具有ACE抑制活性的多肽及其在降血压药物中的应用

摘要

本发明涉及一种具有ACE抑制活性的多肽化合物AELDIVLALF，其氨基酸序列分别为Ala-Glu-Leu-Asp-IIe-Val-Leu-Ala-Leu-Phe。多肽AELDIVLALF具有ACE抑制活性及降血压活性，作为高血压、心脏病和心血管病的保健品和药物先导化合物具有良好的应用前景。

说明书

技术领域

本发明涉及多肽AELDIVLALF在制备抑制血管紧张素转换酶（ACE）及降血压中的应用。

背景技术

高血压是一种常见的心血管疾病，发病率高、是引发心、脑、肾和血管等各种并发症和 导致中风、促进动脉粥样硬化、冠心病的一个重要危险因子。我国高血压患者已超过1.6亿 人口，治疗和预防高血压是当前社会十分重要的课题。肽是一类重要的降血压药物，肽降血 压的作用靶点是抑制血管紧张素转化酶（angiotensin-converting enzyme,ACE）的活性（文 献1：Vanessa Vermeirssen，John Van Camp，Willy Verstraete，British Journal of Nutrition 2004，92：357-366）。血管紧张素转化酶可将不具活性的十肽血管紧张素I转化为具有强 烈收缩血管作用的八肽血管紧张素II，从而使血压升高，因此抑制ACE活性可有效控制高 血压。多肽是一类重要的ACE抑制剂，天然蛋白质的酶解肽是ACE抑制剂肽的主要来源（文 献2：Lieselot Vercruysse,John Van Camp,Guy Smagghe,J.Agric.Food Chem2005,53: 8106-8115）。血管紧张素转化酶对于机体血压和心血管功能起着重要的调节作用，因此抑制 ACE活性的药物在心血管、心力衰竭等疾病的治疗中发挥重要作用。多肽类的ACE抑制剂在 降血压的同时不会引起常见降压药物的干咳等副作用。

发明内容

本发明的目的是提供多肽AELDIVLALF在抑制ACE活性和降血压中的应用；多肽 AELDIVLALF具有ACE抑制活性及降血压活性，作为高血压、心脏病和心血管病的保健品 和药物先导化合物具有良好的应用前景。

为实现上述目的，本发明以所述多肽AELDIVLALF为抑制ACE活性和降血压的有效成 份。

其具有序列表SEQ ID NO：1中氨基酸序列；多肽AELDIVLALF为ACE抑制剂及降 血压药物的活性成份，其中可添加药物学上可接受的载体或辅料。

具有抑制ACE活性和降血压活性的多肽化合物AELDIVLALF的氨基酸序列为 Ala-Glu-Leu-Asp-IIe-Val-Leu-Ala-Leu-Phe。单链线性结构，分子量为1103.3Da，白色粉末状， 易溶于水，对ACE活性具有很强的抑制作用，IC₅₀为10.6μM。

多肽AELDIVLALF具备ACE抑制剂所要求的特征：

1.ACE倾向于C末端三肽的每个位置含有疏水性氨基酸的底物或抑制剂，C末端为Try， Phe，Tyr和Pro而N端为支链氨基酸的肽段具有较强的ACE抑制活性。多肽AELDIVLALF 的C末端三肽均为疏水性氨基酸分别为Ala、Leu和Phe，C末端为Phe，因此满足ACE抑制 剂的绝大部分要求。

2.肽的疏水性是影响其抑制活性的重要原因，抑制活性高的肽都含有较多的疏水氨基 酸。多肽AELDIVLALF的疏水氨基酸有Ala，Val，Leu，Phe，IIe，含有较多的疏水氨基酸。

经ACE抑制活性检测，多肽AELDIVLALF的IC₅₀为10.6μM。

本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：

本发明首次从油菜花粉中获得并确定了活性化合物的结构，化合物具有较好的抑制ACE 的活性，因此作为治疗高血压、心脏病等心血管疾病药物和保健品的先导化合物具有良好的 潜力和应用前景。

具体实施方式

实施例1多肽AELDIVLALF的制备

20g油菜蜂花粉加入液氮研磨破壁后，加入pH=7.4、50mM Tris-HCl缓冲液150ml,超 声提取三次（一次：400W，超声4s，停4s，80个循环）；提取结束后于4℃、25000g离心 1h，取上清液，加入上清液4倍体积的混合溶剂（丙酮：乙醇：乙酸=50:50:0.1（体积比）） 沉淀过夜；沉淀结束后将所有样品于4℃、25000g离心30分钟，弃去上清，取沉淀用丙酮 洗涤脱色，然后于4℃、25000g离心15分钟，弃去上清，沉淀继续用丙酮反复洗涤直至上 清无色，最后用体积浓度75%乙醇洗涤沉淀并于4℃、25000g离心10分钟，弃上清，取沉 淀物冷冻干燥，得冻干蛋白。冻干蛋白用含有8M尿素的pH=7.4、100mM NH4HCO3缓冲液 复溶，以酶：蛋白=1:25（w/w）比例加入胰蛋白酶，37℃酶解20小时。上述酶解产物经制备 色谱分离，色谱柱为C18（20X250mm，10μm）,所用的流动相A为质量浓度0.1%甲酸/水溶 液，流动相B为质量浓度0.1%的甲酸/乙腈溶液，流速为2mL/min，洗脱过程如下：5%B—35%B (V/V)—80%B(V/V)。将在280nm下所检测到的色谱峰分别收集得到不同组分冷冻干燥，为 乳白色粉末状样品。

所得样品经反相液相色谱-串联质谱系统（RPLC-MS/MS）分析：将冷冻干燥后的酶解 样品用体积浓度0.1%甲酸溶液配制为0.4μg/μL，进样20μL进行LTQ线性离子阱质谱（配 置纳升级电喷雾源）分析。利用Xcalibur软件(Thermo)进行系统控制和数据收集。实验得到 的质谱数据结果分别在honeybee,Brassica campestris L.蛋白质数据库（http://www.uniprot.org/） 中进行检索，技术重复3次，数据库检索软件为SEQUEST。获得序列为 Ala-Glu-Leu-Asp-IIe-Val-Leu-Ala-Leu-Phe。

实施例2多肽AELDIVLALF的ACE抑制活性检测

ACE在37℃、PH8.3的条件下催化分解血管紧张素I的模拟底物 Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucine(HHL)产生马尿酸，该物质在228nm处有特征紫外吸收峰。当加 入ACE抑制物时，ACE对HHL的催化作用受到抑制，马尿酸的生成量会减少。通过测定加 入抑制剂前后的马尿酸紫外吸收值可以计算出抑制活性的大小。

反应体系

缓冲液为0.05M，PH8.3硼酸盐缓冲液；底物为Hippuryl-L-Histidyl-L-Leucine(HHL)，MW 429.47，用上述缓冲液配成5mM；ACE（angiotensin-converting enzyme）用上述缓冲液配成 0.1U/ml。

OD_A（对照组，为不存在抑制剂但存在酶时的吸光值）：50μl缓冲液+50ulHHL+50μl 缓冲液于37℃水浴5min，然后加入50μl ACE，37℃水浴30min，加入200μl、1M的 HCl终止反应，再加入1ml乙酸乙酯萃取产物马尿酸，振荡15S，3500r/min离心5min，取 0.8ml上清，90℃水浴干燥15min,重溶于0.8ml蒸馏水中，228nm处检测吸光值为OD_A。

OD_B（多肽样品组，为存在抑制剂和酶时的吸光值）:50μl样品+50μlHHL+50μl缓冲 液于37℃水浴5min，然后加入50μlACE，37℃水浴30min，加入200μl、1M的HCl 终止反应，再加入1ml乙酸乙酯萃取产物马尿酸，振荡15S，3500r/min离心5min，取0.8ml 上清，90℃水浴干燥15min,重溶于0.8ml蒸馏水中，228nm处检测吸光值为OD_B。

OD_C（空白组，为不存在抑制剂和酶时的吸光值）：50μl缓冲液+50μlHHL+50μl缓冲 液于37℃水浴5min，然后加入50μl缓冲液，37℃水浴30min，加入200μl、1M的HCl 终止反应，再加入1ml乙酸乙酯萃取产物马尿酸，振荡15S，3500r/min离心5min，取0.8ml 上清，90℃水浴干燥15min,重溶于0.8ml蒸馏水中，228nm处检测吸光值为OD_C。

ACE抑制率（%）=(OD_A-OD_B)/(OD_A-OD_C)×100%

分别用0.0495mg/ml,0.02475mg/ml,0.01485mg/ml,0.00495mg/ml的多肽浓度，按上述方 法进行ACE抑制活性检测。结果如下表：

经IC₅₀计算器计算该序列的IC₅₀为11.70μg/mL，即10.6μM。