一种简便快速检测绵羊多胎基因BMPR-IB的试剂盒

摘要

本发明提供的一种简便快速检测绵羊多胎基因BMPR-IB的试剂盒，包括：（1）毛样DNA提取液A为175mM的NaOH溶液；（2）毛样DNA提取液B为175mM的HC l16.7μl，100mM的Tris-HCl、pH8.5、500μl，ddH2O483.3μl；（3）PCR扩增液为2×Taq PCR MasterMix10.0μl，ddH2O 7.7μl，10mM的上下游引物各0.4μl，其中BMPR-IB基因的上游引物序列：5'GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG3'；下游引物序列：5'CAAGATGTTTTCATGCCTCATCAACACGGTC3'；（4）限制性内切酶Ava II为10U/μl；（5）10×Buffer R为100mM Tris-HCl，100mM MgCl2，1M KCl，1mg/ml BSA；（6）染料为6×RNA/DNA Loading buffer；（7）ddH2O；（8）说明书。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物技术领域，尤其适用于从绵羊羊毛毛囊中简便快速提 取基因组DNA，继而用于检测绵羊BMPR-I B多胎基因A746G位点的试剂盒及方法。

背景技术

Fec^B基因是在绵羊中识别出的高繁殖力的第一个主效基因，后被证明该基因 实际为BMPR-IB基因，现已发现在澳大利亚Booroola Merino绵羊、印度Garole 绵羊、印度尼西亚Javanese绵羊、中国的湖羊、小尾寒羊、中国美利奴羊（军 垦型）、中国美利奴羊（新疆型）、滩羊、策勒黑羊中存在BMPR-IB基因A746G 突变位点，该基因对绵羊的排卵数与产羔数有显著影响，是控制绵羊产羔数的 主效基因之一。

文献检索披露：①2010年11月由新疆农垦科学院的管峰等申请了专利“一 种快速检测绵羊多胎Fec^B基因的方法”,该发明所提供的利用四条单链扩增引物 进行Fec^B基因分型的方法，是由特异性上游引物F1、下游引物R1和对照上游引 物F2、下游引物R2共同对待测绵羊基因组DNA扩增，然后对PCR扩增产物进行 电泳分析，确定序列扩增产物中条带大小和数目，产物有三种情况：包含220bp 和120bp；220bp和160bp；220bp、160bp和120bp。②2011年5月，新疆农垦 科学院的杨华等申请了专利“绵羊BMPR-IB基因A746G多态性检测试剂盒及检 测方法”，公开的绵羊BMPR-IB基因A746G多态性检测试剂盒，主要包含扩增液、 至少1张基因芯片、杂交缓冲液I和II、预杂交液、Taq酶、杂交显色试剂； 另外公开了利用该试剂盒进行检测的方法步骤：制备多个绵羊的染色体DNA备 用；试剂盒组装；用PCR方法扩增；变性处理；预杂交及杂交；杂交信号检测。

目前，关于检测BMPR-IB基因A746G突变位点的试剂盒及方法的相关发明 较少，针对BMPR-IB基因检测的发明及方法，获取DNA的手段基本上都是通过 酚仿抽提法提取试验动物血液中的DNA来实现的，但常规的酚仿抽提法操作过 程较为繁琐，需要用蛋白酶K进行较长时间的消化，在多步操作中会有基因组 DNA损失，整个检测过程较长，且所用酚仿等试剂对操作者身体健康不利。

高质量基因组DNA的提取是后续分子生物学研究的重要基础，较容易获得 而且最常用的材料有动物的血液、耳组织、尾组织或趾尖等样品，采集这些组 织虽不至于导致动物死亡，但对动物均会或多或少地造成身体伤害，易产生应 激，尤其是对于经济价值高或濒临灭绝的珍稀保护动物更不适用，提取动物毛 发则相对简便，并且对动物几乎不会造成伤害，另外，毛发更便于长期保存和 长途运输，不需要冷藏，也不需要特殊处理。

文献关于从毛发中提取DNA的方法也有报道：⑴余舰等在蛋白酶K(56℃) 作用下，采用酚-氯仿反复抽提法从毛发中提取了微量的DNA，但缺点是提取的 DNA的量较少。⑵徐艳春等和伍新尧等用Chelex-100处理毛发制备DNA，达到1 根毛发提取得到的DNA即可得到较好的实验结果，但用此方法对毛囊细胞裂解 不够彻底，残留的消化液对后继的PCR过程有一定的影响。而后，⑶李军林等 在常规的酚-氯仿提取法的基础上加以优化，以pH8.8Tris-HCl、MgCl₂溶液和 蛋白酶K为裂解液消化，使其获得了较高质量的DNA，但操作繁复、耗时。(4)赵 春江等在此基础上加以改进，以常用的PCR缓冲液、MgCl₂溶液和蛋白酶K为裂 解液，在PCR仪上设置一个单循环程序：65℃30min，95℃15min，4℃10 min，而后瞬时离心PCR管，上清液即可做PCR模板，此法采用的较高消化温度 (65℃)，可使蛋白酶K在较短时间内高效地消化毛囊中的蛋白质，使细胞释出 DNA；PCR的缓冲液中含有的Tris碱和PCR缓冲液的pH值，可在DNA提取过程 中起到保护DNA、防止降解的作用；在PCR仪上，95℃15min过程可使蛋白酶K 灭活，防止蛋白酶K在后续PCR过程中消化Taq酶而使PCR扩增无法进行，该 方法可以用于大量标本的处理，且效果较好，但该方法中所用试剂价格相对较 高且需保存在-20℃条件下。⑸杨胜林等通过从不同数量的猪毛中提取的DNA进 行质量比较分析，找出了适合于做分子标记试验所需的猪毛样本数量，Di  Martino等采用剪除毛干、保留毛囊的方法预处理毛发，可以减少角蛋白污染， 提高DNA提取物的浓度和纯度。

本发明的试剂盒，适用于检测绵羊BMPR-IB多胎基因A746G位点，可在24 小时内准确得出检测结果，为绵羊早期选种，即快速检测绵羊多胎基因，提供 了一种效率高、操作简便和经济实用的可规模化实施的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种效率高、操作简便、可规模检测，适用于检 测绵羊BMPR-IB多胎基因A746G位点的试剂盒及快速检测方法。

本发明的目的是这样实现的：一种简便快速检测绵羊多胎基因BMPR-IB的 试剂盒，利用试剂盒从羊毛毛囊中快速提取基因组DNA，并运用PCR-RFLP技术 检测BMPR-IB多胎基因A746G位点；

其中试剂盒包括：毛样DNA提取液A和B，PCR扩增液、限制性内切酶Ava II、 10×Buffer R、染料、ddH₂O、说明书；

（1）毛样DNA提取液A为175mM的NaOH溶液；

（2）毛样DNA提取液B为175mM的HCl 16.7μl，100mM的Tris-HCl、 pH8.5、500μl，ddH₂O 483.3μl；

（3）PCR扩增液为2×Taq PCR MasterMix10.0μl，ddH₂O7.7μl，10mM 的上下游引物各0.4μl，BMPR-IB基因的上下游引物由上海生物工程技术有限 责任公司合成；上游引物序列：5'GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG3'；下游引物序 列：5'CAAGATGTTTTCATGCCTCATCAACACGGTC3'；

（4）限制性内切酶Ava II为10U/μl；

（5）10×Buffer R为100mM Tris-HCl，100mM MgCl₂，1M KCl，1mg/ml BSA；

（6）染料为6×RNA/DNA Loading buffer；

（7）ddH₂O；

（8）说明书；

其中对绵羊繁殖力基因的检测：

（1）毛样DNA的提取：取15根带有毛囊的毛样，用70％乙醇清洗2次， 蒸馏水清洗2次，用消毒剪，剪切0.4cm根部毛样，放入0.2ml离心管中离 心，3500rpm、5-10s；加15μl毛样DNA提取液A，漩涡混合离心，3500rpm、 5-10s；用热循环程序处置：75℃1min，80℃2min，85℃1min，95℃1min， 97℃5min；从热循环仪上取下，加入15μl毛样DNA提取液B，漩涡混合， -20℃保存；经3500rpm、5-10s离心，取上清作为DNA模板，PCR扩增备用；

（2）PCR扩增：将1.5μl DNA模板加入对应标号的PCR管中，再加入18.5 μl PCR扩增液，弹去气泡，震荡混匀，经3500rpm、5-10s离心；放入设定好 程序的PCR仪中，反应程序为94℃预变性5min，94℃变性30s、60℃退火温 度30s、72℃延伸30s共30个循环，72℃延伸5min，4℃保存；用1.5%的琼 脂糖凝胶电泳进行PCR产物检测，电压120V、电泳30min、EB染色，凝胶成 像扩增产物符合预期片段140bp；

（3）PCR-RFLP检测：酶切反应体系为ddH₂O 2.5μl，10×Buffer R2.0μ l，限制性内切酶Ava II 0.5μl，PCR扩增产物5.0μl；放入37℃恒温箱消 化4h；用2.5%的琼脂糖凝胶电泳进行酶切产物检测，电压120V、电泳30min、 EB染色，凝胶成像系统成像，其基因判型结果：看不到30bp条带，只见140bp、 110bp条带。

本发明对毛囊DNA提取的提取液配方、毛囊样本量和DNA提取液上样量的 最适配比、热循环程序进行优化，确定毛样DNA提取液A为175mM的NaOH溶 液1000μl，毛样DNA提取液B为175mM的HCl 16.7μl，100mM的Tris-HCl(pH 8.5)500μl，ddH₂O483.3μl；15根带毛囊的毛样加15μl毛样DNA提取 液提取效果最佳；最优热循环程序为75℃1min，80℃2min，85℃1min， 95℃1min，97℃5min；此方法将用传统酚氯仿抽提法提取基因组DNA的时 间由1-2天缩短至30min，将利用PCR-RFLP技术检测BMPR-IB多胎基因A746G 位点的整个试验时间由2-3天缩短至1天，极大地提高了测定绵羊BMPR-IB多 胎基因A746G位点的效率。

本发明的快速检测绵羊BMPR-IB多胎基因A746G位点的方法，主要通过优 化和改进羊毛毛囊DNA的提取方法，简便快速的从羊毛毛囊中提取基因组DNA， 进而进行PCR-RFLP检测得以实现，彰显技术进步。

附图说明

本发明结合实施例作进一步说明。

附图1为PCR扩增的电泳图；

如图所示：M为DL2000DNA Marker，泳道2-4为用传统酚氯仿抽提法从血 样中提取基因组DNA后进行PCR扩增的产物，泳道1为该方法的空白对照；泳 道6-8为用优化后的毛囊DNA提取方法从羊毛毛囊中提取基因组DNA后进行PCR 扩增的产物，泳道5为该方法的空白对照。

附图2为酶切图；

如图所示：M为DL2000DNA Marker，泳道5为140bp，判定为++基因型， 泳道1-4、6、8为140bp、110bp、30bp，判定为B+基因型，泳道7为110bp、 30bp，判定为BB基因型；因30bp条带片段小，有可能从胶中跑出，可能看不 到30bp条带，只可见140bp、110bp条带，不影响判型。

具体实施方式

本发明结合实施例作进一步说明。

实施例

本发明公开的快速检测绵羊BMPR-IB多胎基因A746G位点的试剂盒包括下 列毛样DNA提取液A和B、PCR扩增液、限制性内切酶Ava I I、10×Buffer R、 ddH₂O、染料、说明书，具体规格如下表：

  编号   名称   规格(l/管)   数量(个)   1   毛样DNA提取液A   1000   2   2   毛样DNA提取液B   1000   2   3   PCR扩增液   1000   2   4  限制性内切酶AvaII   1000   1   5   10×Buffer R   1000   1   6   染料   1000   2

  7   ddH₂O   1000   2   8   说明书   1

1）毛样DNA提取液A

175mM的NaOH溶液1000μl；

2）毛样DNA提取液B

175mM的HC l16.7μl，100mM的Tris-HCl(pH8.5)500μl，ddH₂O483.3 μl；

3）PCR扩增液

BMPR-IB基因的上下游引物序列参照文献Wilson（2001）发表的“Highly  prolific Booroola sheep have a mutation in the intracellular kinase  doma in of bone morphogenetic protein IB receptor(ALK-6)that is expressed  in both oocytes and granulosa cells”，由上海生物工程技术有限责任公司 合成;上游引物序列：5'GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG3'；下游引物序列：5' CAAGATGTTTTCATGCCTCATCAACACGGTC3'；

20.0μl的PCR扩增反应体系中除DNA模板1.5μl外：2×Taq PCR MasterMix10.0μl，ddH₂O 7.7μl，10mM的上下游引物各0.4μl；

4）限制性内切酶Ava II

10U/μl，限制性内切酶Ava II的酶切位点为：5’...G↓G W C C...3’ 3’...C C W G↑G...5’

5）10×Buffer R

100mM Tris-HCl(pH8.5)，100mM MgCl₂，1M KCl，1mg/ml BSA；

6）染料

6×RNA/DNA Loading buffer；

7）ddH₂O

8）说明书

对运用试剂盒进行检测BMPR-IB多胎基因A746G位点试验的试剂准备、操 作步骤、注意事项等进行了详细说明；

其中对绵羊繁殖力基因的检测：

1）毛样DNA的提取：

用镊子或眉夹拔取羊尾根部的的粗毛（带毛根）20根，放入自封袋中，标 号，-20℃保存；

取15根明显带有毛囊的毛样，用70％乙醇清洗2次，蒸馏水清洗2次，在 根部用剪刀（已消毒）剪切约0.4cm，放入0.2ml离心管中离心，3500rpm， 8s；

加15μl毛样DNA提取液A，漩涡混合，瞬时离心，其条件为3500rpm， 7s；

用如下程序进行热循环：75℃1min，80℃2min，85℃1min，95℃1min， 97℃5min；

从PCR仪上取下，加入15μl毛样DNA提取液B，漩涡混合，-20℃保存；

瞬时离心，其条件为3500rpm，9s，取上清作为DNA模板，可用于PCR扩增；

2）PCR扩增：

将1.5μl DNA模板加入对应标号的PCR管中，再加入18.5μl PCR扩增 液，弹去气泡，震荡混匀，瞬时离心，其条件为3500rpm，10s；

放入设定好程序的PCR仪中，反应程序如下表：

用1.5%的琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物检测，电压120V，电泳30min， EB染色，凝胶成像系统成像；

检测结果表明PCR扩增产物大小符合预期，条带清晰，无杂带，符合要求， -20℃保存，酶切备用；

3）PCR-RFLP检测：

酶切反应体系（10.0μl）：ddH₂O 2.5μl，10×Buffer R 2.0μl，限制 性内切酶Ava II 0.5μl，PCR扩增产物5.0μl；

放入37℃恒温箱消化4h；

用2.5%的琼脂糖凝胶电泳进行酶切产物检测，电压120V，电泳30min， EB染色，凝胶成像系统成像；

基因判型：酶切消化产物大小为140bp时，即判定为++基因型；酶切消化 产物大小为140bp、110bp、30bp时，即判定为B+基因型；酶切消化产物大小为 110bp、30bp时，即判定为BB基因型，BB和B+基因型说明该个体的BMPR-IB多 胎基因在A746G位点存在突变，是多胎基因的携带者，与基因型为++的个体相 比在遗传基础上具有更高的繁殖力。

本试验所用三羟甲基氨基甲烷，即Tris-base，由庄盟生物（BG05S）提供； 2×Taq PCR Master Mix由博迈德生物（PC0912）提供；限制性内切酶Ava II、 10×Buffer R由MBI Fermentas公司（#ER0311）提供；6×RNA/DNA Loading buffer 由博迈德生物（EP01）提供；ddH₂O由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司 （PER018）提供；DL2000DNA Marker由庄盟生物（ZM404-1）提供；EB由天根 生化科技有限公司(#RT203)提供；3-18K高速冷冻离心机产自SIGMA公司；JY04S 凝胶成像仪产自北京君意东方电泳设备有限公司。