一种块体大孔材料固定化漆酶的制备方法

摘要

本发明涉及一种块体大孔材料固定化漆酶的制备方法，属于固定化酶制备技术领域。该固定化漆酶是以表面环氧基功能化的块体SiO2大孔材料为载体，将漆酶通过共价结合法固定在该载体上。其制备方法包括两个步骤：载体的制备和漆酶的固定。载体的制备：以γ-(2，3环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)为硅烷偶联剂，在溶剂热反应条件下通过GPTMS在SiO2大孔材料孔道内表面接枝反应，制备出可与漆酶共价结合的环氧基功能化载体。漆酶的固定：将载体浸入漆酶溶液，在室温下振荡反应，经洗涤、干燥，得固定化漆酶成品。本发明提供了一种新型固定化漆酶，具有制备工艺简单，成本低廉，固定化漆酶活力高等特点。

说明书

技术领域

本发明属于固定化酶制备技术领域，具体涉及一种块体SiO₂基大孔材料固定化漆酶的制备方法。

背景技术

漆酶是一种含铜多酚氧化酶，属于铜蓝氧化酶蛋白，广泛存在于自然界中，按其主要来源可以分为漆树漆酶和真菌漆酶两大类。漆酶具有宽泛的底物专一性和较好的稳定性，它在水体中有机污染物的控制、生物传感器构建、生物制浆、食品加工以及有机合成等方面有重要应用价值。因此，漆酶一直是生物学、化学和环境科学等领域十分活跃的研究热点，引起了国内外研究人员的普遍关注。

漆酶能催化氧化多种难降解有机污染物，包括多环芳烃、多氯联苯及其衍生物、除草剂、杀虫剂等。漆酶所具有的优良特性为水体中有机污染物的治理和修复提供了一种有效的途径。但游离的漆酶因在使用过程中易随环境的变化变性失活和不易循环利用等使其应用受到限制。对漆酶进行固定化是实现其重复利用、改善其稳定性的有效方法。固定化漆酶是指将水溶性漆酶以物理或化学的方法固定在有机或无机载体上，形成不溶于水的具有酶活性的衍生物，在催化反应中，它以固相状态作用于底物，反应完成后，容易与水溶性反应物分离，可反复使用。固定化酶不但仍具有酶的高度专一性和高催化效率的特点，且比水溶性酶稳定，可较长期使用，具有较高的经济效益。

漆酶固定化的方法主要有物理方法和化学方法两种。物理方法主要有吸附法、包埋法和离子交换法，化学方法主要有共价结合法和交联结合法。近年来国际上对漆酶的固定化进行了较为广泛的研究，使用的载体包括壳聚糖、亲水性微滤膜、SiO₂纳米颗粒、介孔SiO₂和介孔碳等多种材料。但是现有的固定化漆酶普遍存在着生产成本高、制备工艺复杂、分离效果差等缺点。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种以大尺寸块体SiO₂基大孔材料为载体的固定化漆酶方法。

本发明所提供的固定化漆酶的制备方法是，以我们前期制备的薄板状(长10cm、宽3cm、厚0.3cm)SiO₂大孔材料(Ruifeng Zhang，Nengbing Long，Lele Zhang，Thin Solid Films，517(2009)，6677-6680)为原料，将其切割成长、宽、高为0.2～0.4cm的块体；利用该大孔材料比表面积高、孔隙率大的特点，采用溶剂热方法将γ-(2，3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)接枝在SiO₂大孔材料表面；以环氧基功能化的大孔材料为载体，将漆酶通过共价键作用固定在该载体上。具体制备方法如下：

(1)载体的制备：采用溶剂热方法，在压力反应釜聚四氟乙烯内衬中按体积比1：1～10加入γ-(2，3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷(GPTMS)和有机溶剂，称取适量干燥的块体SiO₂大孔材料浸入上述GPTMS的溶液中，在60～150℃下反应6～24小时，自然冷却后，滤出大孔材料，用相应的有机溶剂冲洗2～3次、再用去离子水反复冲洗，干燥后即得固定化酶所用的载体；

(2)漆酶的固定：将步骤(1)中得到的载体浸入用缓冲溶液配置的漆酶溶液中，在5～30℃下振荡反应3～5小时，滤出、用缓冲液洗涤至溶液中检测不到蛋白，然后真空干燥即得固定化漆酶成品。

步骤(1)中所述GPTMS溶液所用的溶剂为甲苯、正己烷、环己烷或正庚烷中的一种。步骤(2)中所述的漆酶溶液的pH值为3.0～7.0；缓冲溶液可以是醋酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐中的一种或两种。

本发明与现有技术相比，具有如下优点：固定化漆酶制备工艺简单，成本低廉；本发明提供的固定化方法，漆酶活力回收率高；本发明使用大尺寸的块体材料固定化漆酶，便于从反应体系中分离出来、重复使用。

具体实施方式

下面的实施例是对本发明的进一步说明，本发明的范围不受实施例的限制。.

实施例1：

(1)以环己烷为溶剂，在压力反应釜聚四氟乙烯内衬中配制体积百分比为10％的GPTMS溶液。称取1.0g块状SiO₂大孔材料于80℃下干燥2小时，冷却后，浸入GPTMS溶液，密封压力反应釜，在80℃下反应24小时，自然冷却后，用8～10目的筛网滤出，先用环己烷冲洗2～3次，再用去离子水反复冲洗，干燥后得到环氧基功能化SiO₂大孔材料EMS。

(2)称取0.1g EMS，浸入10ml用pH=4.5缓冲溶液配置的漆酶溶液中，在20℃、转速为50r.min^-1的摇床中振荡5小时、用8～10目的筛网滤出，用缓冲液洗涤至上清液中检测不到蛋白，真空干燥后即得固定化漆酶。

实施例2：

(1)以环己烷为溶剂，在压力反应釜聚四氟乙烯内衬中配制体积百分比为20％的GPTMS溶液。称取1.0g块状SiO₂大孔材料于80℃下干燥2小时，冷却后，浸入GPTMS溶液，密封压力反应釜，在120℃下反应24小时，自然冷却后，用8～10目的筛网滤出，先用环己烷冲洗2～3次，再用去离子水反复冲洗，干燥后得到环氧基功能化SiO₂大孔材料EMS。

(2)称取0.1g EMS，浸入10ml用pH=4.5缓冲溶液配置的浓度为25mg.ml^-1的工业级漆酶(诺维信DeniLite IIS)溶液中，在30℃、转速为50r.min^-1的摇床中振荡4小时、滤出，用缓冲液洗涤至上清液中检测不到蛋白，得固定化漆酶。其酶活为112U.g^-1(定义一分钟使1μmol的ABTS氧化所需的酶量为一个酶活单位U)。