抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体及其应用

摘要

本发明提供抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体及其应用，属于生物技术领域。产生抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体的杂交瘤细胞株10G1A2，其保藏号为CGMCC NO.9999。本发明还提供一种由所述杂交瘤细胞株10G1A2分泌的抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体、包被的免疫磁珠及所述免疫磁珠在检测大肠杆菌O157:H7方面的应用。本发明抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体包被的磁珠可以从体积较大的样品增菌液中有效富集大肠杆菌O157:H7，然后采用荧光定量PCR检测方法，可以极大的提高大肠杆菌O157:H7的检测灵敏度，提高大肠杆菌O157:H7 检测的准确性。

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体及其应用。

背景技术

食源性病原微生物污染是当今世界上不断增多的食品安全问题和突发性公共卫生事件之一。据WHO估计，食源性疾病的漏报率在95%以上，全世界每年至少有200万人死于以感染性腹泻为主的食源性疾病，这类感染大部分是因食品和饮水受微生物污染所致。在食源性病原微生物中，肠出血性大肠杆菌（EHEC）占有重要地位。

EHEC主要包括O157:H7（又称为大肠杆菌O157:H7或E. coli O157:H7），O26:H11和O111等几种血清型，其中O157:H7是典型菌株。大肠杆菌O157:H7感染能引起出血性结肠炎(Hemorrhagic colitis, HC)，阑尾炎，食管狭窄和结肠穿孔等严重胃肠道并发症，在儿童和老年人中还可引起溶血性尿毒综合征(Hemolytic uremic syndrome, HUS )及血栓性血小板减少性紫癜(Thrombotic Thrombocytopenic purpura, TTP)等严重并发症，重者可引起死亡。大肠杆菌O157:H7长期驻留于牛、羊、猪、鸡等家畜家禽的肠道中，并且牛是主要的贮存宿主，容易造成幼龄动物腹泻，进而污染畜禽产品、水源及农作物等，给农牧业生产造成巨大损失，同时也对人们的健康构成巨大威胁。1982年该菌首先在美国被发现，此后在世界各地散发或地方流行，1996年在日本大阪地区发生流行，患者逾万、死亡11人，1999~2000年在中国江苏、安徽等地发生了多起食源性感染O157:H7事件，导致l77人死亡。大肠杆菌O157:H7的感染具有暴发流行趋势、强烈的致病性与致死性以及抗生素治疗可能会加剧病情等特点，已成为全球性的公共卫生问题，世界性卫生组织也已将大肠杆菌O157:H7列为新的食源性病原菌。现有检测大肠杆菌O157:H7的荧光定量方法，检测灵敏度达到80CFU/ml，仍然不能满足监控的要求，尤其在样品中污染的大肠杆菌O157:H7较少时，样品取样误差和灵敏度不够高，造成检出率不高。

发明内容

本发明的目的是提供分泌抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

本发明的另一目的是提供上述杂交瘤细胞株分泌的抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体，该单克隆抗体的特异性强、灵敏度高。

本发明的再一目的是提供抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体在检测大肠杆菌O157:H7方面的应用，能够有效富集待测样品中的大肠杆菌O157:H7，结合荧光定量PCR方法，显著提高了灵敏度和准确性。

本发明的目的采用如下技术方案实现。

一种产生抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体的杂交瘤细胞株10G1A2，其保藏号为CGMCC NO. 9999。

本发明还提供一种由所述杂交瘤细胞株10G1A2分泌的抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体。

本发明还提供所述抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体在检测大肠杆菌O157:H7方面的应用。

本发明还提供所述抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体包被的免疫磁珠及所述免疫磁珠在检测大肠杆菌O157:H7方面的应用。

在本发明中，采用所述免疫磁珠富集待测样品中的大肠杆菌O157:H7，得到富集液；采用荧光定量PCR方法检测所述富集液中的大肠杆菌O157:H7。

在本发明中，所述富集待测样品中大肠杆菌O157:H7的方法为：将所述免疫磁珠加入待测样品中进行吸附，用磁力架沉淀所述免疫磁珠，洗脱所述免疫磁珠，取洗脱液作为富集液。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明用大肠杆菌O157:H7全菌免疫，之后用大肠杆菌O157:H7表面脂多糖挑选特异性单克隆抗体，大大提高了该单克隆抗体对大肠杆菌O157:H7的特异性和灵敏度。

与常规方法相比，本发明抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体包被的磁珠可以从体积较大的样品增菌液中有效富集大肠杆菌O157:H7，然后采用荧光定量PCR检测方法，可以极大的提高大肠杆菌O157:H7的检测灵敏度；此外本发明抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体包被的磁珠能特异性地吸附预增菌液中的大肠杆菌O157:H7，可排除其他杂菌对分离培养或荧光定量PCR检测的干扰，可以提高大肠杆菌O157:H7 检测的准确性。由于磁珠包被有特异性抗体，富集效果及效率大大提高，磁珠与细菌结合是通过非共价键结合，不会影响大肠杆菌O157:H7的生理和生化特性。

附图说明

图1 单克隆抗体的SDS-PAGE电泳图，其中M-分子量Mark，1-纯化抗大肠杆菌O157:H7表面脂多糖单克隆抗体。

保藏信息：

参椐的生物材料（株）：10G1A2；

分类命名：产大肠杆菌O157:H7单克隆抗体杂交瘤细胞株；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；

保藏号为CGMCC NO. 9999，保藏日期为：2014年11月18日。

具体实施方案

0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.6）：含有0.05 mol/L Na₂CO₃和0.05 mol/L NaHCO₃的水溶液，pH值为9.6。 

PBS缓冲液（0.01M, pH 7.4）：取137 mmol NaCl、2.7 mmol KCl、10 mmol Na₂HPO₄和 2 mmol KH₂PO4溶于水，调节pH至7.4，用水定容至1L。

PBST缓冲液：在PBS缓冲液（0.01M, pH 7.4）中添加终浓度为0.05%（质量百分浓度）吐温－20。

封闭液：含质量浓度为0.5% 牛血清白蛋白（BSA）的PBST缓冲液。

羊抗鼠HRP-IgG: HRP（辣根过氧化物酶 ）标记的羊抗鼠IgG（abcam：ab6789）。

TMB底物显色液：包括A液和B液。A液：将1 mL浓度为10 mg/mL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺（缩写为TMB，郑州四季化工公司）溶液加入到100 mL 浓度为0.1 mol/L、pH为6.0的磷酸缓冲液中配成；所述浓度为0.1 mol/L、pH为6.0的磷酸缓冲液的配制方法为：0.1 mol/L磷酸二氢钠水溶液87.7 mL和0.1 mol/L磷酸氢二钠水溶液12.3 mL混合即成。B液：体积浓度为3%的H₂O₂水溶液，10 mL。A液和B液均需4℃密封、避光保存。使用时每10 mL A液加50 μL B液混匀即用。

终止液：2 mol/L的H₂SO₄溶液。

氨基喋呤（A）贮存液配制方法：取1.76mg氨基喋呤，加入90mL超纯水中，滴加1mol/L  NaOH水溶液0.5mL 助溶，待完全溶解后，加1mol/L盐酸0.5mL 中和，加超纯水定容至100mL，0.22um膜过滤除菌，小量分装，-20℃保存。

次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）贮存液配制方法：取136.1mg 次黄嘌呤（H）和38.8mg胸腺嘧啶核苷（T），加超纯水至100mL，置于45-50℃水浴中使之完全溶解。0.22um膜过滤除菌，小量分装，-20℃保存，临用前37℃水浴中溶解。

L-谷氨酰胺（L·G）溶液配制方法：取2.92g L-谷氨酰胺，溶于100mL超纯水中，0.22um膜过滤除菌，小量分装，-20℃保存。

双抗溶液（青链霉素溶液）配制方法：取青霉素（钠盐）100万单位和链霉素（硫酸盐）1g，溶于100mL灭菌超纯水中，小量分装，-20℃保存。

完全培养基RPMI-1640：在购买的不完全RPMI-1640培养基中加入终浓度（体积百分浓度）均为1%的L·G溶液和双抗溶液，加终浓度（体积百分浓度）为10%的新生犊牛血清。

HT培养箱：在完全培养基RPMI-1640中加入终浓度（体积百分浓度）为1%的HT贮存液

HAT培养基：在完全培养基RPMI-1640中加入终浓度（体积百分浓度）为1% 的 HT贮存液和1%的A贮存液。

实施例1 抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体的制备

1 抗原的制备

E. coli O157:H7培养液50mL，10000rpm离心5min，取菌泥，用生理盐水重悬，加入菌悬液体积0.5%的甲醛溶液，37℃灭活24h，生理盐水洗涤三次后，调整菌液浓度为2.5×10⁹个/mL，得到灭活O157:H7菌悬液，-20℃冻存备用。

取灭活O157:H7菌悬液，使用iNtRON Biotechnology 公司脂多糖提取试剂盒LPS Extraction Kit（货号：17141），提取大肠杆菌O157:H7表面脂多糖，-20℃冻存备用。

2  杂交瘤细胞株的建立

2.1  免疫动物

选择6~8周龄雌性BALB/c鼠10只。每只小鼠腹腔注射0.2mL灭活O157:H7菌悬液（步骤1制备），每间隔1周同样剂量加强注射一次，共免疫5次，其中最后一次免疫是在融合前3d，通过尾静脉注射同样量抗原加强免疫。

2.2  饲养细胞的制备

进行细胞融合前24h，将BALB/c小鼠摘除眼球采血，分离血清，作为抗体检测时的阴性对照血清；同时通过颈脱位致死小鼠，于75％酒精中浸泡10min，腹部向上固定后，无菌剪开腹部皮肤，镊子剥离皮肤，暴露腹膜，酒精棉球擦拭腹膜消毒；用注射器注射10mL HAT培养基至腹腔，注意避免穿入肠管，右手固定注射器，使针头留置在腹腔内，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部1min，随后反复抽吸注入的培养基直至吸入注射器内的HAT培养基泛黄为止。把吸出的培养基在1000r/min离心10min，弃上清，用5mL HAT培养基将沉淀细胞悬浮，使用HAT培养基调整细胞浓度达到2×10⁵个/mL，得到饲养细胞悬液。将饲养细胞悬液加入96孔板，每孔一滴（约50μL），置37℃、5％CO₂培养箱中培养。

2.3  骨髓瘤细胞SP2/0的制备

融合前两周开始复苏骨髓瘤细胞SP2/0（由扬州大学兽医学院传染病实验室馈赠），扩大培养，融合时确保骨髓瘤细胞SP2/0处于对数生长期，有良好的形态，活细胞计数高于95％；融合当天，用不完全RPMI-1640培养基（Gibco 货号：12633012）将骨髓瘤细胞SP2/0从瓶壁轻轻吹下，收集于50mL离心管内，1000r/min离心10min，弃去上清，加入不完全RPMI-1640培养基30mL，同法离心弃去上清；然后将细胞重悬浮于不完全RPMI-1640培养基10mL，混匀，制成骨髓瘤细胞SP2/0悬液，并做活细胞计数。

2.4  脾淋巴细胞的制备

取标题2.1中最后一次免疫3d后的雌性BALB/c小鼠，摘除眼球采血作为阳性血清；颈脱位法致死小鼠，于75％酒精中浸泡10min，随即放入超净台内的解剖板上，腹部朝上，四肢固定。无菌取出脾脏，用不完全RPMI-1640培养基洗涤数次，并用镊子除去附着的结缔组织。将脾脏移入200目微孔滤网上，置于新鲜不完全RPMI-1640培养基中，用研磨棒轻轻研磨，将脾脏制成单细胞悬液，收集脾细胞悬液，1000r/min离心10min，取脾细胞用不完全RPMI-1640离心洗涤1~2次，最后将脾细胞重悬于10mL不完全RPMI-1640中，混匀，得到脾淋巴细胞悬液，并做活细胞计数后备用。

2.5  细胞融合

按常规方法融合，取计数后的骨髓瘤细胞SP2/0与脾淋巴细胞按细胞数之比为1:5~1:10的比例混合于50mL离心瓶中，充分混匀，1000r/min离心10min，弃上清。用手掌轻击离心瓶底，将沉淀的细胞打散。将离心瓶底部放入40~41℃水浴中，边旋转边加入融合用的PEG-4000 1mL，在1min内加完，继续旋转同时加入不完全RPMI-1640培养基15mL，在90s内加完，由慢到快，前5s加1mL。室温静置10min后，1000r/min离心10min，弃上清，加入HAT培养基（HAT培养基对杂交瘤细胞具有选择性所以有时候称为HAT选择性培养基），悬浮杂交瘤细胞。将杂交瘤细胞悬浮液分配到加入了饲养细胞的96孔细胞培养板，置于37℃、5%CO₂的温箱中培养。5d后，用新鲜预热的HAT培养基换出一半培养基；10d后用预热的HT培养基换出HAT培养基；观察杂交瘤细胞的生长情况，待其细胞培养液上清变黄或克隆分布至孔底面积的1/10以上时，吸取适量细胞培养液上清进行抗体检测。

2.6  筛选 

2.6.1 间接ELISA最佳抗原包被量和血清稀释度的选择

融合前免疫小鼠眼球采血制备的阳性血清（标题2.4），筛选时作为阳性对照；非免疫小鼠眼球采血制备的血清作为阴性对照（标题2.2），同时以PBST缓冲液作为空白对照调零孔。在酶标板上进行方阵试验，确定检测抗原的最佳包被浓度及阳性、阴性对照的最佳稀释浓度，具体步骤为：

（1）包被：检测抗原（本实施例标题1中灭活O157:H7菌悬液）用0.05mol/L碳酸盐缓冲液（pH9.6）分别稀释10倍、100倍、1000倍、10000倍，自左向右每个稀释度加一列，100 μL/孔，37℃作用2h后置4℃过夜；

（2）洗涤：弃去孔内的液体，PBST缓冲液洗3次，每次洗涤5min,拍干；

（3）封闭：每孔加入150μL封闭液，37℃作用2h；

（4）洗涤：方法同前；

（5）加入一抗：一抗（标题2.4制备的阳性血清）用PBST缓冲液分别稀释100倍、1000倍、10000倍，每个稀释度加一行，100μL/孔，37℃作用1h；

（6）洗涤：方法同前；

（7）酶标二抗：加入工作浓度(1：3000稀释)的羊抗鼠HRP-IgG，100μL/孔，37℃孵育1h，洗涤同前；

（8）显色：加入TMB底物显色液100μL/孔，37 ℃反应10~15 min；

（9）终止反应：加入终止液，50μL/孔，终止反应，测定各孔OD₄₅₀。

结果判定：以阳性血清OD₄₅₀值在1.0左右,阴性血清OD₄₅₀值小于0.2，且阳性血清OD₄₅₀值/阴性血清OD₄₅₀ (P/N值)最大时为检测抗原的最佳工作浓度，该点对应的血清稀释度为最佳血清稀释度。结果：检测抗原（标题1中灭活O157:H7菌悬液）的最佳包被浓度为1×10⁶个/mL，阳性血清的最佳稀释度为1：1000；阴性的最佳稀释度为1:1000。

制备包被有检测抗原的酶标板：

（1）包被：检测抗原以最佳工作浓度包被96孔聚苯乙烯酶标板，100μL /孔，37℃作用2h后置4℃过夜；

（2）洗涤：弃包被液，用PBST缓冲液洗3次，每次洗涤5min，拍干；

（3）封闭：每孔加入150μL封闭液进行封闭，37℃作用2h；

（4）洗涤：按照步骤（2）方法洗涤，得到包被有检测抗原的酶标板，-20℃保存备用。

注：下面的间接ELISA检测中，采用包被有检测抗原的酶标板，阳性、阴性血清均取最佳稀释度。

2.6.2 间接ELISA试验

为了筛选杂交瘤细胞株，取标题2.5中细胞培养液上清100μL加入包被有检测抗原的酶标板中，同时设立阳性、阴性和空白对照，37℃孵育1h，洗涤；加入工作浓度(1：3000稀释)的羊抗鼠HRP-IgG， 100μL/孔，37℃孵育1h，同前洗涤拍干；加入TMB底物显色液100μL/孔，37 ℃反应10~15 min；加入终止液50μL/孔，终止反应。测定各孔OD₄₅₀。判断标准：待检孔的OD₄₅₀/阴性孔的OD₄₅₀≥2.1即可判为待检孔内细胞株为阳性，可进行下一步试验。

2.7  杂交瘤细胞的克隆化

采用有限稀释法对连续两次检测为阳性的细胞株进行克隆化。克隆前制备小鼠饲养细胞。对待克隆孔内活细胞准确计数，用HT培养基10倍比稀释成20个细胞/mL培养基，加入到已铺有饲养细胞的96孔细胞培养板中，使每孔理论上有1个细胞，置于37℃、5%CO₂的温箱中培养。当细胞生长至孔底面积的1/10时进行检测，强阳性孔再按照相同方法进行克隆，如此重复3~4次，直至阳性率达到100%，获得初步筛选的杂交瘤细胞株。将初步筛选的杂交瘤细胞株扩大培养，冻存细胞，同时保留上清液，采用间接ELISA测定抗体效价，选取效价较高的若干杂交瘤细胞株。

2.8  杂交瘤细胞株的筛选

  取大肠杆菌O157:H7表面脂多糖进行SDS-PAGE电泳，并与标题2.7中效价较高的若干杂交瘤细胞株培养上清液分别进行免疫杂交，选取免疫反应效果最好的克隆作为分泌抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为10G1A2。

2.9 单克隆抗体的特异性

受试菌株包括E. Coli O157:H7、EHEC O26:H11、EHEC O111、EPEC O127:H6、ETEC O148:H28、E. coli O25、E. coli O55、E. coliO78、E. coli O103、E. coli O138、E. coli O139、E. coli O141、E. coli O145、E. coli K88、E. coli K99、E. coli BL21、E. coli Top10、金黄色葡萄球菌、志贺杆菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、嗜水气单胞菌、副溶血弧菌、沙门氏菌、腊样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、多杀性巴氏杆菌、鸭疫里氏杆菌、副猪嗜血杆菌、乳酸杆菌、布氏杆菌、李氏杆菌、禽分支杆菌、链球菌、魏氏梭菌、肉毒梭菌、禽波氏菌。将各受试菌株按照标题2.6.1中方法包被酶标板，然后进行间接ELISA检测，考察杂交瘤细胞株10G1A2培养液上清的特异性。结果显示，杂交瘤细胞株10G1A2培养液上清只与E. Coli O157:H7发生阳性反应，其他各菌均为阴性反应（待检孔的OD₄₅₀/阴性孔的OD₄₅₀≥2.1 判定为阳性）。

3.单克隆抗体的制备及性质

3.1  单克隆抗体的制备

选8~10周龄体重20g以上的雌性BALB/c鼠，腹腔注射液体石蜡，0.5mL/只，1周后腹腔注射杂交瘤细胞株10G1A2（2×10⁶~5×10⁶细胞/只），在动物腹部明显增大时抽取腹水，3000r/min离心10min，取上清液，-20℃冻存备用。

利用HiTrap^TM Protein G亲和层析柱（生工生物工程(上海)股份有限公司，货号SD6606）对腹水上清液进行纯化。纯化过程中所用试剂全为化学纯，所有溶液的溶剂全为去离子水，配好后用0.45μm滤膜过滤，腹水上清液纯化前10000 r/min离心3min。纯化具体操作步骤如下：

(1)去掉层析柱顶部的塞子，用接合器把注射器和层析柱连在一起。

(2)去掉层析柱尾部的snap-off。

(3)用注射器吸取10ml binding buffer（生物工程(上海)股份有限公司，货号BSP048-2），“滴对滴”式注入，以防空气进入层析柱，注射速率1ml/min。

(4)吸取待纯化腹水上清液，注入到层析柱中。

(5)吸取10ml binding buffer于层析柱中，洗脱杂蛋白。

(6)用5 ml elution buffer（0.1M 柠檬酸溶液）洗柱，准备1.5ml收集管5个，每管预先加入浓度为1M、pH9.0的Tris-HCl缓冲液 200μL，每管收集1ml。

腹水上清液纯化后，得到纯化抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体，经Nanodrop1000（Thermo）测得蛋白含量为1.027mg/mL，-20℃保存备用，并用SDS-PAGE电泳观察纯化效果，可见目的蛋白纯度很高，主条带大小为略大于200kDa，如图1。

3.2 抗体效价测定

采用包被有检测抗原的酶标板（标题2.6.1中制备），将杂交瘤细胞株10G1A2培养液上清和腹水上清液做倍比稀释，采用间接ELISA方法检测效价，培养液上清效价为1:2430；腹水效价为>1:81000。

3.3  亚类测定

按照Thermo scientific公司单克隆抗体亚类鉴定试剂盒操作说明书检测抗体亚类。杂交瘤细胞株10G1A2产生的单克隆抗体亚类为IgG。

3.4单克隆抗体的亲和常数

杂交瘤细胞株10G1A2产生的抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体的亲和常数Kd=5.69*10^-8。

实施例2 制备抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体包被的免疫磁珠

1.取165 u L磁珠悬浮液(含磁珠5mg，购于Life technologies，货号1309004)置离心管内，用磁力架将磁珠沉淀（以下简称磁力沉淀），具体操作步骤是：将离心管放于磁力架上，待上层液体变澄清后弃掉上清，保留底部的磁珠，移开磁力架；

2.加入1mL 磁珠偶联缓冲液，重悬磁珠，磁力沉淀；

3.先后加入75.7μL磁珠偶联缓冲液、50μL实施例1中制备的纯化抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体（含抗体100ug）和步骤2中磁力沉淀后的磁珠，混匀，再加入100μL处理液，混匀，置37℃摇床上孵育18h后，磁力沉淀；

4.加入1mL封闭液A重悬磁珠，37℃摇床上孵育1h后，磁力沉淀；

5.加入1mL储备液，涡旋振荡5-10s后，磁力沉淀；重复该操作一次；加入240uL储备液混匀（溶液总体积250uL），得到抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体包被的免疫磁珠，于4℃冰箱保存。

磁珠偶联缓冲液：1mol/L 的硼酸盐缓冲液，其pH为7.4；

处理液：在1mol/L的硼酸盐缓冲液（pH为7.4）中添加终浓度为3mol/L的硫酸铵；

封闭液A：0.5g牛血清白蛋白（BSA ）溶于100mL的PBS缓冲液（0.02M，pH为7.4）；

储备液：0.1g BSA溶于100mL PBS缓冲液（0.02M，pH为7.4）；

PBS缓冲液（0.02M，pH为7.4）：含有Na₂HPO₄ 2.9g/L、KH₂PO₄ 0.2g/L、NaCl 8.0g/L、KCl 0.2g/L的水溶液，其pH为7.4。

实施例3利用抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体包被的免疫磁珠检测大肠杆菌O157:H7

（1）依据SN/T0793-2010（进出口肉、肉制品及其他食品中肠出血性大肠杆菌O157:H7检测方法）进行待测样品的预增菌：将待测样品加入EC肉汤中，在42℃条件下培养18-24h，获得增菌液；

（2）在离心管中加入步骤（1）得到的增菌液20-30mL，然后加入抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体包被的免疫磁珠（实施例2制备）50μL，37℃孵育1h；

（3）洗涤磁珠：将离心管放于磁力架上将磁珠沉淀，3min后弃去上清，加入30mL PBS缓冲液（0.02M，pH为7.4）缓慢重悬，用磁力架将磁珠沉淀，弃去上清。如此重复洗涤3次；

(4)向洗涤后的免疫磁珠中加入1mL浓度为50mmol/L甘氨酸水溶液，间断振荡洗脱免疫磁珠1h，将离心管放于磁力架上，待免疫磁珠全部被吸附于管壁上时取出上清液，即洗脱液。此洗脱液为大肠杆菌O157:H7富集液。从大肠杆菌O157:H7富集液中直接提取样品DNA，然后用荧光定量PCR法检测待测样品中是否存在大肠杆菌O157:H7。

（5）荧光定量PCR检测

取样品DNA ，使用TaKaRa荧光定量PCR试剂盒（DRR390A），配制反应体系如下：Premix Ex Taq(2×) 10ul、上游引物(10uM) 0.4ul、下游引物(10uM) 0.4ul、Taqman探针0.8ul、ROX Reference Dye Ⅱ（ROX参考染料Ⅱ,50×）（）0.2ul、模板（样品DNA）2ul、dH₂O 6.2ul。

上游引物（SEQ ID NO:1）：5’-GCACTAAAAGCTTGGAGCAGTTC-3’。

下游引物（SEQ ID NO:2）：5’-AACAATGGGTCAGCGGTAAGGCTA-3’。

Taqman探针：5’-FAM-CGTTGGCGAGGACC-TAMRA-3’。FAM是报告荧光基团，TAMRA淬灭荧光基团 。Taqman探针的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

配制好的20ul反应体系，装入荧光定量PCR反应管中，盖好管盖，离心，确认反应管中无汽包后放入ABI7500荧光定量PCR仪中反应。

反应程序如下：第一步：95℃ 30s；第二步95℃ 5s，60℃ 34s，重复40个循环；反应过程中在60℃收集荧光信号。最终结果：以CT值≤35为阳性，如CT值等于35则需重复试验验证；CT值＞35为阴性反应。

实施例4利用抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体包被的免疫磁珠检测大肠杆菌O157:H7的灵敏度

制备大肠杆菌O157:H7菌液，10倍倍比稀释，涂布山梨醇麦康凯琼脂平板（参照进出口肉、肉制品及其他食品中肠出血性大肠杆菌O157:H7检测方法）以确定菌落数。

选取10¹、10²、10³、10⁴、10⁵CFU/ml稀释菌液，采用实施例3中方法分别进行大肠杆菌O157:H7检测，考察本发明方法的灵敏度。结果为10¹CFU/ml-10⁵ CFU/ml各稀释菌液均检测为阳性。因此，本发明方法检出灵敏度可达10CFU/mL以内。

荧光定量PCR检测方法对大肠杆菌O157:H7的检出灵敏度为80CFU/ml（Baoguang Li, Jin-Qiang Chen. Real-Time RCR Methodology for Selective Detection of Viable Escherichia coli O157:H7 Cells by Targeting Z3276 as a Genetic Marker[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2012,78(15):5297-5304）。

实施例5利用抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体包被的免疫磁珠检测大肠杆菌O157:H7的准确性

1.干扰试验：分别制备各干扰菌株的菌悬液（选用菌株为实例1标题2.9中非O157:H7菌株）各25ml(菌液浓度为10⁵/mL)，添加大肠杆菌O157:H7约1-10个，按照实施例3中的操作步骤进行。结果均为阳性。

未添加大肠杆菌O157:H7的各干扰菌株的菌悬液（选用菌株为实例1标题2.9中非O157:H7菌株）均为检测阴性。

2.模拟检测试验：模拟自然感染的随机接触污染方式，人工制备随机浓度（1CFU/g-10³CFU/g）大肠杆菌O157:H7污染样100份。分别按照SN/T0793-2010、本发明方法（实施例3中方法）以及荧光定量PCR方法进行检测。发现用SN/T0793-2010方法（进出口肉、肉制品及其他食品中肠出血性大肠杆菌O157:H7检测方法）的检测率为57%，本发明方法检出率为98%，荧光定量PCR方法检出率为69%。表明本发明将免疫磁珠与荧光定量PCR联用方法，能够有效将样品中的大肠杆菌O157:H7进行富集，结合荧光定量PCR方法，大大提高了检出率。本发明检测方法的检测率不仅显著高于SN/T0793-2010方法，而且显著高于荧光定量PCR方法。

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心

 

<120>  抗大肠杆菌O157:H7单克隆抗体及其应用

 

<130>  20141229

 

<160>  3    

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  23

<212>  DNA

<213>  artificial

 

<220>

<223>  上游引物

 

<400>  1

gcactaaaag cttggagcag ttc                                             23

 

 

<210>  2

<211>  24

<212>  DNA

<213>  artificial

 

<220>

<223>  下游引物

 

<400>  2

aacaatgggt cagcggtaag gcta                                            24

 

 

<210>  3

<211>  14

<212>  DNA

<213>  artificial

 

<220>

<223>  Taqman探针的核苷酸序列

 

<400>  3

cgttggcgag gacc                                                       14