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法律状态
2022-06-14
未缴年费专利权终止 IPC(主分类):C12P19/02 专利号:ZL2012102293120 申请日:20120704 授权公告日:20140702
专利权的终止
2014-07-02
授权
授权
2013-01-09
实质审查的生效 IPC(主分类):C12P19/02 申请日:20120704
实质审查的生效
2012-11-14
公开
公开
技术领域
本发明涉及一种固定化磷脂酶A1催化合成糖酯表面活性剂——果糖月桂酸单酯,属于有机合成领域。
背景技术
糖酯一般是由长链脂肪酸和糖通过酯键连接而成。因此糖酯分子同时具有非极性的长链脂肪酸和极性的多羟基糖,从而具有表面活性剂作用。糖酯分子不具有离子化功能基团,是典型的非离子表面活性剂。其作为一类性能优良的典型的非离子型绿色生物表面活性剂,在食品、化妆品、医药、洗涤剂、纤维等工业中有着重要用途。果糖酯作为一类非离子表面活性剂,同样具有广泛的应用领域。
糖酯的合成方法有化学法和酶法,化学法往往是在高温、有毒溶剂及碱性催化剂下进行的,这使得产品色泽较深、单酯含量不高,生产能耗高及存在安全隐患,并且产品的酯化位置和酯化度不易控制,为产品的分离和使用带来了不便。因此从产品安全性和环保角度看,应用生物技术替代传统化学合成途径生产化合物符合国际发展潮流。酶法合成具有高效性和特异性、反应条件温和、副产物较少等特点,近年来发展很快。
目前,酶法制备果糖月桂酸单酯方法主要是脂肪酶,如NOVO435,但是商业化的脂肪酶价格昂贵,因此就限制了它应用。
磷脂酶 A1是诺维信公司推出的一种微生物来源的磷脂酶,常用于油脂的脱胶,该酶是一种羧酸酯水解酶,同时具有脂肪酶活性和磷脂酶活性。在一定反应体系中,它会优先表现出其中一种特定的酶活,比如脂肪酶活性。目前未见到关于采用固定化磷脂酶 A1催化果糖和月桂酸制备果糖月桂酸单酯的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种固定化磷脂酶A1催化合成果糖月桂酸单酯的方法。该方法反应溶剂无毒,酶用量少且可以回收利用,反应产物与反应溶剂和脂肪酶均容易分离,有利于连续化生产。本发明所提供的采用固定化磷脂酶A1催化合成果糖月桂酸单酯的方法,包括以下内容:
(1)磷脂酶A1的固定化:取5~10份质量经活化处理的DA-201大孔吸附树脂,10~25份质量的磷酸盐缓冲液,0.5~2份质量游离磷脂酶A1混合,在25~35℃下搅拌吸附2~6h,然后过滤,得大孔吸附树脂固定化磷脂酶,将制好的固定化酶真空干燥,备用;
(2)制备脱水有机溶剂:将3?或4?分子筛置于95~105℃烘箱内活化5~10h,再置于干燥器内冷却至室温,备用;之后,再将活化后的3?或4?分子筛按照每升溶剂添加50~80份质量的量加入到待用的作为反应介质的有机溶剂中,密封放置24~72h,过滤除去分子筛,得脱水有机溶剂;
(3)固定化磷脂酶A1催化合成果糖月桂酸单酯:取10~40.6份质量月桂酸和1.8~36.5份质量果糖置于上述脱水有机溶剂中混合,其中月桂酸浓度为5~24wt%,再加入相对于月桂酸质量8~25wt%的固定化磷脂酶A1开始反应;反应0~2h后按照相对于月桂酸质量0.5-2倍的量加入活化后的3?或4?分子筛以除去反应中生成的水;在35℃~45℃下振荡或搅拌反应8~96h,振荡速度150~185r/min;反应结束后,采用过滤方法将固定化磷脂酶A1、分子筛及未反应的糖除去;所得滤液通过旋转蒸发除去有机溶剂,提纯后得到产物果糖月桂酸单酯。
所述步骤(1)中经活化处理的DA-201大孔吸附树脂与磷酸盐缓冲液质量比为1:2;磷脂酶A1的用量为大孔吸附树脂质量的20wt%。
所述步骤(2)中反应介质有机溶剂种类为正丁醇、叔丁醇、叔戊醇、氯仿、丁酮、丙酮或乙腈中的任意一种,或两种以上的混合物;且所述的反应介质有机溶剂极性范围即
Log P=3.0~7.0。
所述步骤(3)中固定化磷脂酶 A1的用量为月桂酸质量20wt%。
所述步骤(3)中活化的3?或4?分子筛的用量与月桂酸质量比为1:1。
本发明的优点如下
(1)由于采用酶促合成方法,与传统的化学合成方法相比具有环境友好的特点;反应过程中加入分子筛有利于除去反应中产生的水分,使酯化反应向正方向进行;反应溶剂属于常用有机溶剂,毒性小,沸点低,和产物易于分离。
(2)经HPLC-MS(液质联用)检测证明催化产物是果糖月桂酸单酯;通过RP-HPLC-ELSD (反相高效液相色谱-蒸发光散射检测器)检测,固定化磷脂酶A1催化果糖月桂酸单酯的转化率达到68.05%。
(3)和已经报道的采用固定化脂肪酶催化合成糖酯相比,本发明所采用的固定化磷脂酶A1的价格只有商业化固定化脂肪酶的10%-15%,因此采用磷脂酶 A1作为催化剂具有成本优势,工业化应用前景良好。
附图说明
图1为本发明固定化磷脂酶 A1催化果糖月桂酸单酯的酯化反应方程式。
图2是反应得到的果糖月桂酸单酯的液质联用图谱。
具体实施方式
下面结合具体的实例与附图对本发明作进一步详细的叙述,但本发明的实施方法灵活,不仅仅限于此例所述的具体操作方式。
以下实施中所用材料:商业化磷脂酶 A1(Lecitase? Ultra,丹麦诺维信公司),经三丁酸甘油酯pH-stat法测定,酶活力单位为3326 U/g;大孔吸附树脂DA-201,天津市海光化工有限公司;D-果糖,上海伯奥生物科技有限公司;月桂酸,天津市大茂化学试剂厂;3?或4? 分子筛,天津市福辰化学试剂厂;各种反应介质均为AR级。
通过液质联用对催化产物果糖月桂酸单酯进行鉴定;经高效液相色谱仪-蒸发光散射检测器对产品中果糖月桂酸单酯的含量进行检测,以确定果糖月桂酸单酯的转化率。
实施例1:
a.称取5 g经活化处理的DA-201大孔吸附树脂,10g 磷酸盐缓冲液,1g的游离磷脂酶A1混合,在25℃下搅拌吸附2h,然后过滤,得大孔吸附树脂固定化磷脂酶,其酶活为1850 U/g。真空干燥,备用;
b. 将4 ?分子筛置于105℃烘箱内活化10h,再置于干燥器内冷却至室温,备用;之后,再将活化后的4?分子筛按照每升溶剂添加80g的量加入到作为反应介质的叔丁醇中,密封放置72h,过滤除去分子筛,得脱水有机溶剂;
c.酶促酯化:取10g月桂酸和1.8g果糖在体积为42ml上述脱水有机溶剂中混合,再加入2g的固定化磷脂酶A1开始反应;反应2h后加入10g的活化4?分子筛以除去反应中生成的水;在45℃下振荡或搅拌反应48h,振荡速度 160r/min;反应结束后,采用过滤方法将固定化磷脂酶A1、分子筛及未反应的糖除去,取所得滤液,经液质联用鉴定可知合成产物为果糖月桂酸单酯;经高效液相色谱仪测定,果糖月桂酸单酯的转化率为68.05%。
实施例2:
a.称取5 g经活化处理的DA-201大孔吸附树脂,20g 磷酸盐缓冲液,1g游离磷脂酶 A1混合,在30℃下搅拌吸附4h,然后过滤,得大孔吸附树脂固定化磷脂酶,其酶活为1462 U/g。真空干燥,备用;
b. 将4?分子筛置于100℃烘箱内活化8h,再置于干燥器内冷却至室温,备用;之后,再将活化后的4?分子筛按照每升溶剂添加60g的量加入到作为反应介质的叔戊醇中,密封放置24h,过滤除去分子筛,得脱水有机溶剂;
c.酶促酯化:取10g月桂酸和2.3g果糖在体积为100ml上述脱水有机溶剂中混合,再加入2g的固定化磷脂酶A1开始反应;反应1h后加入10g的活化4?分子筛以除去反应中生成的水;在40℃下振荡或搅拌反应48h,振荡速度160r/min;反应结束后,采用过滤方法将固定化磷脂酶A1、分子筛及未反应的糖除去,取所得滤液,经液质联用鉴定可知合成产物为果糖月桂酸单酯;经高效液相色谱仪测定,果糖月桂酸单酯的转化率为64.68%。
实施例3:
a.称取5 g经活化处理的DA-201大孔吸附树脂,20g 磷酸盐缓冲液,1g游离磷脂酶 A1混合,在35℃下搅拌吸附3h,然后过滤,得大孔吸附树脂固定化磷脂酶,其酶活为1344 U/g。真空干燥,备用;
b. 将3?分子筛置于95℃烘箱内活化5h,再置于干燥器内冷却至室温,备用;之后,再将活化后的3?分子筛按照每升溶剂添加50g的量加入到作为反应介质的丙酮中,密封放置72h,过滤除去分子筛,得脱水有机溶剂;
c.酶促酯化:取40.6g月桂酸和36.5果糖在体积为812ml上述脱水有机溶剂中混合,再加入8.12g的固定化磷脂酶 A1开始反应;反应1h后加入40.6g的活化3?分子筛以除去反应中生成的水;在40℃下振荡或搅拌反应72h,振荡速度 170r/min;反应结束后,采用过滤方法将固定化磷脂酶A1、分子筛及未反应的糖除去,取所得滤液,经液质联用鉴定可知合成产物为果糖月桂酸单酯;经高效液相色谱仪测定,果糖月桂酸单酯的转化率为61.35%。
图2是反应得到的果糖月桂酸单酯的液质联用图谱,果糖月桂酸单酯的分子量为362,谱图中出现的385.3峰即为[M+Na]质谱信号, 因此催化合成的产物为为果糖月桂酸单酯。
机译: 用于固定化酶,用于重新排列甘油单酯,甘油二酯或甘油三酯的酯以及用于两亲性地玛油和磷脂酶的酶促降解的方法,以及使用固定化酶的方法。
机译: 用于合成环状碳酸酯的固定化催化剂的催化剂交联剂的制备方法,固定化催化剂的制备方法,用于固定化催化剂的催化剂交联剂和固定化催化剂
机译: 由两亲性酶催化的酶固体颗粒固定化方法,用于由磷脂酶催化的甘油二酯或甘油三酯的间酯化,以及从甘油三酸酯油中去除磷脂的方法