公开/公告号CN102721781A
专利类型发明专利
公开/公告日2012-10-10
原文格式PDF
申请/专利号CN201210216725.5
申请日2012-06-27
分类号G01N30/89(20060101);
代理机构
代理人
地址 100080 北京市海淀区中关村大街27号中关村大厦14层大北农集团
入库时间 2023-12-18 06:47:36
法律状态公告日
法律状态信息
法律状态
2019-02-12
专利权的转移 IPC(主分类):G01N30/89 登记生效日:20190117 变更前: 变更后: 变更前: 变更后: 申请日:20120627
专利申请权、专利权的转移
2016-08-03
授权
授权
2015-02-18
实质审查的生效 IPC(主分类):G01N30/89 申请日:20120627
实质审查的生效
2012-10-10
公开
公开
技术领域
本发明涉及乳酸菌发酵产物检测领域,特别涉及一种快速测定 乳酸菌发酵产物有机酸种类和产量的方法。
背景技术
目前对乳酸菌发酵液中有机酸种类和产量的测定还没有统一的 标准。故建立一种快速测定乳酸菌产有机酸产量的方法具有重要的 意义。乳酸菌的培养基中一般以糖类物质作为碳源,在细菌生长代 谢过程中会将培养基中的碳源物质分解成为甲酸、乙酸、丙酸、乳 酸等有机酸,测定这些有机酸的成分、含量及其在发酵过程中的变 化,对了解乳酸菌的代谢特性和发酵过程中代谢产物的监控都是非 常有用的。目前,有机酸的检测方法主要有分光光度法、酶法、薄 层色谱法、气相色谱法、离子色谱法和液相色谱法。分光光度法是 以有机酸和一些特定物质反应能生成有色物质为机理测定有机酸含 量,该法易受干扰,通常需要将提取液进行沉淀、离子交换树脂等 前处理,步骤繁冗。酶法虽然特异性较强,能够测定有机酸的构 型,但是每次只能测定一种有机酸,比较耗时。气相色谱法不仅需 要通过液液萃取将有机酸萃取到有机相中,还需进行柱前衍生化以 提高其挥发性,且常因为衍生化反应不易定量而直接影响测定结果 的准确性。离子色谱法虽然对于样品预处理的要求比较简单,但高 浓度的无机离子可能会干扰有机酸根离子的测定。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提供一种快速测定乳酸菌发酵产物有 机酸种类和产量的方法。
本发明的快速测定乳酸菌发酵产物有机酸种类和产量的方法,包 括分别制备样品溶液和标准品溶液,用反相HPLC梯度洗脱法测定 乳酸菌发酵产物中有机酸的种类和含量,其中,流动相A液为甲醇, 流动相B液为0.01M的磷酸二氢钠水溶液,0~9.5min为100%B液, 9.5~10min A液升至55%,B液降至45%,10~13min保持55%A液, 45%B液,13~15min A液降至45%,B液升至55%,15~25min保持 55%A液,45%B液,25~28min B液升至100%,28~30min保持 100%B液。
其中,所述的反相HPLC的色谱条件为:色谱柱为C18柱, 250mm×4.6mm,5μm,采用低压梯度洗脱,检测波长为215nm,柱 温30~40℃,采样时间为30min。优选地,所述的柱温为35℃。
其中,所述的样品溶液制备方法为:取乳酸菌发酵液1mL,加入 体积分数50%的硫酸200μL,10000r/min离心5min,取上清液100μL 稀释至500μL,经0.45μm滤膜过滤。
其中,所述的标准品溶液制备方法为:分别取有机酸标准品,加 入水配成50mg/mL、100mg/mL或150mg/mL母液备用,使用时混 合并稀释至所需浓度,经0.45μm滤膜过滤。所述的标准品为酒石 酸、氨基丁酸、乙酸、乳酸、柠檬酸、丙酸、丁酸。
其中,梯度洗脱流速0~10min为0.7mL/min,10~30min为1 mL/min。
其中,所述的0.01M磷酸二氢钠水溶液pH值为2.8~3.0。
其中,进样量为10μL。
本发明采用反相HPLC低压梯度洗脱测得乳酸菌发酵产有机酸 种类和含量,可以做到7种有机酸基线分离、峰形良好。本发明方法 简便、迅速,灵敏度高,重现性好。
附图说明
图1为7种有机酸混合标准品色谱图。
图2为干酪乳杆菌发酵液色谱图。
图3为植物乳杆菌发酵液色谱图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。
实施例1标准品的HPLC
1.仪器与样品
LC-20A(日本岛津)高效液相色谱仪,BT25S型电子天平 (d=0.01mg赛多利斯科学仪器(北京)有限公司),KQ5200B型超 声清洗器(江苏省昆山市超声仪器有限公司);色谱甲醇(Fisher Scientific),水(18.2MΩ.cm Millipore Rios系列),其他试剂均为分 析纯。
乳酸菌发酵产有机酸标准品为酒石酸、氨基丁酸、乙酸、乳 酸、柠檬酸、丙酸、丁酸(Sigma试剂)。
2.方法与结果
2.1标准品溶液的制备
分别取有机酸标准品,加入超纯水配成100mg/mL或 50mg/mL、150mg/mL母液备用,使用时混合并稀释至所需浓度,经 0.45μm滤膜过滤后分析。
2.2色谱条件与系统适用性试验
色谱条件为:色谱柱为C18柱(250mm×4.6mm,5μm,GL Sciences Inc.),流动相为甲醇-0.01M的磷酸二氢钠水溶液,其中流 动相A液为甲醇,流动相B液为0.01M的磷酸二氢钠水溶液(浓磷 酸调节pH值为2.8~3.0),梯度洗脱,梯度洗脱程序见表1,检测波 长为215nm,柱温35℃,进样量为10μL,记录时间为30min。在上 述色谱条件下,标准品混合色谱图见图1。从图1中可以看出,在本 试验条件下可以做到7种有机酸基线分离且峰形良好。
表1梯度洗脱程序
实施例2样品的HPLC分离
乳酸菌为干酪乳杆菌和植物乳杆菌。
分别取干酪乳杆菌和植物乳杆菌的发酵液1mL,加入50%硫酸 200μL,10000r/min离心5min,取上清液100μL稀释至500μL,经 0.45μm滤膜过滤后分析。
将制备好的样品放入自动进样器的样品架上,每个样品重复3 次进样、每次进样10μL,HPLC的色谱条件以及洗脱程序与实施例1 相同。干酪乳杆菌和植物乳杆菌的色谱图分别如图2和图3所示。从 图2、图3中可以看出,在本试验条件下可以做到发酵液产有机酸基 线分离且峰形良好,且重复性好。进样后根据峰面积用标准曲线法计 算样品中有机酸含量,取其平均值为平均百分含量,结果见表2。由 表2可以看出,在本实施例中的2种发酵液样品中检测到3种有机酸 的含量。
表2乳酸菌发酵液中各有机酸含量 单位:mg/mL
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领 域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以 做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
机译: 一种新型的乳酸菌,在低温下表现出良好的生长,乳酸链球菌素的高产量,优异的糖类利用率,产生γ-氨基丁酸,并以高产量的方法和技术使用γ-氨基丁酸来防止酒精燃烧。
机译: 一种用韩式乳酸菌的双歧杆菌K-110制备富含#-氨基丁酸和植物雌激素的大豆发酵产物的方法
机译: 一种用韩式乳酸菌的双歧杆菌K-110制备富含#-氨基丁酸和植物雌激素的大豆发酵产物的方法