电喷雾萃取电离串联质谱快速检测尿中1-OHP的方法

摘要

本发明涉及一种电喷雾萃取电离串联质谱快速检测尿中1-OHP的方法，特别涉及尿中1-OHP的常压电离源质谱检测方法，属于多环芳烃生物标志物的分析检测手段，操作步骤是：（1）1-OHP的母液的配制；（2）1-OHP标液的配制；（3）加标尿样的准备；（4）EESI源参数的设置；（5）串联质谱参数的设置；（6）样品检测；（7）数据处理。本发明能在无需样品前处理条件下直接测定尿中1-OHP，改善了现有技术前处理过程繁琐、分析周期长的不足。该法具有快速、抗基质干扰等特点，尤其适用于快速筛查暴露人群尿中1-OHP存在情况，对PAHs暴露人群的健康风险研究意义重大。

说明书

技术领域

本发明涉及尿中1羟基芘（1-OHP）的检测方法，特别涉及一种电喷雾萃取电离串联质谱快速检测尿中1-OHP的方法，属于多环芳烃生物标志物的分析检测手段。

背景技术

尿中1-OHP是致癌性环境污染物多环芳烃（PAHs）的重要生物标志物，在人体对PAHs暴露及健康风险评价研究（如PAHs分子流行病学）中意义重大。

目前文献报道的尿中1-OHP的分析方法包括：高效液相色谱荧光光谱法（high performance liquid chromatography fluorescence detection，HPLC-FD）、RTF、SFS、共振光散射法（resonance light scattering spectroscopy，RLS）、气相色谱（氢火焰离子化检测器）（gas chromatography flame ionization detection，GC-FID）、气相色谱质谱法（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）、液相色谱质谱法（liquid chromatography mass spectrometry，LC-MS）、毛细管电泳（紫外检测器）（capillary electrophoresis）、化学发光法（chemiluminescence）、电化学法（electrochemistry）、光谱电化学法（spectroelectrochemical sensing）、免疫学法（immunologic methods）、放射免疫学法（radioimmunoassay）、免疫化学法（immunochemical assay）等。

在上述方法中，尽管上述分析检测技术均能实现OH-PAHs的定性定量分析，且灵敏度、准确度等结果互可比拟。但是考虑到操作简易程度、仪器设备可获取性、技术成熟度等因素，HPLC是目前最常用的检测技术。另一方面，基于MS检测技术的LC-MS（包括LC-MS/MS）和GC-MS（包括GC-MS/MS），由于MS检测结果可以提供分子结构信息，因此在方法特异性上具有其它检测技术不可比拟的优势。此外，因为GC-MS和LC-MS已在实验室较为普及，因此也是目前常用的OH-PAHs检测手段。

然而，现有尿中1-OHP分析方法普遍存在样品前处理和色谱环节耗时较长，无法满足PAHs健康风险评价（如PAHs分子流行病学）中高通量样品分析的迫切需求。

发明内容

本发明的目的在于避免现有尿中1-OHP检测方法前处理过程繁琐、分析周期较长而提供一种电喷雾萃取电离串联质谱快速检测尿中1-OHP的方法。本发明可实现尿中1-OHP的快速定量，能够满足PAHs健康风险评价（如PAHs分子流行病学）中高通量样品分析的迫切需求。

本发明所述的检测方法是借助电喷雾萃取电离（EESI）源和商品化仪器LTQ-XL型线性离子阱质谱仪，进行无样品前处理条件下、尿中1-OHP的快速检测。 

本发明是通过如下技术方案实现的：

（1）1-OHP母液的配制：准确称取10.0 ± 0.5 mg 1-OHP，置入大瓶中，加入甲醇溶解，得到浓度为100 ± 5mg L^–1的1-OHP母液。将母液转移至棕色小瓶中，4 ± 0.2 ^oC密封避光保存。

（2）1-OHP标液的配制：移取有效体积1-OHP母液，用甲醇稀释为浓度20 ± 1μg L^–1的1-OHP标液，将标液转移至棕色小瓶中，4 ± 0.2 ^oC密封避光保存。

（3）加标尿样的准备：取有效体积1-OHP母液（100 mg L^–1），用尿样逐级稀释，得到1-OHP加标浓度为0.01–5 mg L^–1的加标尿样。加标后尿中1-OHP浓度约为未加标前尿（水解尿样）1-OHP浓度的1.5–3.0倍最佳。

加标尿样是为EESI-MS定量测定尿中1-OHP时所用的标准加入法所备。配制加标尿样所用的尿样为水解后的尿样。采用水解尿样的原因是，尿中排出的1-OHP主要是结合态1-OHP（如1-OHP和葡糖苷酸的结合物），需水解尿样后，才可得到游离态1-OHP，进行检测。

尿样水解流程为：用1-mL 移液管取0.5 mL盐酸（0.1 M），加入玻璃离心管中；用2-mL 移液管取1.5 mL的醋酸钠-醋酸缓冲溶液（0.5 M，pH = 5），加入玻璃离心管中；用5-mL 移液管取4 mL实际尿样，加入玻璃离心管中；用25-μL微量进样针取10μLβ-葡萄糖醛酸酶，加入玻璃离心管中；将离心管置于水浴锅中37 ^oC恒温水浴过夜。

（4）EESI源参数的设置：ESI溶剂管路和样品溶液管路间的距离与角度分别约为1–2 mm和40–70^o，二者与质谱仪金属离子传输管入口的距离和角度分别约为6–15 mm和145–160^o。初级ESI溶剂为含有1.0 × 10^–3–1.0 × 10^–2 M醋酸铵或7.0 × 10^–3–1.5 × 10^–1 M氨水的甲醇水混合溶剂（体积比大于95%），流速1–4 μL min^–1；样品溶液流速4–7μL min^–1；ESI电压– 3– – 4 kV；金属离子传输管温度350–400 ^oC；样品雾化气为高纯氮气（纯度99.999%），压力1.0–1.4 MPa。

（5）串联质谱（MS/MS）参数的设置：负离子检测模式；母离子m/z 217；母离子隔离宽度2.0；活化值Q（AQ）为0.40–0.50，碰撞能量（NCE）为35–55%，碰撞时间 30 ms；质量数扫描范围50–350；离子阱最大离子注入时间 200 ms；实际注入离子量由自动获取控制（AGC）确定；碰撞气He气（离子阱内压力0.82–0.83 × 10^–5 Torr）；离子透镜等其它MS条件由LTQ-XL-MS自动优化得到。

（6）样品检测：在相同EESI-MS/MS条件下，分别分析溶剂空白、1-OHP标液、未加标尿样和梯度浓度加标尿样；每次进样约0.5 min，平行进样6次；测定MS/MS谱图中m/z 217、m/z 189处质谱峰强度，进行定性定量分析。m/z 189处质谱峰是1-OHP分子离子二级质谱碎片离子。

（7）数据处理：包括（a）定性分析和（b）定量分析两部分。

（a）定性分析：以1-OHP标液MS/MS谱图中m/z 189和m/z 217处质谱峰强度比值为参照，对比样品MS/MS谱图中m/z 189和m/z 217处质谱峰强度比值，确认样品中1-OHP是否被检出。

（b）定量分析：采用标准加入法定量尿中1-OHP。同时，为减少EESI源和质谱仪长期

操作对1-OHP信号响应的影响、提高分析结果的稳定性，在初级ESI溶剂中加入氘代1-OHP（D₉-1-OHP）（0.1 mg L^–1）。MS/MS检测D₉-1-OHP 的目标离子为D₉-1-OHP的碎片离子[M–H–28]^–（m/z 198），CID分析条件与1-OHP相同。

以未加标/加标尿样MS/MS谱图中m/z 189和m/z 198处质谱峰强度比值为纵坐标（Y），以1-OHP加标浓度为横坐标（X），对实验数据进行线性回归分析，得到线性回归方程Y = aX + b。Y ＝0时得到X的绝对值                                                ，此绝对值即为尿中1-OHP浓度。

本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著进步：

本发明采用了新型常压下直接质谱检测技术——电喷雾萃取电离串联质谱方法，尿样无需前处理即可直接分析，简化了分析流程，缩短了分析周期，提高了分析效率，如单次检测时间仅需0.5 min，单个样品重复测定6次可在8.0 min内完成。定性分析中采用MS/MS技术，提高了方法的选择性和准确性；定量分析中采用标准加入法，减少了基质干扰,提高了方法的稳定性。如EESI-MS/MS测定尿中1-OHP的相对标准偏差小于6.4%；当尿中1-OHP浓度为0.5–5 mg L^–1时，1-OHP信号强度与尿中1-OHP浓度线性相关，R² = 0.9987；尿中1-OHP回收率为96(±2)%–108(±2)%；。

本发明能在无需样品前处理条件下快速半定量测定尿中1-OHP，改善了现有方法前处理过程繁琐、分析周期长的不足。该方法具有快速、抗基质干扰等特点，尤其适用于快速筛查暴露人群尿中1-OHP存在情况，对PAHs暴露人群的健康风险研究意义重大。

附图说明

图1为本发明EESI-MS/MS分析样品时的选择离子流（m/z 189）色谱图。

图2为本发明1-OHP的MS/MS谱图。

图3为本发明D₉-1-OHP的MS/MS谱图。

图4为本发明标准加入曲线。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的优选实施例作详细说明，本发明不仅局限于以下实施例，实施例中实验条件仅作为典型情况的说明，并非对本发明的限定。

本实施例使用的电离源为东华理工大学江西省质谱科学与仪器重点实验室制造的电喷雾萃取电离源，质谱仪为美国Finnigan公司的LTQ-XL型线性离子阱质谱仪，数据处理系统为美国Finnigan公司的Xcalibur数据处理系统。

本电喷雾萃取电离串联质谱快速检测尿中1-OHP的方法，具体操作步骤如下：

（1）1-OHP母液的配制：准确称取10.0 ± 0.5 mg 1-OHP，置入100-mL容量瓶中，加入甲醇溶解，得到浓度为100 ± 5 mg L^–1的1-OHP母液。将母液转移至20-mL棕色小瓶中，4 ± 0.2^oC密封避光保存。

（2）1-OHP标液的配制：移取有效体积1-OHP母液，用甲醇稀释为浓度20 ± 1μg L^–1的1-OHP标液，将标液转移至20-mL棕色小瓶中，4 ± 0.2 ^oC密封避光保存。

（3）加标尿样的准备：未加标尿样中1-OHP浓度为0.5 mg L^–1。取有效体积1-OHP母液（100 mg L^–1），加入尿样中，得到1-OHP加标浓度为0.5和2 mg L^–1的加标尿样。配制加标尿样所用的尿样为水解后的尿样。

（4）EESI源参数的设置：ESI溶剂管路和样品溶液管路间的距离和角度分别约为1 mm和60^o，二者与质谱仪入口的距离和角度分别约为10 mm和150^o。初级ESI溶剂为含有1.0 ×10^–2 M醋酸铵的甲醇，流速1μL min^–1；样品溶液流速4μL min^–1；ESI电压– 3 kV；金属离子传输管温度400 ^oC；样品雾化气为高纯氮气（纯度99.999%），压力1.2 MPa。

（5）串联质谱（MS/MS）参数的设置：负离子检测模式；母离子m/z 217；母离子隔离宽度2.0；活化值Q（AQ）为0.40，碰撞能量（NCE）为40%，碰撞时间 30 ms；质量数扫描范围50–350；离子阱最大离子注入时间 200 ms；实际注入离子量由自动获取控制（AGC）确定；碰撞气He气（离子阱内压力0.82 × 10^–5 Torr）；离子透镜等其它MS条件由LTQ-XL-MS自动优化得到。

（6）样品检测：在相同EESI-MS/MS条件下，分别分析溶剂空白、1-OHP标液、未加标尿样和梯度浓度加标尿样；如图1示，每次进样约0.5 min，平行进样6次；测定图2所示MS/MS谱图中m/z 217和m/z 189处质谱峰强度以及图3所示MS/MS谱图中m/z 226和m/z 198处质谱峰强度。

（7）定性定量分析：如图2所示，以1-OHP标液MS/MS谱图中m/z 189和m/z 217处质谱峰强度比值为参照，对比样品MS/MS谱图中m/z 189和m/z 217处质谱峰强度比值，以确认样品中1-OHP是否被检出。如图2和3中所示的未加标/加标尿样MS/MS谱图中m/z 189和m/z 198处质谱峰强度比值为纵坐标（Y），以1-OHP加标浓度为横坐标（X），对实验数据进行线性回归分析。如图4示，得到线性回归方程Y = 0.00674X + 0.0037（R² = 0.9996），Y = 0时得到X的绝对值0.536 mg L^–1，即为EESI-MS/MS方法测得的尿中1-OHP的浓度。测定值与实际值相比，相对偏差为7.3%。

在整个分析过程中EESI源始终保持稳定，可以确保1-OHP检测结果的准确性和重现性。例如，在未进样的情况下（仅有初级ESI溶剂进入EESI源），m/z 198处质谱峰信号强度为1.18 × 10⁴（±523.2，n = 10)；进样时（初级ESI溶剂和样品溶液同时进入EESI源），信号强度为1.09 × 10⁴（±707.8，n = 10）。