抗CD3×抗Pgp(anti-CD3/anti-Pgp)diabody治疗P-糖蛋白(P-glycoprotein，Pgp)高表达的多药耐药(Multidrug resistance，MDR)肿瘤具有良好应用前景，其杀伤肿瘤的作用主要由外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte，PBL)中活化的细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)来完成。因此，采用促进T细胞活化的策略可进一步增强PBL的抗肿瘤效果。本文从两方面进行了相关的研究。 1.利用可溶型4-1BBL促进PBL活化4-1BB/4-1BBL作为一对重要的共刺激信号分子，通过促进活化的细胞毒淋巴细胞增殖、减少凋亡、延长存活时间、甚至增加细胞内颗粒酶、穿孔素的蓄积等机制调节T细胞活化，有助于机体达到最佳状态的抗肿瘤细胞免疫反应。 本文第一部分用原核表达的可溶型人4-1BBL胞膜外区蛋白(extracellular domain of human 4-1BBL，ex4-1BBL)来调节PBL的抗肿瘤反应。用免疫组化、PI染色和放射免疫法确认4-1BBL胞膜外区蛋白具有与4-1BB特异结合、减少Jurkat细胞凋亡和促进其释放IL-2活性后，进一步研究发现该蛋白能够促进PBL增殖(191.66％ vs 146.67％，P<0.05)和分泌I1-2(54.26±5.92 pg/ml vs 22.57±6.53 pg/ml，P<0.05)，使PBL释放的乳酸脱氢酶(LDH)减少，改善其存活状态。在体外细胞毒杀伤实验中，4-1BBL胞膜外区蛋白联合anti-CD3/anti-CD20或anti-CD3/anti-Pgp微型双功能抗体，在不同的效靶比均能增强PBL对靶向细胞(Raji或K562/A02)的杀伤作用。在体内联合应用PBL、4-1BBL胞膜外区蛋白和anti-CD3/anti-Pgp diabody治疗裸鼠K562/A02移植瘤，能显著控制肿瘤生长并清除肿瘤，观察至100天未见肿瘤复发。 因此，4-1BBL胞膜外区蛋白作为一种免疫调节蛋白，能够促进T细胞的活化，进而增强基于PBL的抗肿瘤生物治疗的效果。4-1BBL胞膜外区蛋白可能成为一种新型的、应用广泛的辅助抗肿瘤药物。 2.构建四价形式的anti-CD3/anti-Pgp双功能抗体双功能抗体也称为双特异抗体(bispecific antibody，BsAb)，其四价结构能够增加分子量和结合域，延长半衰期和增加结合力，间接延长抗体的作用时间。同时，增加对T细胞CD3分子的结合价能进一步促进其活化，也有利于PBL抗肿瘤作用。因此，为了发挥diabody的靶向优势并克服其不足，本文第二部分构建了四价形式的抗体并在原核系统进行表达。为了增加可溶型蛋白的表达量，先后采用优化表达温度和时间、改变培养基组成和更换载体等方法。优化表达条件后使产量得到提高，可供进一步研究蛋白功能。
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