly Ser Gly Asp Gly Met Ile Lys Val Lys Asn Gln Leu Arg

            500                 505                 510        

 

 

Phe Leu Ala Glu Leu Ala Tyr Asp Leu Asp Val Asp Asp Ala Pro Gly

        515                 520                 525            

 

 

Asn Ser Gln Gln Ala Thr Pro Lys Asp

    530                 535        

 

 

<210>  2

<211>  1641

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

ttggtggtgg cgatgctgct cagcttggac ttcccgggac aggcgagccc ccgccgccgc     60

 

cgccggacgc cacctgtcac caagtccgct ccttcttcca gagactgcag cccggactca    120

 

agtgggtgcc agaaactccc gtgccaggat cagatttgca agtatgtctc cctaagggcc    180

 

caacatgctg ctcaagaaag atggaagaaa aataccaact aacagcacga ttgaacatgg    240

 

aacagctgct tcagtctgca agtatggagc tcaagttctt aattattcag aatgctgcgg    300

 

ttttccaaga ggcctttgaa attgttgttc gccatgccaa gaactacacc aatgccatgt    360

 

tcaagaacaa ctacccaagc ctgactccac aagcttttga gtttgtgggt gaatttttca    420

 

cagatgtgtc tctctacatc ttgggttctg acatcaatgt agatgacacg gtcaatgaat    480

 

tgtttgacag cctgtttcca gtcatctata cccagctaat gaacccaggc ctgcctgatt    540

 

cagccttgga catcaatgag tgcctccgag gagcaagacg tgacctgaaa gtatttggga    600

 

atttccccaa gcttattatg acccaggttt ccaagtcact gcaagtcact aggatcttcc    660

 

ttcaggctct gaatcttgga attgaagtga tcaacacaac tgatcacctg aagttcagta    720

 

aggactgtgg ccgaatgctc accagaatgt ggtactgctc ttactgccag ggactgatga    780

 

tggttaaacc ctgtggcggt tactgcaatg tggtcatgca aggctgtatg gcaggtgtgg    840

 

tggagattga caagtactgg agagaataca ttctgtccct tgaagaactt gtgaatggca    900

 

tgtacagaat ctatgacatg gagaacgtac tgcttggtct cttttcaaca atccatgatt    960

 

ctatccagta tgtccagaag aatgcaggaa agctgaccac cactattggc aagttatgtg   1020

 

cccattctca acaacgccaa tatagatctg cttattatcc tgaagatctc tttattgaca   1080

 

agaaagtatt aaaagttgct catgtagaac atgaagaaac cttatccagc cgaagaaggg   1140

 

aactaattca gaagttgaag tctttcatca gcttctatag tgctttgcct ggctacatct   1200

 

gcagccatag ccctgtggcg gaaaacgaca ccctttgctg gaatggacaa gaactcgtgg   1260

 

agagatacag ccaaaaggca gcaaggaatg gaatgaaaaa ccagttcaat ctccatgagc   1320

 

tgaaaatgaa gggccctgag ccagtggtca gtcaaattat tgacaaactg aagcacatta   1380

 

accagctcct gagaaccatg tctatgccca aaggtagagt tctggataaa aacctggatg   1440

 

aggaagggtt tgaaagtgga gactgcggtg atgatgaaga tgagtgcatt ggaggctctg   1500

 

gtgatggaat gataaaagtg aagaatcagc tccgcttcct tgcagaactg gcctatgatc   1560

 

tggatgtgga tgatgcgcct ggaaacggtc agcaggcaac tccgaaggac aacgagataa   1620

 

gccacctttc acaacctcgg g                                             1641

 

 

<210>  3

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  3

cggaattcct tggtggtggc gatgct                                          26

 

 

<210>  4

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  4

cgggatcccc cgaggttgtg aaaggt                                          26