抗HER2-抗CD3 scFv双特异四价抗体

摘要

本发明涉及抗HER2-抗CD3 scFv双特异四价抗体。具体而言，本发明涉及包含抗HER2 IgG、连接片段和抗CD3 scFv的双特异四价抗体，其中抗CD3 scFv通过连接片段与抗HER2 IgG的C端连接。本发明的双特异四价抗体具有两个与HER2抗原结合的区域和两个与CD3抗原结合的区域，且包含人源化的Fc片段，免疫原性大大降低，可以采用简便的真核细胞表达系统生产，生产方便。

说明书

技术领域

本发明涉及一种双特异四价抗体，具体而言，本发明涉及同时靶向CD3和HER2的抗体，更具体而言，本发明涉及抗HER2-抗CD3 scFv双特异四价抗体。

背景技术

一直以来乳腺癌都是一种致命性疾病，从首次发现转移到累积生存率为50％时所对应的生存时间仅为17至20个月(Piccart M.Anticancer Drugs,7:5-7,1996)。有一些激素、细胞毒素或者其他生物制剂在乳腺癌的保守治疗中表现出一定的作用，但是截止目前并没有一致认可的乳腺癌标准治疗方案，并且通常的治疗方案都会带来严重的副反应(Bernard Marty C,等人，Oncologist,9:617-632,2004)。

在二十世纪80年代，Denis Slamon首次在189个原发性乳腺癌病例中发现HER2(人表皮生长因子受体2)基因在30％的病例中都过度扩增，并表明HER2与总存活率及复发时间密切相关(Salman DJ,等人，Science,235:177-182,1985)。目前的研究表明，大约25～30％的乳腺癌病人中的HER2都是过表达的(Revillion F,等人，Eur J Cancer,34:791-808,1998)，并且其与肿瘤的恶性生长程度相关(Wright C,等人，Cancer Res,49:2087-2090,1989)。

曲妥珠单抗(Trastuzumab)是一个抗HER2胞外区的人源化单克隆抗体(Carter P,等人，PNAS,89(10):4285-4289,1992)。然而其在临床应用中的抗肿瘤效果往往没有临床前实验那么好，所以通常需要与化疗药等联合用药(Slamon DJ,等人，N Engl J Med,344:783-792,2001)。

设计一种可以募集效应细胞的双功能抗体是提高抗体效能的有效手段。目前为止，研究最多的是利用CD3分子的功能。通过CD3分子将杀伤性T细胞激活，可以有效地清除目的肿瘤(Haas C,等人，Immunobiology,214:441-453,2009)。其中Micormet公司开发的一种重组双功能T细胞激动抗体为BiTE，具有很好的前景，但是其最大的问题在于血浆半 衰期非常短，人体半衰期仅为1小时(Loffler A,等人，Blood,95:2098-2103)。这是由BiTE本身的结构所导致的，其由两个单链抗体片段组成，分子量仅60kDa，并且缺失了抗体分子中对延长半衰期有重要作用的Fc片段。

卡妥索单抗(Catumaxomab)是另一种具有前景的多功能抗体，是一种靶向CD3及EpCAM的杂合Ig分子，目前该产品已经被批准用于腹水癌的治疗(Jager M,等人，Cancer Res,72:24-32,2012)。另一种处于临床二期的多功能抗体为厄妥索单抗(Ertumaxomab)，其靶向CD3及HER2。这种杂合抗体的一条重链及轻链来源于大鼠的IgG，靶向CD3；另一条重链及轻链来源于小鼠的IgG，靶向HER2。由此而带来的问题就是这种产品的生产非常困难，因为，为了获得表达双功能厄妥索抗体的细胞系，首先要获得一株表达CD3抗体的二倍体杂交瘤，以及一株表达HER2抗体的二倍体杂交瘤，然后将两株杂交瘤再次杂交，获得四倍体杂交瘤，其可以表达抗CD3以及HER2的双功能抗体。而生产普通的单个靶点的抗体，只需要获得一株二倍体杂交瘤，与此相比较，双功能抗体的生产过程更复杂，而且四倍体杂交瘤的获得更加困难，并且由于其鼠源的来源，导致其免疫原性很高。

因此，本领域需要一种人源化的并且能够高特异地靶向并杀死表达HER2的肿瘤细胞，尤其是低表达HER2的肿瘤细胞的双功能抗体。

发明内容

因此，本发明的技术目的在于提供利用CD3分子募集效应细胞的活性从而增强HER2特异性杀伤肿瘤细胞活性的双功能抗体。

因此，本发明的第一方面涉及一种双特异四价抗体，其包括一种靶向第一抗原HER2的蛋白功能区和一种靶向第二抗原CD3的蛋白功能区，其中靶向第二抗原CD3的蛋白功能区连接在靶向第一抗原HER2的蛋白功能区的C端。

在某些实施方案中，所述靶向第二抗原CD3的蛋白功能区通过连接片段连接在靶向第一抗原HER2的蛋白功能区的C端。

在某些实施方案中，所述靶向第一抗原HER2的蛋白功能区为靶向HER2的免疫球蛋白或其修饰物、功能等同物、功能片段或变体，在某些实施方案中，靶向第一抗原HER2的免疫球蛋白为IgG、IgA、IgD、IgE、IgM抗体或者它们的杂合体，在某些实施方案中，靶向第一抗原HER2的免疫球蛋白为IgG抗体。

在某些实施方案中，所述免疫球蛋白为嵌合的、人源化的或全人的免疫球蛋白。

在某些实施方案中，靶向第二抗原CD3的蛋白功能区为靶向CD3的免疫球蛋白或其修饰物、功能等同物、功能片段或变体，在某些实施方案中，靶向第二抗原CD3的蛋白功能区为靶向CD3的scFv或Fab。

在某些实施方案中，所述scFv或Fab为嵌合的、人源化的或全人的scFv或Fab。

在某些实施方案中，所述连接片段长度为5-30个氨基酸，在某些实施方案中，所述连接片段长度为15个氨基酸，在某些实施方案中，所述连接片段的序列为GGGGSGGGGSGGGGS。

在某些实施方案中，所述双特异四价抗体由抗HER2 IgG-连接片段-抗CD3 scFv组成，在某些实施方案中，所述双特异四价抗体由两条包含SEQ ID No：1的轻链和两条包含SEQ ID No：3的重链组成。

在某些实施方案中，所述轻链和重链分别为经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而由SEQ ID No：1和SEQ ID No：3衍生而来并高特异地靶向并杀死表达HER2的恶性细胞的序列，或者是与SEQ ID No：1和No：3所示的序列具有至少约70％同一性并高特异地靶向并杀死表达HER2的恶性细胞的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述轻链和重链分别为与SEQ ID No：1和No：3所示的序列具有至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％同一性并高特异地靶向并杀死表达HER2的恶性细胞的氨基酸序列。

本发明第二方面涉及如上所述的双特异四价抗体的编码核酸序列。

在某些实施方案中，所述编码核酸序列为分别包含SEQ ID No：2和No：4所示序列的序列。

本发明的第三方面涉及一种包含有效连接其中的如上所述的编码核酸序列的载体。

在某些实施方案中，所述载体中编码轻链和重链的核酸序列存在于不同的表达框中。

在某些实施方案中，所述的载体为真核细胞表达载体，在某些实施方案中，所述的载体为经改造而具有两个表达框的载体Y0GC。

本发明的第四方面涉及一种转化或转染有如上所述的载体的宿主细胞。

本发明的第五方面涉及一种药物组合物，其包含如上所述的双特异四价抗体和药学上可接受的载体。

本发明的第六方面涉及一种生产双特异四价抗体的方法，其包括在适宜的多肽表达条件下培养如上所述的宿主细胞，并从细胞培养基中分离、纯化表达的双特异四价抗体。

本发明的第七方面涉及如上所述的双特异四价抗体在制备用于预防或治疗由HER2表达而引起的疾病的药物中的用途，在某些实施方案中，所述疾病为恶性肿瘤，在某些实施方案中，所述恶性肿瘤选自乳腺癌、胃癌、直肠癌，在某些实施方案中，所述恶性肿瘤选自乳腺癌。

本发明的第八方面涉及一种抑制或治疗恶性肿瘤的方法，包含给予治疗有效剂量的如上所述的药物组合物，在某些实施方案中，所述恶性肿瘤选自乳腺癌、胃癌、直肠癌，在某些实施方案中，所述恶性肿瘤选自乳腺癌。

本发明的第九方面涉及如上所述的双特异四价抗体，其用于预防或治疗由HER2表达而引起的疾病，在某些实施方案中，所述疾病为恶性肿瘤，在某些实施方案中，所述恶性肿瘤选自乳腺癌、胃癌、直肠癌，在某些实施方案中，所述恶性肿瘤选自乳腺癌。

本发明具有以下几方面优点：

(1)本发明的抗HER2-抗CD3 scFv双特异四价抗体的结构示意图如图1A图所示。这种抗体的结构具有两个与HER2抗原结合的区域①②，以及两个与CD3抗原结合的区域③④；而应用四倍体杂交瘤生产的厄妥索单抗的结构如图1的B图所示，这种杂合的抗体结构只具有一个与HER2抗原结合的区域⑤，一个与CD3抗原结合的区域⑥。本发明所述抗体的抗原结合效价是厄妥索单抗的2倍。

(2)本发明所述抗体的结构包含Fc片段，为人源化产物，而厄妥索单抗的Fc片段为大鼠片段与小鼠片段杂交形成的，免疫原性远远高，本发明产品将大大地降低产物的免疫原性。

(3)本发明所述抗体可以采用简便的真核细胞表达系统生产，使用稳定的单克隆细胞系表达抗体，生产工艺及产品稳定；厄妥索单抗使用四倍体杂交瘤生产，四倍体杂交瘤的获得困难，并且不能稳定传代培养，给生产带来诸多不便。

(4)本发明所述抗体的纯化工艺简便，所述抗体在细胞中表达出单一结构的产物；而厄妥索单抗采用的四倍体杂交瘤表达出的产物，由于其含有两种重链，两种轻链，因此形成所需的重轻链正确配对的产物只占总产物的十分之一，下游纯化十分困难，并且产率低下。

附图说明

图1：A：抗HER2-抗CD3 scFv双特异四价抗体的结构图，B：厄妥索单抗的结构。

图2：Y0GC-抗HER2-抗CD3 scFv质粒图。

图3：抗HER2-抗CD3 scFv双特异四价抗体纯化流程图。

图4：抗HER2-抗CD3 scFv双特异四价抗体用rProtein A亲和色谱纯化时的洗脱图。

图5：抗HER2-抗CD3 scFv双特异四价抗体用阴离子交换色谱纯化时的洗脱图。

图6：抗HER2-抗CD3 scFv双特异四价抗体用凝胶排阻层析色谱纯化时的洗脱图

图7：抗HER2-抗CD3 scFv双特异四价抗体的稳定性

图8：FACS检测抗HER2-抗CD3 scFv双特异四价抗体的抗原结合活性；其中图A、B分别使用的是SK-OV-3细胞和Jurkat细胞。

图9：抗HER2-抗CD3 scFv双特异四价抗体的细胞毒性结果；其中图A,B,C分别使用的是SK-BR-3细胞(效应细胞effector cell(E),肿瘤细胞tumor cell(T),E/T＝20:1),N87细胞(E/T＝20:1),HCT-8细胞(E/T＝5:1)。

图10：抗HER2-抗CD3 scFv双特异四价抗体在BALB/c小鼠体内的血药浓度-时间曲线。

图11：抗HER2-抗CD3 scFv双特异四价抗体在NOD/SCID小鼠异种移植人胃癌NCl-N87肿瘤模型上的抗肿瘤活性。

具体实施方式

本发明的一个目的在于提供一种双特异四价抗体，其包括一种靶向第一抗原HER2的蛋白功能区和一种靶向第二抗原CD3的蛋白功能区。靶向第一抗原HER2的蛋白功能区与靶向第二抗原CD3的蛋白功能区有效连接，保持其各自的空间结构并发挥其各自的生理活性。所述靶向第一抗原HER2的蛋白功能区与靶向第二抗原CD3的蛋白功能区可以在不影响其各自功能的情况下直接融合在一起，且靶向第二抗原CD3的蛋白功能区连接在靶向第一抗原HER2的蛋白功能区的C端，也可以在其间加入其它间隔序列，如连接片段。

本领域技术人员知晓，虽然本发明在限定所述双特异四价抗体时所用限定语为“包括”，但其并不意味着可以在所述双特异四价抗体中任意加入与其功能不相关的其他序列。在制备复杂组成的融合蛋白如所述双特异四价抗体时，为了保证融合蛋白各个组成成分的空间结构、生物活性，以及为了将所述各种组分适当的融合在一起，或为了增强所述融合蛋白 的抗水解能力，本领域技术人员在制备所述融合蛋白时，会根据需要在各个组分之间或所述融合蛋白的两端加入一个或多个额外的氨基酸残基，因此，如果用封闭式的表述来限定所述双特异四价抗体将不能真实地覆盖这些情形。

本发明所用的术语“双特异四价抗体”中的“双特异”是指同时特异性靶向两种不同的抗原，在本发明中所述两种不同的抗原分别是HER2和CD3，在某些实施方案中，所述HER2和CD3是指哺乳动物如灵长类动物的HER2和CD3，在某些实施方案中，所述HER2和CD3是指人HER2和CD3；“四价”是指所述抗体具有四个与所述两种不同的抗原的结合能力，在某些实施方案中，所述抗体分别具有二个与所述HER2的结合能力和二个与所述CD3的结合能力。

本发明所用的术语“靶向第一抗原HER2的蛋白功能区”是指与HER2特异性结合的蛋白质片段，如靶向HER2的免疫球蛋白或靶向HER2的天然配体，在某些实施方案中，所述靶向第一抗原HER2的蛋白功能区为靶向HER2的免疫球蛋白或其修饰物、功能等同物、功能片段或变体。在某些实施方案中，靶向第一抗原HER2的免疫球蛋白为IgG、IgA、IgD、IgE、IgM抗体或者它们的杂合体，在某些实施方案中，靶向第一抗原HER2的免疫球蛋白为IgG抗体。在某些实施方案中，所述免疫球蛋白为嵌合的、人源化的或全人的免疫球蛋白。在某些实施方案中，所述修饰物可以是化学修饰物，如酰基化、烷基化、PEG化产物，只要这些修饰物保留了靶向HER2的能力即可。在某些实施方案中，所述功能等同物是指能够实现所述免疫球蛋白靶向结合HER2能力的其他多肽片段。在某些实施方案中，所述功能片段是指保留了靶向HER2的能力的蛋白质片段，如单一结构域抗体、单链抗体、单链可变片段(scFv)、Fab片段或F(ab’)2片段。在某些实施方案中，所述变体是指通过在一个或多个(几个)位置的一个或多个改变，即取代、插入和/或缺失而从亲本蛋白衍生的多肽。

在某些实施方案中，本发明所用的术语“靶向第二抗原CD3的蛋白功能区”是指靶向CD3的免疫球蛋白或其修饰物、功能等同物、功能片段或变体。在某些实施方案中，靶向第二抗原CD3的蛋白功能区为靶向CD3的scFv或Fab。在某些实施方案中，所述scFv或Fab为嵌合的、人源化的或全人的scFv或Fab。在某些实施方案中，所述修饰物可以是化学修饰物，如酰基化、烷基化、PEG化产物，只要这些修饰物保留了靶向CD3的能力即可。在某些实施方案中，所述功能等同物是指能够实现所述免疫球蛋白靶向结合CD3能力的其他多肽片段。在某些实施方案中，所述功能片段是指保留了靶向CD3的能力的蛋白质片段，如单一结构域抗体、单链抗体、单链可变片段(scFv)、Fab片段或F(ab’)2片段。在某些实 施方案中，所述变体是指通过在一个或多个(几个)位置的一个或多个改变，即取代、插入和/或缺失而从亲本蛋白衍生的多肽。

在某些实施方案中，所述连接片段长度为5-30个氨基酸，在某些实施方案中，所述连接片段长度为15个氨基酸，在某些实施方案中，所述连接片段的序列为GGGGSGGGGSGGGGS。本发明所用的连接片段并无特殊限制，只要其起到间隔融合蛋白的两个组分，使各个组分能正确形成其各自的空间结构、发挥其生物活性即可。

在某些实施方案中，所述双特异四价抗体由抗HER2 IgG-连接片段-抗CD3 scFv组成，在某些实施方案中，所述双特异四价抗体由两条包含SEQ ID No：1的轻链和两条包含SEQ ID No：3的重链组成。在某些实施方案中，所述轻链和重链分别为经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸而由SEQ ID No：1和SEQ ID No：3衍生而来并高特异地靶向并杀死表达HER2的恶性细胞的序列，如1、2、3、4、5、6、8、9、10、15、20、30、40、50个氨基酸残基，或者是与SEQ ID No：1和No：3所示的序列具有至少约70％同一性并高特异地靶向并杀死表达HER2的恶性细胞的氨基酸序列。在某些实施方案中，所述轻链和重链分别为与SEQ ID No：1和No：3所示的序列具有至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％同一性并高特异地靶向并杀死表达HER2的恶性细胞的氨基酸序列。例如，所述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基可以进行保守氨基酸的替换，如一个或几个氨基酸残基，如1、2、3、4、5、6、8、9、10、15、20、30、40、50个氨基酸残基。氨基酸的保守氨基酸是本领域公知的。

本发明使用的术语“同一性”具有本领域通常已知的含义，本领域技术人员也熟知测定不同序列间同一性的规则、标准。本发明用不同程度同一性限定的序列还必须要同时具有高特异地靶向并杀死表达HER2的恶性细胞的活性。本领域技术人员公知如何利用该高特异地靶向并杀死表达HER2的恶性细胞的活性筛选变体序列的方法和手段。本领域技术人员可以在本申请公开内容的教导下容易地获得这样的变体序列。

本发明使用的术语“高特异地靶向并杀死表达HER2的恶性细胞”是指仅靶向并杀死表达HER2的恶性细胞，或者在靶向并杀死表达HER2的恶性细胞的情况下，虽然也可能靶向甚或杀死不表达HER2的其他细胞，但这种靶向甚或杀死不表达HER2的其他细胞并不会导致受试者产生严重的副作用。

在一个实施方案中，本发明涉及一种多核苷酸，其包含编码如上所述的双特异四价抗 体的核苷酸序列。

本领域技术人员知晓，虽然本发明在限定所述多核苷酸时所用限定语为“包括”，但其并不意味着可以在所述多核苷酸两端任意加入与其功能不相关的其他序列。本领域技术人员知晓，为了满足重组操作的要求，需要在所述多核苷酸的两端添加合适的限制性内切酶的酶切位点，或者额外增加启动密码子、终止密码子等，因此，如果用封闭式的表述来限定所述双特异四价抗体将不能真实地覆盖这些情形。

本领域技术人员公知，在不改变所编码的氨基酸的情况下，所述核苷酸序列中的一个或多个密码子可以进行等义替换，如一个或几个密码子，如1、2、3、4、5、6、8、9、10、15、20、30、40、50个密码子。密码子使用表是本领域公知的。

在一个实施方案中，本发明涉及一种重组载体，其包含有效连接其中的如上所述的多核苷酸。所述重组载体为重组表达载体，可以是原核表达载体也可以是真核表达载体，但优选真核表达载体，更优选用于哺乳动物真核表达的重组表达载体。

本发明所用的术语“有效连接”是指这样的连接方式，其中所述多核苷酸置于载体的适当位置，使得所述多核苷酸正确地、顺利地复制、转录或表达。

在一个实施方案中，本发明涉及一种宿主细胞，其转化或转染有如上所述的重组载体，所述宿主细胞包括哺乳动物细胞、细菌细胞、酵母菌细胞、昆虫细胞和植物细胞。

在一个优选的实施方案中，所述的宿主细胞包含CHO细胞、HEK293细胞、NSO细胞和SP 2/0细胞。

在一个实施方案中，本发明涉及一种生产所述双特异四价抗体的方法，其包括在适宜的多肽表达条件下培养上述宿主细胞，并从细胞培养基中分离、纯化表达的多肽。优选地，所述纯化后的多肽的纯度为大于50％，更优选地，大于60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％。

在一个实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，其包含如上所述的双特异四价抗体和一种药学上可接受的载体。所述双特异四价抗体可以是所述药物组合物的唯一活性成分，也可以是所述药物组合物活性成分之一，其他活性成分为可以与所述双特异四价抗体组合使用的其他治疗剂。

在一个优选的实施方案中，本发明的药物组合物包含单次给药的剂型、局部给药的剂型和全身给药剂型。

在一个实施方案中，本发明涉及用所述的双特异四价抗体预防或治疗由HER2表达而引起的疾病的方法，包含给予治疗有效剂量的如上所述的双特异四价抗体或药物组合物。在某些实施方案中，所述治疗的肿瘤选自乳腺癌、胃癌、头颈癌、直肠癌，在某些实施方案中，所述治疗的肿瘤选自乳腺癌。

本发明所用的术语“治疗有效剂量”是指在给药时，可以在受试者体内发挥药理作用的剂量。“治疗有效剂量”可以由本领域技术人员根据患者的情况如年龄、体重、疾病状态等容易地确定。

在一个实施方案中，本发明涉及如上所述的双特异四价抗体或药物组合物，其用于治疗肿瘤疾病。优选地，所述治疗的肿瘤选自乳腺癌、胃癌、头颈癌、直肠癌，在某些实施方案中，所述治疗的肿瘤选自乳腺癌。

在一个实施方案中，本发明涉及如上所述的双特异四价抗体在制备用于治疗肿瘤疾病的药物中的用途。优选地，所述治疗的肿瘤选自乳腺癌、胃癌、头颈癌、直肠癌，在某些实施方案中，所述治疗的肿瘤选自乳腺癌。

下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。

下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。本发明下述实施例中使用的各种抗体均来源于商业途径的标准抗体。

实施例

实施例1.抗HER2-抗CD3 scFv双特异四价抗体表达载体的构建

1、抗HER2-抗CD3 scFv双特异四价抗体的氨基酸序列和相应的核酸序列

抗HER2轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，根据哺乳动物细胞密码子偏好性优化的核苷酸编码序列如SEQ ID NO：2所示。

抗HER2重链-抗CD3 scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，根据哺乳动物细胞密码子偏好性优化的核苷酸编码序列如SEQ ID NO：4所示。其中，1-19位为信号肽序列，20-470位为抗HER 2的重链序列，471-485位为连接肽(G₄S)₃序列，486-728位为抗CD3 scFv序列。

最终的抗HER2-抗CD3 scFv双特异四价抗体的结构示意图如图1所示。

优化的上述核苷酸序列由南京金斯瑞生物科技有限公司合成并连接进入pUC57载体。

2、表达载体的制备

表达载体Y0GC在本公司的哺乳动物细胞表达载体X0GC(美国专利申请US20100120089)基础上改造获得。具体地，以X0GC质粒为模板，使用ATAACGCGTTGACATTGATTATTGACTAG(SEQ ID NO：5)和ATAAGATCTGGGTCTCCCTATAGTGAGT(SEQ ID NO：6)为引物扩增CMV启动子，使用ATAAGATCTTGTGCCTTCTAGTTGCCAGC(SEQ ID NO：7)和ATAACGCGTCTCAGAAGCCATAGAGCCCA(SEQ ID NO：8)为引物扩增BGH终止子。本申请中所有PCR反应均使用NEB公司的Phusion超保真DNA聚合酶(F-530L)。反应体系均为：H₂O 8.9μl，5×Phusion超保真DNA聚合酶buffer 4μl，1mM dNTP 4μl，上游引物1μl，下游引物1μl，Phusion超保真DNA聚合酶0.1μl，模板1μl。扩增CMV启动子和BGH终止子的反应条件为：94℃2分钟；94℃30秒，55℃45秒，72℃45秒，共35个循环；72℃5分钟。将扩增得到的序列经1.5％琼脂糖凝胶电泳后用DNA回收试剂盒(Promega，A9282，下同)回收相应片段。将基因片段用NEB公司的BglII(R0144L)酶切，酶切反应体系为：10×缓冲液32μl，BglII 0.5μl，胶回收获得的基因片段3μl，H₂O 14.5μl。酶切体系于37℃条件下反应3小时。将酶切产物用NEB公司的T4DNA连接酶(M0202V)连接(下同)，反应体系为：10×连接酶缓冲液2μl，连接酶0.5μl，胶回收获得的CMV启动子3μl，胶回收获得的BGH终止子3μl，H₂O 11.5μl。连接于室温反应12小时。获得一个CMV启动子-BGH终止子表达框，在中间掺入有BglII酶切位点。用NEB公司的MluI(R0198V)酶切CMV启动子-BGH终止子表达框和X0GC载体，酶切反应体系为：10×缓冲液32μl，MluI 0.5μl，基因片段或X0GC载体3μl，H₂O 14.5μl。酶切体系于37℃条件下反应3小时。将酶切产物连接，反应体系为：10×连接酶缓冲液2μl，连接酶0.5μl，CMV启动子-BGH终止子表达框5μl，X0GC载体1μl，H₂O 11.5μl。连接于室温反应12小时。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α(天根，CB104，下同)。获得两个表达框串联的Y0GC表达载体。Y0GC载体的两个表达框用于分别表达抗体的抗HER2轻链和抗HER2重链-抗CD3 scFv。

3、抗HER2-抗CD3 scFv双特异四价抗体表达载体的构建

抗HER2-抗CD3 scFv双特异四价抗体表达载体如图2所示。以带有抗HER2轻链编码序列的pUC57-抗HER2LC(南京金斯瑞生物科技有限公司合成抗HER2轻链基因，该基因包含在pUC57载体中，序列如SEQ ID NO：2所示)为模板，通过常规PCR扩增抗HER2 轻链的编码序列。所用上游引物带有HindIII酶切位点，序列为：CACAAGCTTGCCACCATGGGTTGGT CCTGCATTATCCT(SEQ ID NO：9)。下游引物带有EcoRI酶切位点，序列为：CCGGAATTCTCAGCATTCGCCACGATTGAAG(SEQ ID NO：10)。反应条件为：94℃2分钟；94℃30秒，55℃45秒，72℃1分钟，共35个循环；72℃5分钟。得到的序列经1％琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。将该序列与真核表达载体Y0GC用NEB公司的HindIII(R0104L)和EcoRI(R0101L)酶切，酶切反应体系为：10×EcoRI缓冲液2μl，HindIII 0.5μl，EcoRI 0.5μl，基因片段或Y0GC载体3μl，H₂O 14μl。酶切体系于37℃条件下反应3小时。将酶切产物连接，反应体系为：10×连接酶缓冲液2μl，连接酶0.5μl，基因片段5μl，Y0GC载体1μl，H₂O 11.5μl。连接于室温反应12小时。将连接产物转化大肠杆菌DH5α。PCR筛选阳性质粒Y0GC-抗HER2LC并进行DNA测序，验证重组质粒构建正确。

以带有抗HER2重链-抗CD3 scFv编码序列的pUC57-抗HER2HC-抗CD3 scFv(南京金斯瑞生物科技有限公司合成抗HER2重链-抗CD3 scFv基因，该基因包含在pUC57载体中，序列如SEQ ID NO：4所示)为模板，通过常规PCR扩增抗HER2重链-抗CD3 scFv的编码序列。所用上游引物带有BglII酶切位点，序列为：GAAGATCTGCCACCATGGGGTGGTCCTGTATCATC(SEQ ID NO：11)。下游引物带有BglII酶切位点，序列为：GAAGATCTTCACTTCAGTTCCAGTTTAGTC(SEQ ID NO：12)。反应条件为：94℃2分钟；94℃30秒，55℃45秒，72℃2分钟，共35个循环；72℃5分钟。

将扩增得到的序列经1.5％琼脂糖凝胶电泳后回收相应片段。将该序列与构建成功的带有抗HER2轻链的Y0GC-抗HER2 LC质粒用NEB公司的BglII(R0144L)酶切，酶切反应体系为：10×缓冲液32μl，BglII 0.5μl，基因片段或Y0GC-抗HER2 LC质粒3μl，H₂O14.5μl。酶切体系于37℃条件下反应3小时。将酶切产物连接，反应体系为：10×连接酶缓冲液2μl，连接酶0.5μl，抗HER2重链-抗CD3 scFv 5μl，Y0GC-抗HER2 LC质粒1μl，H₂O 11.5μl。连接于室温反应12小时。将连接产物转化大肠杆菌DH5α。PCR筛选阳性质粒Y0GC-抗HER2-抗CD3 scFv并进行酶切验证、DNA测序，验证重组质粒构建正确。

将阳性DH5α/Y0GC-抗HER2-抗CD3 scFv接种至1L LB/Amp液体培养基，LB/Amp液体培养基组成为1％蛋白胨(BD公司)、0.5％酵母提取物(BD公司)、1％NaCl(国药集团化学试剂有限公司)，于37℃、180rpm条件下振荡培养过夜。第二天按照天根DP117无内毒素质粒大提试剂盒操作说明提取质粒用于293T细胞的转染。

实施例2.重组抗HER2-抗CD3 scFv双特异四价抗体的表达

1、HEK293-T细胞培养

HEK293-T为贴壁培养细胞，细胞复苏之后于37℃、5％CO₂培养箱内每隔48小时传代一次(使用含10％胎牛血清(购自Gibco公司)的DMEM培养基(购自Corning公司))，传代2-3次后，细胞生长状态良好，活力(活细胞比率，也可以写成“活率”)达到95％以上便可接种十层细胞工厂(购自NUNC公司，产品号：140400)。

2、HEK293-T细胞接种细胞工厂

将HEK293-T细胞以18 X 10⁷个接种量接种于十层细胞工厂，用含10％胎牛血清(购自Gibco公司)的DMEM培养基(购自Corning公司)培养，细胞工厂反复颠倒混匀后置于37℃、5％CO₂的培养箱内培养48小时，细胞贴壁完全，密度达到80％，即可用于瞬时转染实验。

3、HEK293-T细胞瞬时转染

将所要转染的质粒(Y0GC-抗HER2-抗CD3 scFv)用0.22μm滤膜过滤后，吸取1330μg于66mL无血清DMEM培养基内，取2660μg过滤后的转染试剂PEI(购自Sigma公司)与66mL的DMEM培养基混合，之后将PEI与DMEM的混合物倒入稀释后的质粒中，于洁净工作台内静置15分钟。然后将质粒与PEI混合物加入到1.3L的无血清DMEM培养基内，充分混匀后缓慢加入细胞工厂中，之后将细胞工厂置于37℃、5％CO₂培养箱内培养。4小时后，于洁净工作台内加入266mL Cell Boost 5(购自Thermo Fisher公司)，颠倒混匀后于34℃、5％CO₂条件下培养3-4天。

4、ELISA方法检测目的蛋白的表达水平

在洁净工作台内收获细胞培养液，同时将混匀后的新鲜的1.3L DMEM培养基与266mL Cell boost 5加入到细胞工厂中，34℃、5％CO₂培养箱内继续培养3-4天。将之前收获的细胞培养液倒入洁净的离心杯内，7000rpm离心20分钟，留取上清液于-80℃冰箱备用。3-4天后重复相同操作，同时用ELISA方法检测每批目的蛋白的表达水平。各批次蛋白表达量为2～3mg/L。

实施例3.重组抗HER2-抗CD3 scFv双特异四价抗体的纯化

重组抗HER2-抗CD3 scFv双特异四价抗体的纯化流程如图3所示。

1、细胞表达发酵液的预处理

将收获的细胞培养上清液7000rpm离心20min去除沉淀。细胞发酵液上清液经0.2μm滤膜过滤后，10K膜包超滤浓缩并置换成20mM PB缓冲液加入150mM氯化钠，pH 7.4。在应用层析柱纯化之前以0.2μm滤膜过滤以去除沉淀物。此步骤操作在4℃下进行。

2、rProtein A亲和色谱纯化 

采用AKTA explorer 100型蛋白纯化系统(GE Healthcare)以及亲和色谱柱rProtein A Sepharose Fast Flow(16mm I.D.，15ml，GE Healthcare)于4℃下进行纯化。首先以流动相A即20mM PB缓冲液加入150mM氯化钠，pH7.4溶液平衡色谱柱，在基线稳定后将预处理后的细胞发酵液上清液进行上样，流速为5ml/min，并在上样后以流动相A进行冲洗，然后以不同缓冲液进行洗脱。首先以流动相B1冲洗5个柱体积；接着以流动相B2冲洗5个柱体积；然后以流动相B3洗脱5个柱体积，收集洗脱峰即为目的蛋白峰；最后以流动相B4冲洗5个柱体积。以上洗脱步骤流速都为5ml/min。流动相B1为在流动相A中添加0.5M精氨酸而成；流动相B2为20mM NaAc，pH4.5；流动相B3为100mM柠檬酸，pH3.0；流动相B4为100mM柠檬酸，pH 2.2。收集标示的洗脱峰并通过滴加1M NaAc将pH调整至5.0。色谱图如图4所示。

3、蛋白的离子交换色谱纯化

采用AKTA explorer 100型蛋白纯化系统(GE Healthcare)以及强阴离子交换色谱柱HiTrap Q Sepharose FF(5ml，GE Healthcare)于4℃下进行纯化。首先以流动相A即20mM NaAc(pH 5.0)溶液平衡色谱柱，在基线稳定后将上一步实验中收集并调整pH后的洗脱液进行上样，流速为5ml/min，收集流穿峰即为目的蛋白峰。上样完毕后应用100％流动相B进行等度洗脱，流速为5ml/min。流动相B为在流动相A中添加1M氯化钠而成。色谱图如图5所示。收集流穿峰，并用孔径为10K的超滤管浓缩，用于凝胶排阻层析色谱的纯化。

4、蛋白的凝胶排阻层析色谱纯化

采用AKTA explorer 100型蛋白纯化系统(GE Healthcare)以及凝胶排阻色谱填料 Superdex^TM 200(105ml，16/60,GE Healthcare)于4℃下进行纯化。上样体积小于色谱柱体积的1％，流动相为PBS，流速为1ml/min。色谱图如图6所示。收集标示组分，用10K的超滤管浓缩，在超净工作台用0.2μm滤膜无菌过滤，然后用紫外分光光度计(280nm)进行定量，并用SEC-HPLC进行纯度分析。结果表明该重组抗HER2-抗CD3 scFv双特异四价抗体的纯度为至少95％。

实施例4.抗HER2-抗CD3 scFv双特异四价抗体的稳定性研究

重复冻融实验操作如下：将1mg/mL所述抗HER2-抗CD3 scFv双特异四价抗体分装于3个小管中，每管不少于20μg(即每次分析用量)，置于-80℃冰箱3小时以上。取出后，常温融化。对相应小管依次进行第2次、第3次重复冻融。取20μg样品进行高效排阻液相色谱(SEC-HPLC)分离。

不同温度实验操作如下：将充分密封的样品(1mg/mL)放置于4℃(±2℃)、25℃(±2℃)和40℃恒温箱(BINDER KBF240)，在相应时间点(基线(第0天)、第3天、第7天、第14天)取20μg样品进行高效排阻液相色谱(SEC-HPLC)分离。

上述SEC-HPLC条件如下：(1)排阻色谱柱：TSKgel G3000SWxl(Tosoh Bioscience)，5μm，7.8mm×30cm；(2)流动相：5mM PBS，150mM NaCl，pH 6.7；(3)流速：0.6mL/min；(4)紫外检测波长：280nm；(5)采集时间：30min。所用仪器是Agilent 1200 Infinity色谱仪，利用Agilent ChemStation记录图谱并计算剩余单体的比例(图7)。

如图7所示，在循环冻融、4度以及25度的实验条件下，所述抗体不会发生明显的聚集；在40℃实验条件下，观察到了所述抗体的多聚体比例随时间延长而轻度增加(单体减少)，故认为所述抗HER2-抗CD3 scFv双特异四价抗体具备较好的热稳定性。

实施例5.FACS检测抗Her2-抗CD3 scFv双特异四价抗体的抗原结合活性

利用FACS检测双特异四价抗体中抗HER2与抗人CD3的抗原结合活性。取待检细胞100μL(约1X10⁶个细胞)，加入1μg双特异四价抗体样品，用含2％胎牛血清(Gibco,货号:10099)的DPBS(Gibco，货号：14190)检测缓冲液补齐使总体积为200μL，4℃孵育30分钟。800rpm离心5分钟，弃上清，用1mL检测缓冲液((PBS缓冲液+2％胎牛血清组成)洗细胞两次。将细胞重悬于100μL检测缓冲液中，加入1μg FITC标记羊抗人IgG二抗，用检测缓冲液补齐使总体积为200μL，4℃孵育30分钟。800rpm离心5分钟，弃上清，用1mL检测缓冲液洗细胞两次。将细胞重悬于1mL检测缓冲液中，使用流式细胞分析仪检测。

结果如图8显示，双特异四价抗体与HER2高表达细胞系SK-OV-3细胞有显著结合，这说明双特异四价抗体中抗HER2组分的功能完整。与CD3高表达的Jurkat细胞也有结合，这说明双特异四价抗体中抗CD3组分的功能也完整。

实施例6.抗HER2-抗CD3 scFv双特异四价抗体的肿瘤细胞生长抑制活性实验

人乳腺癌细胞株SK-BR-3，人胃癌细胞株NCl-N87，人结肠癌细胞株HCT-8从ATCC获得。所有细胞均在添加有10％的胎牛血清(Gibco,货号:10099)的RPMI-1640培养基(Gibco,货号:22400)中培养，置于37℃，5％CO2的细胞孵箱中，每周传代两次。

将靶细胞SK-BR-3或NCl-N87或HCT-8接种于96孔板(Costar,)，每孔50μL(约1X10⁴个细胞)，加入100μL用完全培养基进行10倍梯度稀释的抗HER2-抗CD3 scFv双特异四价抗体样品。根据不同的效靶比(E/T)加入适当的效应细胞(人PBMC细胞)，每孔50μL。将96孔板置于37℃、5％CO₂培养箱中孵育4天。吸出孔内液体，用200μL DPBS(Gibco，货号：14190)清洗细胞两次。加入100μL完全培养基和20μL MTS(CellTiter96 Aqueous One Solution，Promega,货号:G358B)，并于37℃避光孵育3小时。酶标仪在490nm处读数。对照组实验在96孔板中只加入靶细胞、效应细胞及培养基。杀伤率计算公式如下：

如图9所示，加入抗HER2-抗CD3 scFv双特异四价抗体后，效应细胞对靶细胞的杀伤率提高，而且随着该双特异四价抗体量的增加杀伤率也提高，说明该双特异四价抗体能够引导效应细胞对靶细胞的定向杀伤。在HER2高表达的SK-BR-3细胞中，该双特异四价抗体和HER2单抗赫赛汀(Herceptin)均可介导对靶细胞的定向杀伤，其中该双特异四价抗体杀伤效果远优于HER2单抗。而在HER2高表达的NCl-N87和HER2低表达的HCT-8细胞中，HER2单抗赫赛汀介导的效应细胞对靶细胞的杀伤效果不明显。与之相反，该双特异四价抗体可以很好的介导效应细胞对靶细胞的杀伤作用。

因此，不论在HER2低表达还是高表达时，本发明的抗HER2-抗CD3 scFv双特异四价抗体均能介导效应细胞对靶细胞的良好杀伤效果，从而在肿瘤治疗中起到了积极作用。

同时，有文献表明，应用四倍体杂交瘤生产的卡妥索单抗(Catumaxomab)对肿瘤生长抑制的最低浓度为纳摩尔(nM)数量级(P Ruf等，British Journal of Cancer,(2007)97,315-321)，而本发明的双功能抗体对肿瘤生长抑制的最低浓度为10pM，这说明本发明能够更加有效的抑制肿瘤生长。

实施例7.抗HER2-抗CD3 scFv双特异四价抗体在小鼠体内的药代动力学研究

本实施例检测了抗HER2-抗CD3 scFv双特异四价抗体在小鼠体内的药代动力学情况。

实验材料选用雌性BALB/c小鼠，8周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。小鼠适应环境一周后，给予抗HER2-抗CD3 scFv双特异四价抗体，剂量为7.5nmol/kg，静脉注射，单次给药。在0点，给药后5分钟、15分钟、30分钟、1小时、3小时、6小时、10小时、24小时、48小时、72小时、96小时、120小时、168小时、216小时、288小时眼眶采血(每只小鼠的采血点均为2次)，不予抗凝，室温放置血样30分钟，待凝血后，3000rpm离心5分钟，得到的血清样品冷冻于-80℃保存，待测。

ELISA测定血清中抗HER2-抗CD3 scFv双特异四价抗体的浓度。简要的说，用pH＝9.6的碳酸盐缓冲溶液包被人重组HER2蛋白(Sino Biological,货号:10004-H08H)于高吸附酶标板上，PBST(Sigma,货号:P-3563)洗涤。为了防止非特异性结合，用含5％脱脂奶粉的PBST封闭该板，PBST洗涤。然后加入用含10％混合小鼠血清、1％BSA的PBST稀释的待测血清样品孵育，25℃，1小时，PBST洗涤该板。加入稀释于含5％脱脂奶粉的PBST中的辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体(Abcam,货号:Ab7153)，25℃，1小时，PBST洗涤该板。最后使用比色底物TMB(BD OptEIA,货号:555214)进行显色，室温显色10分钟。加入1M H2SO4，终止显色。在酶标仪上读取450nm处的吸光度。

结果如图10所示，7.5nmol/kg剂量下抗HER2-抗CD3 scFv双特异四价抗体的半衰期T1/2为95.81小时；药时曲线下面积AUC为13803.82nM.hr；达峰时间Tmax为5分钟；达峰浓度Cmax为170.47nM；表观分布容积Vd为0.08L/Kg；清除率CL为0.0005L/hr/kg；平均驻留时间MRT为130.43小时。

实施例8.抗HER2-抗CD3 scFv双特异四价抗体的体内抗肿瘤活性研究

本实施例初步检测了抗HER2-抗CD3 scFv双特异四价抗体在NOD/SCID小鼠异种移植人胃癌NCl-N87肿瘤模型上的抗肿瘤活性。

实验材料选用雌性NOD/SCID小鼠，6-8周龄，购自北京华阜康生物科技股份有限公司。小鼠适应环境一周后，每只小鼠于右肩背部皮下接种5 x 10⁶个NCl-N87人胃癌细胞。待肿瘤体积长至约150mm³时，按5只小鼠每组进行随机分组，分别设定为阴性对照组和给药组。阴性对照组和给药组均一周静脉注射一次人PBMC细胞，每次每只小鼠注射5 x 10⁶个，持续注射3周。阴性对照组和给药组分别给予载体(PBS)和抗HER2-抗CD3 scFv双特 异四价抗体治疗，每周给药2次，连续给药3周，给药方式为静脉注射，抗HER2-抗CD3scFv双特异四价抗体的剂量为5mg/kg。自给药之日起，每周测量2次肿瘤体积，测量其长径a，短径b，肿瘤体积计算公式为：肿瘤体积(mm³)＝(a x b²)/2，肿瘤体积变化计算公式为：肿瘤体积变化(％)＝当天的肿瘤体积/给药之日的肿瘤体积x 100。肿瘤体积测量持续时间为4周，即停药后再测量一周。

结果如图11所示，抗HER2-抗CD3 scFv双特异四价抗体显示出了强的抗肿瘤活性，显著抑制了NOD/SCID小鼠体内的人胃癌NCl-N87移植肿瘤的生长。