公开/公告号CN104694629A
专利类型发明专利
公开/公告日2015-06-10
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申请/专利权人 江苏佰龄全基因生物医学技术有限公司;
申请/专利号CN201510054294.0
申请日2015-02-02
分类号C12Q1/68(20060101);
代理机构31233 上海泰能知识产权代理事务所;
代理人黄志达
地址 225300 江苏省泰州市药城大道G01幢厂房东侧一层
入库时间 2023-12-18 09:23:37
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2018-05-18
授权
授权
2015-07-08
实质审查的生效 IPC(主分类):C12Q1/68 申请日:20150202
实质审查的生效
2015-06-10
公开
公开
技术领域
本发明属生物技术领域,特别是涉及一种用于检测遗传性耳聋易感基因突变的多重连接探针扩增检测试剂盒。
背景技术
聋病是临床上最常见的遗传性疾病之一,也是影响人类健康的常见疾病。据统计,中国听力语言残疾者有2780万人,占全国现有残疾人总数的34%,其中单纯听力残疾的有2004万人,听力残疾现残率约为2.11%;每1000个新生儿中就有1~3例聋儿,7岁以下聋儿约有74万人,并以每年2~3万的速度增长。约60%的新生聋儿是由遗传因素导致的。另外在大量迟发性听力下降患者中,许多患者因自身基因缺陷而致病,或因基因缺陷和多态性对特定环境因素易感而致病遗传性耳聋,还有40%为环境因素所致。减少耳聋的发生重在早期的预防与干预,对于环境因素导致的耳聋,可以通过预防感染、加强孕期围产期保健、避免应用耳毒性药物等措施有效地预防;但对于遗传性耳聋的预防,关键是明确耳聋病因。
遗传性耳聋绝大多数为异质性较强的单基因遗传病,其中30%的遗传性耳聋病例属于综合征性耳聋,其余的遗传性耳聋绝大多数非NSHL。迄今为止,与NSHL相关的40个常染色体隐性基因、25个常染色体显性基因、3个X连锁基因已被克隆。大规模耳聋分子流行病学研究表明,我国人群中最常见的致病基因包括间隙连接蛋白β2GJB2(Gap Junction protein beta 2)、间隙连接蛋白β3GJB3(Gap Junction protein beta 3)、SLC26A4(PDS)、线粒体DNA(Mitochondrion DNA)12S rRNA。
GJB2基因编码的Cx26属于缝隙连接蛋白基因家族,与相邻细胞的缝隙连接蛋白组成一个完整的缝隙连接通道,这些通道在信息传导和物质交换中起重要作用,是完成电解质、第二信使和代谢产物的细胞间转换的重要通道。当毛细胞受到外界刺激后,钾离子经内耳毛细胞循环回流进入耳蜗内淋巴液,缝隙连接蛋白通道在此过程中具有调控作用。Cx26在人类的耳蜗毛细胞中高表达,因此GJB2基因突变与耳聋密切相关。大部分GJB2基因编码区的突变导致蛋白质翻译过程中的移码突变,产生无功能的蛋白质,影响了缝隙连接蛋白的结构,从而影响通道的正常开闭。
GJB3基因突变可导致显性或隐性遗传性非综合征性耳聋。初步的功能学研究结果揭示了GJB2基因编码的Cx26与GJB3基因编码的Cx31的相互作用及其双基因的解剖、生理和功能学基础。GJB3基因与GJB2基因虽然不在同一条染色体上,但都编码连接蛋白,在内耳离子平衡中发挥作用,按照双等位基因致聋的模式,有可能GJB2基因与GJB3基因共同导致耳聋患者的发病。
SLC26A4基因,或称PDS基因,所制造的蛋白质为pendrin,是一个氯及碘离子的运输蛋白。一般以为其在内耳中主要是扮演调节离子均衡与内淋巴液的作用,若发生突变,就会导致内耳发育畸形及听障。SLC26A4基因属于隐性遗传,双等位基因病理性突变会导致的遗传性耳聋。此基因突变与大前庭水管综合征和耳蜗畸形有非常密切的关系。
线粒体DNA突变易导致药物性耳聋,发病过程中,部分患者对氨基糖甙类抗生素有易感性,即应用正常剂量或微量的药物就可以造成患者听力损失,这种易感性通常是母系遗传。毛细胞线粒体损伤导致其产能功能丧失,是听力损害的细胞学基础。mtDNA是人体细胞质内的闭环DNA,全长为16569bp,编码呼吸链中的13个关键酶亚单位,2个rRNA,22个tRNA。由于mtDNA无组蛋白保护,是裸露的,所以其突变较核基因高10-20倍。另外mtDNA不含内含子,部分区域还有基因重叠现象。因此mtDNA的任何突变都会累及到基因组中的某一个重要功能区。
上述致病基因包括多个突变位点,GJB2:35delG、299delAT;GJB3:250G>A、538C>T、547G>A;SLC26A4(PDS):707T>C、1174A>T、1226G>A、1229C>T、1975G>C、2027T>A、2168A>G、IVS7-2A>G、IVS15+5G>A;mtDNA 12S rRNA:1494C>T、1555A>G。以上16个基因突变位点属于中国人群突变热点,对其进行检测,并结合临床问诊和查体,可以诊断我国80%以上的遗传性耳聋。
当前临床上对遗传性耳聋致病基因诊断的主要方法包括限制性长度多态性分析(RFLP)、斑点杂交(ASO)、基因扫描、变性高效液相色谱分析(DHPLC)、直接测序、基因芯片方法等。但这些技术或耗时费力,或成本较高,或难以同时检测多个基因的不同突变位点。为解决临床快速检测和大规模人群筛查的问题,需要一种高效、高通量、快速、方便的方法检测基因突变。多重连接探针扩增技术具有高效、可平行检测的特点,充分满足这一需求。与芯片技术相比,多重连接探针扩增技术具有检测灵敏性高、稳定性好、经济高效、耗时短和通量高等优点,其应用于临床耳聋基因筛查的优越性明显,如用于孕前预防、孕期干预和产后筛查等。
综上所述,目前现有技术中未见采用多重连接探针扩增技术诊断技术在GJB2、GJB3、 SLC26A4和线粒体基因上同时挑选一些多态性突变位点构成复合扩增检测系统的报道,实践中亟需一种操作简便和实用性强,且快速、高效、经济、直观的检测试剂盒。
发明内容
所要解决的技术问题
本发明所要解决的技术问题是提供一种基于多重连接探针扩增技术,检测遗传性耳聋易感基因突变情况的检测试剂盒,以克服现有试剂盒仅针对单个或少数部分突变位点进行检测且操作复杂实用性差的缺陷。
技术方案
本发明的技术方案之一是提供一种利用多重连接探针扩增检测遗传性耳聋易感基因突变位点的试剂盒,包括检测探针和通用引物;所述检测探针为每一条短探针和一条长探针对应一个突变位点;所述突变点为:
GJB2:299-300delAT、35delG;
GJB3:250G>A、538C>T、547G>A;
12SrRNA:1494C>T、1555A>G;
SLC26A4:707T>C、IVS7-2A>G、1174A>T、1226G>A、1229C>T、IVS15+5G>A、1975G>C、2027T>A、2168A>G。
上述试剂盒的优选技术方案之一为,所述突变位点所对应的短探针依次分别为:
GJB2:SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2;
GJB3:SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5;
12SrRNA:SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7;
SLC26A4:SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16。
上述试剂盒的优选技术方案之二为,所述突变位点所对应的长探针5’端的探针序列依次分别为:
GJB2:SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18;
GJB3:SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21;
12SrRNA:SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23;
SLC26A4:SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32。
上述试剂盒的优选技术方案之三为,所述的长探针长度范围为30-600bp,同一次多重连接探针扩增反应中,各条长探针的长度相差在3-100bp范围内。
上述试剂盒的优选技术方案之四为,所述的短探针从5’端到3’端依次由通用上游引物序列和探针序列两部分组成;所述的长探针从5’端到3’端依次为探针序列、非人类基因组序列和通用下游引物反向互补序列;所述通用引物为非人类基因组序列SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:34。
上述试剂盒的优选技术方案之五为,所述的短探针由人工合成。
上述试剂盒的优选技术方案之六为,所述的长探针由人工合成或PCR方法制备。
上述试剂盒的优选技术方案之七为,所述试剂盒还包括阳性DNA模板、DNA杂交液、DNA连接酶、连接缓冲溶液、和PCR反应试剂中的一种或多种。
上述试剂盒的优选技术方案之八为,所述的DNA杂交液是与检测探针配合的、和提取的基因组DNA或者阳性DNA模板一起进行杂交反应的溶液;所述的连接缓冲溶液是与DNA连接酶配合进行连接反应的溶液;PCR反应试剂是以所述的连接反应灭活连接酶后的产物为模板进行多重PCR扩增反应的试剂组合。
上述试剂盒的优选技术方案之九为,所述的PCR反应试剂包括DNA聚合酶、PCR反应缓冲溶液、dNTPs、和镁离子中的一种或多种。
本发明的技术方案之二是提供上述多重连接探针扩增检测试剂盒在非诊断非治疗领域的应用。
所述的检测探针中,短探针序列及长探针5’端的探针序列如下表:
表1探针序列表
所述的通用引物序列如下表:
表2通用引物序列表
所述的连接酶是指具有将DNA链3’-OH末端和另一DNA链的5’-P末端,使二者生成磷酸二酯键,从而把两段相邻的DNA链连成完整的链的作用的酶。优选地,所述的连接酶为T4连接酶、T7连接酶、热稳定的DNA连接酶、或Taq酶、或者其组合。
所述的杂交液是指对溶液pH具有缓冲作用并促进DNA杂交的缓冲液。优选地,所述的缓冲液为PBS缓冲液。
所述的PCR反应试剂可以优选地包括DNA聚合酶、PCR反应缓冲溶液、dNTPs、和MgCl2。
所述的DNA聚合酶是指可以使目标碱基序列进行PCR扩增反应的酶。优选地,所述的DNA聚合酶为Tub酶、Tth酶、Taq酶、Pfu酶、Pfx酶、Tfl酶、Tsp酶、Tli酶、或者其组合。
本发明所述的遗传性耳聋致病基因的多重连接探针扩增检测试剂盒,可以优选地使用如下方法步骤实现检测目的:
(1)从生物材料中提取基因组DNA,或合成的阳性DNA模板,作为检测样品;
(2)在样品中加入检测探针和杂交液,进行杂交反应;
(3)在杂交反应后的溶液中加入连接缓冲液和连接酶,进行连接反应,反应结束后灭活连接酶,优选地,在65℃灭活10min;
(4)以连接反应灭活后的产物为模板进行多重PCR扩增反应;
(5)对反应后的产物进行琼脂糖凝胶电泳或SDS-PAGE凝胶电泳或毛细管电泳分析。
上述方法步骤(1)中,所述的生物材料为,比如,含基因组DNA的血液、唾液、毛发、牙齿、脱落细胞、精斑或骨骼。
所述的阳性DNA模板为含有突变位点的DNA,可用于阳性验证实验;来源上可以通过人工合成制备,也可以通过序列克隆制备。
本发明的试剂盒工作原理如下:以待检的DNA样品为模板,在杂交缓冲体系中,加入检测探针和杂交液。当DNA模板中含有与检测探针对应的1个或几个突变点时,该突变点与对应的探针结合,所得结果为阳性;当DNA模板为正常基因即不含有突变点时,探针不与DNA模板中的检测位点结合,所得结果为阴性。杂交反应结束后,加入连接酶将结合的长短探针连接,然后以连接产物为模板进行多重聚合酶链式反应,用琼脂糖凝胶电泳或毛细管检测扩增产物。因为长探针长度不同,每对检测探针对应的阳性结果扩增出的目的条带长短不同,根据电泳检测结果中目的条带的有无和片段大小从而可以确定是否含有对应的突变点,扩增产物长度见表3。
表3
[0060]
有益效果
本试剂盒基于多重连接探针扩增技术,用于检测遗传性耳聋易感基因突变情况,灵敏度高,结果准确,能一次性完成多个关键遗传性耳聋基因突变诊断的高通量筛查,具有快速、经济、高效和高准确率的优势。
附图说明
图1为多重连接探针扩增实验原理图,其中,1为探针与靶基因序列杂交,2为杂交探针连接,3为PCR扩增连接探针获得长度不一的产物。
图2为阴性样本检测凝胶电泳图。左侧泳道为DNA分子量标记,从下到上为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp,右侧泳道为阴性样本。
图3-12为第1-10组盲检凝胶电泳图。图3,5,6,8-12的左侧泳道为DNA分子量标记,从下到上为100bp、250bp、500bp、750bp、1000bp、2000bp,右侧泳道为阳性结果;图4和图7左右反之。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1:阴性样本检测
下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,如:分子克隆操作手册,或按照制造厂商所建议的条件。所有无机化学试剂和有机溶剂购自国药试剂有限公司,血液DNA提取试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司,T4DNALigase-E购自纽英伦生物技术有限公司、TransStart TopTaq热启动酶购自北京全式金生物技术有限公司,引物和探针均由上海捷瑞公司合成。Eppendorf梯度式PCR扩增仪购自德国Eppendorf公司。(1)DNA提取:在本人同意或其监护人知情条件下,采集其外周血。采用市售全式金血液DNA提取试剂盒提取,OD230/260大于2.0,OD280/260大于1.8,并标定其浓度为100ng/μl。该样本临床诊断确证为正常人阴性样本。
(2)杂交反应:在200μl PCR管中加入下列组分后,混匀,在65℃反应16小时;
(3)连接反应:在杂交反应后的溶液中加入下列试剂,混合均匀后,在室温下放置30min进行连接反应,反应结束后在65℃灭活10min;
(4)PCR反应:在一个新的PCR管中加入下列试剂;
[0075]
PCR反应条件为:
(5)电泳检测:采用3%琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物,电泳结果用凝胶成像仪拍照,检测结果如图1所示。当样本为阴性时,电泳检测结果未见扩增条带,与预期结果相符。
实施例2:用阳性模板进行盲检
(1)DNA提取:以含有检测基因突变点的人工合成阳性DNA为检测样品。
(2)杂交反应:根据扩增条带由小到大,将基因突变点标号为1-16,采用随机软件抽取10组号码进行盲检。
表3随机抽取数据
(3)根据抽取号码,在杂交反应体系中加入与抽取号码对应的含有单个突变点的阳性DNA样品。在200μl PCR管中加入下列组分后,混匀,在65℃反应16h;
(4)连接反应:在杂交反应后的溶液中加入下列试剂,混合均匀后,在室温下放置30min进行连接反应,反应结束后在65℃灭活10min;
(5)PCR反应:在一个新的PCR管中加入下列试剂;
PCR反应条件为:
(6)电泳检测:采用3%琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物,电泳结果用凝胶成像仪拍照, 检测结果如图2到图11所示。图2为第1组盲检结果,可见466、547bp的扩增目标条带;图3为第2组盲检结果,可见173、311、466bp的扩增目标条带;图4为第3组盲检结果,可见173、311、394bp的扩增目标条带;图5为第4组盲检结果,可见381、430bp的扩增目标条带;图6为5组盲检结果,可见185、256、381、430bp的扩增目标条带;图7为6组盲检结果,可见311、486bp的扩增目标条带;图8为7组盲检结果,可见185、311、466、547bp的扩增目标条带;图9为8组盲检结果,可见173、394、430bp的扩增目标条带;图10为9组盲检结果,可见173、278、381、460bp的扩增目标条带;图11为10组盲检结果,可见311、381、384、404、430、466bp的扩增目标条带。
(7)结论:以上电泳检测结果,目标条带显著清晰,大小、条数均与预期结果相符。
机译: 用于特异性地检测一种或多种hiv-1基因或蛋白质中一种或多种单核苷酸突变的存在或不存在的方法,用于检测突变的存在或不存在的方法,选择性寡核苷酸引物,寡核苷酸,用于检测突变的试剂盒,寡核苷酸掺合用于选择性突变检测并同时检测一种或多种hiv-1蛋白中的两个或多个突变
机译: 分离的多核苷酸,表达盒,宿主细胞,分离的多肽,已被改变以表达耐碱突变体多肽的非人类转基因动物,与耐碱突变体多肽特异性结合的抗体,突变检测试剂盒生物样品,以及用于评估生物样品中是否存在对烷基抑制剂的抗性突变以诊断对至少一种碱性抑制剂有抗药性或可能发展出抗药性的癌症的方法。小分子激酶,用于评估生物学样品中是否具有抑制碱性磷酸酶抑制剂的突变,以诊断对患者具有抗药性或可能对pf-02341066产生抗药性的癌症,从而特异性降低抗癌突变体的表达以治疗癌症与激活抗至少一种小分子烷基激酶抑制剂的异常环路能力有关,该抑制剂治疗对pf-02341066有抵抗力的异常癌症
机译: 修饰的多聚核苷酸绝缘带,宿主细胞,分离的转基因非人类动物多肽,经过修饰以表达对ALK具有抗性的多肽突变体,与对ALK具有抗性的多肽突变体特异性结合的抗体,试剂盒p用于检测生物样品中对ALK抑制剂具有抗性的突变,以及用于评估生物样品为对ALK抑制剂具有抗性的突变的方法,用于诊断对至少一种对ALK抑制剂具有抗性或可能发展出抗性的癌症激酶小分子ALK,以评估Anto对ALK抑制剂具有抗性的突变的生物样品。用于诊断对至少一种激酶小分子ALK抑制剂具有抗药性或可能产生抗性的癌症,以评估该生物样品作为对ALK抑制剂有抗性的突变,即对狄诺司他抗性或可能对PF产生抗药性的癌症-02341066