乳糖在重组大肠杆菌高密度发酵表达hIGF-1中的应用

摘要

本发明公开一种乳糖在重组大肠杆菌高密度发酵表达hIGF-1中的应用，尤其是以α-单水化合物形式存在的商品乳糖在重组大肠杆菌高密度发酵表达hIGF-1中的应用。乳糖能够诱导基于乳糖操纵子原理构建的含有外源hIGF-1原核大肠杆菌表达系统高密度发酵表达hIGF-1，表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析分子量符合设计理论值，蛋白质免疫印迹分析结果提示诱导产物具有人源性IGF-1抗原活性，表明乳糖可以在重组大肠杆菌的高密度发酵中作为诱导剂诱导hIGF-1的表达。其表达成本低，表达效率高，且乳糖本身对人体无毒，因此可为安全、无毒的hIGF-1制备工艺的建立奠定基础，使其产业化生产成为可能。

说明书

技术领域

本发明属于乳糖应用领域，尤其涉及乳糖（分子式C₁₂H₂₂O₁₁）在重组大肠杆菌高密度发酵表达hIGF-1中的新用途。 

背景技术

人胰岛素样生长因子-1 (human Insulin-like growth factor-1，hIGF-1) 是人体内一种重要的促生长因子,具有许多生理学活性及潜在的药用价值。近年来，hIGF-1在治疗临床疾病方面比较认可的适应症包括Laron侏儒综合征、糖尿病、胰岛素抵抗综合征等多种顽疾，并取得了良好的效果。因此其临床应用价值日益受到人们的重视，显示出巨大的应用潜力，hIGF-1的制备成为国内外研发的热点之一。 

现代分子生物学技术的发展使hIGF-1的大量获得成为可能，目前国际上已经有人利用基因重组技术生产制备hIGF-1并作为药物开发，美国Insmed公司使用原核大肠杆菌系统表达获得hIGF-1，商品名为美卡舍明－林菲培（Mecasermin Rinfabate），已获得FDA批准用于治疗严重原发性hIGF-1缺乏患儿。近年来国内关于hIGF-1体外表达的报道也不少，但大多为实验室规模的研究，从我国国家食品药品监督管理局网站检索得知，目前国内尚无单位申报hIGF-1新药。 

高密度细胞培养技术（high cell density cultivation，HCDC)即高密度发酵技术，是为大规模生产重组蛋白而发展起来的一门发酵工艺，与传统的发酵技术相比，该技术可以减少培养体积、缩短生产周期、减少设备投资等，从而达到降低生产成本、提高生产效率的目的，这为高效生产hIGF-1蛋白提供了新的思路。然而，国内公开报道的关于hIGF-1蛋白基因工程菌高密度发酵的工艺尤其是在诱导剂的使用上还存在一定不足与缺陷。 

在乳糖操纵子调控机理基础上设计和构建的表达系统常用的诱导剂是非代谢性乳糖类似物异丙基-β-D-巯基半乳糖苷（isopropylthio-β-D-galactoside，IPTG），其诱导效率高，只需要少量即可对lacUV5与T7lac等强启动子产生持久的诱导作用，从而高效表达重组蛋白。然而，IPTG对人体有潜在毒性且价格昂贵，应用于基因工程新药工业化生产存在成本较高及产品中的IPTG残留可能造成人体损害等局限性，有些国家不提倡使用或甚至明文规定在工业化生产人重组蛋白质的过程中不得使用IPTG，因此IPTG在基因工程新药hIGF-1的工业化制备中的应用受到限制。目前国内公开报道的基于乳糖操纵子机理构建的工程菌高密度发酵表达hIGF-1使用的诱导剂均为IPTG，所以一般仅限于实验室研究水平，难以实现进一步的产业化大规模生产。要构建能够进一步实现产业化生产并且具有成药可能性的hIGF-1制备工艺，必须寻找在高密度发酵表达过程中能够代替IPTG的诱导剂。 

乳糖（lactose）是一种无毒、价格低廉的二糖，易溶于水，有多种存在形式，商品化的乳糖主要以α-单水化合物形式存在，又称为α-乳糖。作为原核细胞的常用碳源，乳糖对乳糖操纵子也具有天然的诱导作用，也可用于诱导宿主菌表达重组产物，但其诱导效率不如IPTG。近年来国内外均有学者尝试使用乳糖代替IPTG作为诱导剂诱导外源蛋白在细菌中的表达，本课题组于国内首次公开报道使用乳糖诱导大肠杆菌在摇瓶水平表达hIGF-1的研究[杨渐，俞昌喜，廖联明，廖虹婷.乳糖诱导人胰岛素样生长因子-1在大肠杆菌中的表达，海峡药学，2010，22（8）：248-252]，但乳糖在重组大肠杆菌高密度发酵表达hIGF-1中作为诱导剂的应用未见文献报道。究其原因主要是乳糖本身可被细菌利用作为代谢能源，使用乳糖作为诱导剂，其作用机制较为复杂，诱导条件不容易掌握，需要对诱导剂浓度、诱导时机、诱导时间、添加方式等诱导条件进行探索研究后才能使其能够稳定高效诱导重组大肠杆菌高密度发酵表达hIGF-1。 

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种乳糖尤其是以α-单水化合物形式存在的商品乳糖（即α-乳糖）乳糖在制备诱导重组大肠杆菌高密度发酵表达hIGF-1的诱导剂中的应用，即在重组大肠杆菌高密度发酵表达hIGF-1中作为诱导剂的使用方法，包括乳糖诱导剂量、诱导时机、诱导时长、添加方式等，即乳糖作为诱导剂在重组大肠杆菌高密度发酵表达hIGF-1中的应用。 

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：乳糖尤其是以α-单水化合物形式存在的商品乳糖（即α-乳糖）作为诱导剂在重组大肠杆菌高密度发酵表达hIGF-1中的应用，即乳糖在制备诱导重组大肠杆菌高密度发酵表达hIGF-1的诱导剂中的应用。 

所述的乳糖是由半乳糖通过α-1,4-糖苷键连接葡萄糖而形成的二糖，其分子式为C₁₂H₂₂O₁₁，结构式为： 

乳糖尤其是以α-单水化合物形式存在的商品乳糖（即α-乳糖）可应用于诱导重组大肠杆菌在高密度发酵中表达hIGF-1。

以本课题组构建的含有hIGF-1基因重组质粒的工程菌为对象，在5L自控式发酵罐上进行高密度发酵培养。实验结果表明，使用乳糖作为诱导剂，在适当的生长条件下重组工程菌可稳定高效表达重组蛋白hIGF-1，为产业化生产hIGF-1蛋白产品奠定了基础，提示乳糖可以作为诱导剂诱导重组大肠杆菌在高密度发酵中稳定高效表达hIGF-1。 

本发明优选技术方案为：通过探索优化诱导条件，实现作为诱导剂的其结构式如下的乳糖尤其是以α-单水化合物形式存在的商品乳糖（即α-乳糖）在诱导重组大肠杆菌高密度发酵表达hIGF-1的应用。 

本发明的有益效果是：

1.乳糖在高密度发酵中可以代替IPTG作为诱导剂诱导基于乳糖操纵子机理构建的表达系统稳定高效表达hIGF-1。

2.有利于建立hIGF-1低成本、安全无毒的制备工艺。与IPTG相比，乳糖价格低廉得多，经估算按照通常的IPTG使用量，在1m³的培养液进行诱导生产，消耗的IPTG成本约为1700美元，若使用乳糖，其成本仅为IPTG的3%； IPTG对人体的潜在毒性限制了其作为诱导剂在产业化生产中的应用，乳糖则没有毒性，其在产品中的少量残留对人体影响极小。 

3.潜在的经济效应。hIGF-1对许多疾病如矮小症、胰岛素抵抗性糖尿病、周围神经损伤等具有潜在的临床治疗作用，其中周围神经损伤临床发病率高，致残严重，且缺乏有效治疗药物，因此安全有效的治疗周围神经损伤药物具有重大的市场需求，乳糖在高密度发酵表达hIGF-1的应用可为安全、无毒的hIGF-1制备工艺的建立奠定基础，使其产业化生产成为可能，有望开发成为具有我国独立自主知识产权的hIGF-1基因工程新药。 

附图说明

图1A 为摇瓶条件下乳糖诱导工程菌E.coli DH5α/pET32a(IGF-1)在LB培养基表达hIGF-1的诱导浓度和hIGF-1相对表达量的关系图。图示乳糖浓度与hIGF-1相对表达量关系，横坐标为乳糖浓度（质量体积百分比），纵坐标为hIGF-1相对表达量（占总菌体表达蛋白量的百分比）。 

图1B 为hIGF-1表达水平的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱，箭头所示位置即为表达产物hIGF-1融合蛋白（下同），图中1为蛋白质分子质量标准，2-11分别为乳糖浓度为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%和2.0%时蛋白表达水平，12为未加乳糖的阴性对照。 

图2 A 为摇瓶条件下乳糖诱导工程菌E.coli DH5α/pET32a(IGF-1)在LB培养基表达hIGF-1的菌株诱导起始生长量和hIGF-1相对表达量的关系图，图示菌株诱导起始生长量与hIGF-1相对表达量关系，横坐标为菌体生长的OD₆₀₀值，纵坐标为hIGF-1相对表达量。 

图2B 为hIGF-1表达水平的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱，图中1为蛋白质分子质量标准，2-7为工程菌分别生长0.5h、1.0h、1.5h、2.0h、2.5h和3.0h至OD₆₀₀为0.1、0.2、0.5、0.7、1.2和1.5时加入终浓度为0.8%乳糖开始诱导的蛋白表达水平，8为阴性对照。 

图3A 为摇瓶条件下乳糖诱导工程菌E.coli DH5α/pET32a(IGF-1)在LB培养基表达hIGF-1的诱导时长和hIGF-1相对表达量的关系图。图示乳糖诱导时长与hIGF-1相对表达量关系，横坐标为诱导时长（小时），纵坐标为hIGF-1相对表达量。 

图3B 为hIGF-1表达水平的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱，图中1为蛋白质分子质量标准，2为阴性对照，3-13为在对数生长中期加入终浓度为0.8%乳糖分别诱导1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、24小时的蛋白表达水平。  

图4 为乳糖诱导工程菌E.coli DH5α/pET32a(IGF-1)表达产物的免疫印迹分析，以兔抗人IGF-1多克隆抗体为一抗，羊抗兔IgG为二抗进行反应，图中1-4为乳糖诱导产物，5为阴性对照。

图5 为摇瓶条件下乳糖诱导工程菌E.coli DH5α/pET32a(IGF-1)在发酵培养基（由本课题组经碳氮源正交试验获得，下同）中表达hIGF-1的诱导浓度和hIGF-1相对表达量的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱，图中1为蛋白质分子质量标准，2-10分别为乳糖浓度分别为0.25%、0.5%、0.75%、1%、1.5%、2%、3%、4%、6%的蛋白表达水平。 

图6A 为摇瓶条件下乳糖诱导工程菌E.coli DH5α/pET32a(IGF-1)在发酵培养基表达hIGF-1的菌株诱导起始生长量和hIGF-1相对表达量及菌体密度OD₆₀₀值关系图。图示在菌株不同生长时期加入乳糖诱导与菌体密度的关系图。 

图6B 为不同菌株起始生长量hIGF-1表达电泳图，图中1为蛋白质分子质量标准，2-5分别为工程菌生长至对数初期、对数中期、对数末期及平台期加入1%乳糖开始诱导的蛋白表达水平。 

图7A 为在5L发酵罐水平乳糖诱导工程菌E.coli DH5α/pET32a(IGF-1)高密度发酵表达hIGF-1的诱导浓度和工程菌菌体密度OD₆₀₀值及hIGF-1相对表达量的关系图。图示乳糖浓度对菌体生长的影响，横坐标为发酵培养时间（小时），纵坐标为菌体密度OD₆₀₀值，不同系列分别表示乳糖浓度为1%、2%、3%、4%。 

图7B为乳糖浓度对hIGF-1相对表达量的影响，横坐标为乳糖浓度（质量体积百分比），纵坐标为hIGF-1相对表达量。 

图8 为在5L发酵罐水平3%乳糖诱导工程菌E.coli DH5α/pET32a(IGF-1)高密度发酵表达hIGF-1的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图中1为蛋白质分子质量标准，2-7分别为在对数生长后期加入3%乳糖诱导1、2、3、4、5、6小时的蛋白表达水平。 

图9 为乳糖添加方式与工程菌E.coli DH5α/pET32a(IGF-1)菌体高密度发酵生长密度OD₆₀₀值关系图。横坐标为发酵培养时间（小时），纵坐标为菌体密度OD₆₀₀值。 

图10A 为摇瓶条件下乳糖诱导工程菌E.coli BL₂₁(DE3)/pET32a(hIGF-1)在LB培养基表达hIGF-1的诱导浓度和hIGF-1相对表达量的关系图。图示乳糖浓度与hIGF-1相对表达量关系，横坐标为乳糖浓度（质量体积百分比），纵坐标为hIGF-1相对表达量（占总菌体表达蛋白量的百分比）。 

图10B 为hIGF-1表达水平的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱，箭头所示位置即为表达产物hIGF-1融合蛋白（下同），图中1-10分别为乳糖浓度为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%、1.6%、1.8%和2.0%时蛋白表达水平，11为未加乳糖的阴性对照。 

图11A 为摇瓶条件下乳糖诱导工程菌E.coli BL₂₁(DE3)/pET32a(hIGF-1)在LB培养基表达hIGF-1的菌株诱导起始生长量和hIGF-1相对表达量的关系图。图示菌株诱导起始生长量与hIGF-1相对表达量关系，横坐标为菌体生长的OD₆₀₀值及生长时间，纵坐标为hIGF-1相对表达量。 

图11B 为hIGF-1表达水平的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱，图中1-8为工程菌分别生长0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0小时加入终浓度为0.8%乳糖开始诱导的蛋白表达水平，9为阴性对照。 

图12A 为摇瓶条件下乳糖诱导工程菌E.coli BL₂₁(DE3)/pET32a(hIGF-1)在LB培养基表达hIGF-1的诱导时长和hIGF-1相对表达量的关系图。图示乳糖诱导时长与hIGF-1相对表达量关系，横坐标为诱导时长（小时），纵坐标为hIGF-1相对表达量。 

图12B 为hIGF-1表达水平的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱，图中1-10为在菌株生长2.5小时加入终浓度为0.8%乳糖分别诱导0、1、2、3、4、5、6、7、8、24小时的蛋白表达水平，11为阴性对照。 

图13 为乳糖诱导工程菌E.coli BL₂₁(DE3)/pET32a(hIGF-1)表达产物的免疫印迹分析，以兔抗人IGF-1多克隆抗体为一抗，羊抗兔IgG为二抗进行反应，图中1为阴性对照，2-5为乳糖诱导产物。 

图14A 为摇瓶条件下乳糖诱导工程菌E.coli BL₂₁(DE3)/pET32a(hIGF-1)在发酵培养基（由本课题组经碳氮源正交试验获得，下同）中表达hIGF-1的诱导浓度和hIGF-1相对表达量的关系图。图示乳糖浓度和hIGF-1相对表达量关系，横坐标为乳糖浓度（质量体积百分比），纵坐标为hIGF-1相对表达量。 

图14B 为hIGF-1表达水平的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱，图中1-8分别为乳糖浓度为0.25%、0.5%、0.75%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%及5.0%时蛋白表达水平。 

图15A 为摇瓶条件下乳糖诱导工程菌E.coli BL₂₁(DE3)/pET32a(hIGF-1)在发酵培养基表达hIGF-1的菌株诱导起始生长量和hIGF-1相对表达量及菌体密度OD₆₀₀值关系图。图示在菌株不同生长时期加入乳糖诱导与菌体密度的关系图。 

图15B 不同菌株起始生长量hIGF-1表达电泳图，图中1-4分别为工程菌生长至对数初期、对数中期、对数末期及平台期加入1%乳糖开始诱导的蛋白表达水平。 

图16A 为在5L发酵罐水平乳糖诱导工程菌E.coli BL₂₁(DE3)/pET32a(hIGF-1)高密度发酵表达hIGF-1的诱导浓度和工程菌菌体密度OD₆₀₀值及hIGF-1相对表达量的关系图。图示乳糖浓度对菌体生长的影响，横坐标为发酵培养时间（小时），纵坐标为菌体密度OD₆₀₀值，不同系列分别表示乳糖浓度为1%、2%、3%、4%。 

图16B 为乳糖浓度对hIGF-1相对表达量的影响，横坐标为乳糖浓度（质量体积百分比），纵坐标为hIGF-1相对表达量。 

图17 为重组工程菌E.coli BL₂₁(DE3)/pET32a(hIGF-1)在5L发酵罐水平使用3%乳糖诱导其高密度发酵表达hIGF-1的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。图中1-6分别为在对数生长中期加入3%乳糖诱导1、2、3、4、5、6小时的蛋白表达水平。具体实施方式

以下结合实施例对本发明进行进一步的说明。

实施例1 乳糖诱导E.coli DH5α/pET32a(IGF-1)高密度发酵表达hIGF-1

课题组前期工作利用Novagen公司出品的pET载体构建并保存含有外源hIGF-1基因的重组工程菌E.coli DH5α/pET32a(hIGF-1)，经基因测序确证并在IPTG诱导下可表达hIGF-1[廖联明，杨渐，俞昌喜，许盈. 人胰岛素样生长因子-1的原核表达和纯化，中国生化药物杂志，2009，30（4）：226-229]。实施例1以此工程菌为对象，使用乳糖代替IPTG诱导其高密度发酵表达hIGF-1，实现乳糖在重组大肠杆菌高密度发酵表达hIGF-1中的应用。

1 材料 

1.1菌株

含有pET32a（+）/hIGF-1重组质粒的工程菌E.coli DH5α/pET32a(IGF-1)，本实验室构建并保存。

1.2主要试剂 

胰蛋白胨、酵母提取物为Oxoid产品；氨苄青霉素购自北京鼎国生物技术公司；Tris碱为Biosharp产品；十二烷基磺酸钠（Sodium dodecyl sulfate，SDS）、Tween20、N,N,N',N'-四甲基乙二胺（N,N,N',N'-tetramethylethylene diamine，TEMED）购自生工生物工程（上海）有限公司；丙烯酰胺为Novon产品、双丙烯酰胺为Bioasia产品；兔抗人IGF-1多克隆抗体为Invitrogen产品；羊抗兔IgG、IPTG、过硫酸铵（Ammonium persulfate，AP）、蛋白质Marker、蛋白质SDS上样缓冲液、丽春红染色液、抗体稀释液、显色工作液等购自碧云天生物工程技术公司；甘油为上海联试化工试剂有限公司产品；葡萄糖为上海展云化工有限公司产品；氨水为汕头市西陇化工厂产品；抗泡剂Antifoum A为Sigma公司产品；α-乳糖及其他试剂均为国产分析纯产品。

1.3实验仪器 

稳压电泳仪电源为美国E-C公司产品；垂直电泳槽、转移电泳槽为北京六一仪器厂产品；GSP-9270隔水式电热恒温培养箱为上海博讯医疗设备厂产品；SHZ-82型台式恒温震荡器为上海国华实验设备厂产品；TS-2000A脱色摇床为江苏海门麒麟仪器厂产品；高压灭菌锅为江阴滨江医疗设备厂产品；精密酸度计为上海大普仪器厂产品；电子天平为瑞典梅特勒公司产品；水平恒温摇床为德国Therma公司产品；低温高速离心机为德国Therma公司产品；Bio Photometer 分光光度计、凝胶干燥机为Bio-Rad公司产品；凝胶成像分析系统为英国Syngene公司产品；Biostat B 发酵系统为德国Braun公司产品。

方法

首先在摇瓶条件下以乳糖代替IPTG诱导工程菌E.coli DH5α/pET32a(IGF-1)在LB培养基中表达hIGF-1，比较乳糖诱导浓度、诱导起始生长量、诱导时间等对表达的影响，分析乳糖作为诱导剂诱导hIGF-1融合蛋白在E.coli DH5α/pET32a(IGF-1)表达的可行性及一般规律；继而以此之为参考依据在摇瓶条件下使用乳糖诱导工程菌在发酵培养基中表达hIGF-1，比较不同诱导条件对表达的影响；最后在此基础上在5L自控式发酵罐进行工程菌E.coli DH5α/pET32a(IGF-1)的高密度发酵培养，以乳糖为诱导剂诱导hIGF-1表达，研究不同培养条件及诱导条件对工程菌生长和hIGF-1表达的影响，优化诱导条件实现乳糖在工程菌E.coli DH5α/pET32a(IGF-1)高密度发酵表达hIGF-1的应用。

检测方法： 

使用蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳技术凝胶分析软件BandScan5.0对乳糖诱导产物进行全菌蛋白及hIGF-1相对表达量分析，使用兔抗人IGF-1多克隆抗体为一抗，羊抗兔IgG为二抗对乳糖诱导工程菌E.coli DH5α/pET32a(IGF-1)表达的产物进行分析鉴定。

检测指标： 

（1）乳糖诱导工程菌E.coli DH5α/pET32a(IGF-1)表达产物的分子量

比较乳糖诱导组和未添加乳糖的阴性对照组全菌蛋白电泳图谱，比照蛋白质分子量标准观察乳糖诱导组诱导表达蛋白产物分子量是否与理论值相符。

（2）乳糖诱导工程菌E.coli DH5α/pET32a(IGF-1)表达产物的免疫原性 

对乳糖诱导组和未添加乳糖的阴性对照组菌液中全菌蛋白进行蛋白质免疫印迹分析，鉴定诱导产物是否具有人IGF-1抗性。

（3）观察乳糖诱导条件对hIGF-1表达的影响 

分别在摇瓶水平和5L发酵罐水平，使用乳糖作为诱导剂诱导工程菌E.coli DH5α/pET32a(IGF-1)表达hIGF-1，对不同诱导条件下全菌蛋白电泳图谱进行软件分析，观察不同诱导条件对hIGF-1相对表达量的影响，以获得最适合于工程菌E.coli DH5α/pET32a(IGF-1)高密度发酵表达hIGF-1的乳糖诱导条件。

3 结果 

3.1 乳糖诱导工程菌E.coli DH5α/pET32a(IGF-1)在LB培养基表达hIGF-1

①诱导产物分子量及免疫原性鉴定

经乳糖诱导，工程菌E.coli DH5α/pET32a(IGF-1)能表达分子量在30Kd左右的蛋白质（如图1A、图1B、图2A、图2B、图3A和图3B所示），和目的产物hIGF-1融合蛋白的理论推算值相符，未加乳糖的阴性对照组的相应位置则未看到该蛋白条带。转膜后使用兔抗人IGF-1多克隆抗体为一抗，羊抗兔IgG为二抗进行反应，免疫印迹分析结果如附图4所示，在乳糖诱导组可见特异性抗原抗体复合物条带，对照物则无，提示表达的融合蛋白具有hIGF-1抗原活性。

②乳糖浓度对hIGF-1表达的影响 

hIGF-1表达量随着乳糖终浓度的不同而改变，当乳糖终浓度为0.8%时乳糖诱导表达获得的hIGF-1融合蛋白产量占总蛋白的比值最大（60.8%），此后随着乳糖浓度的增加，其产量不再明显增加，甚至有所下降（如图1A、图1B所示）。

③诱导起始生长量对hIGF-1表达的影响 

如图2A、图2B所示，摇瓶条件下在工程菌在LB培养基中生长2小时至对数生长中期加入诱导剂乳糖可得到hIGF-1最大表达（50.1%）。

④诱导时长对对hIGF-1表达的影响 

乳糖诱导工程菌E.coli DH5α/pET32a(IGF-1)表达的hIGF-1融合蛋白相对表达量随诱导时长先升高后降低（如图3A、图3B所示），诱导4h时达到高峰（37.0%）。

3.2 乳糖诱导工程菌E.coli DH5α/pET32a(IGF-1)高密度发酵表达hIGF-1 

①乳糖诱导工程菌在发酵培养基中摇瓶表达hIGF-1

利用碳氮源正交试验获得适合重组工程菌E.coli DH5α/pET32a(IGF-1)生长的发酵培养基后，使用乳糖诱导其在发酵培养基中表达hIGF-1（分子量与前述相同）。如附图5所示，乳糖终浓度为1%时诱导结果最好，重组hIGF-1蛋白表达率为21.62%。

②发酵培养基中菌株诱导起始生长量对hIGF-1表达的影响 

根据发酵培养基中工程菌E.coli DH5α/pET32a(IGF-1)的生长曲线，重组工程菌在发酵培养基中生长约11小时进入对数生长末期时加入乳糖诱导hIGF-1表达效果最佳，如图6A、图6B所示，此时菌体生长OD₆₀₀值为7.44，虽低于平台期，但hIGF-1相对生长量最高，为23.0%。

③高密度发酵中乳糖浓度对工程菌生长及hIGF-1表达的影响 

在5L发酵罐水平，使用乳糖诱导工程菌E.coli DH5α/pET32a(IGF-1)表达hIGF-1，其对工程菌生长及hIGF-1表达的影响如图7A、图7B所示，可知随着乳糖浓度的增加,菌体密度的增长速度有下降趋势，但hIGF-1相对表达量逐渐提高，综合考虑菌体生长和hIGF-1的表达，确定终浓度3%为工程菌E.coli DH5α/pET32a(IGF-1)高密度发酵表达hIGF-1的最佳乳糖诱导浓度，其诱导结果如附图8，hIGF-1相对表达量约为33.8%。

④乳糖添加方式对工程菌高密度发酵表达hIGF-1的影响 

采用不同乳糖添加方式在工程菌E.coli DH5α/pET32a(IGF-1)高密度发酵中诱导hIGF-1表达，结果如附图9，可知采用流加乳糖和分次加乳糖的方式均可有效缓解乳糖对菌体生长的抑制作用，其中采用流加乳糖方式时菌体生长的密度最高，OD₆₀₀值达到31.6。

综上，使用乳糖能够诱导重组工程菌E.coli DH5α/pET32a(IGF-1)高密度发酵表达hIGF-1，在优化的发酵培养基、培养条件及诱导条件下，菌体生长密度OD₆₀₀值达31.6，hIGF-1相对表达量约为33.8%。 

实施例2 乳糖诱导E.coli BL₂₁(DE3)/pET32a(hIGF-1)高密度发酵表达hIGF-1

大肠杆菌E.coli B及其衍生菌株是大肠杆菌表达系统较常用的菌株，其产酸量相对较少，蛋白表达量稳定，更有利于外源基因的高密度发酵表达。因此本课题组选取菌株E.coli BL₂₁(DE3)代替原有宿主菌E.coli DH5α进行hIGF-1的原核表达。从原有工程菌种抽提获得含有hIGF-1基因的重组质粒pET32a(hIGF-1)后转化E.coli BL₂₁(DE3)感受态细胞，通过氨苄青霉素平板筛选阳性转化子并行基因测序确证，获得表达hIGF-1的工程菌菌株E.coli BL₂₁(DE3)/pET32a(hIGF-1)。而后使用乳糖在高密度发酵中诱导其表达hIGF-1。

1 材料 

1.1菌株

含重组质粒pET32a（+）/hIGF-1的工程菌E.coli BL₂₁(DE3)/pET32a(hIGF-1)由本实验室构建并保存。

1.2主要试剂 

兔抗人IGF-1多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG购自北京鼎国生物技术公司；ECL化学发光检测试剂、SDS蛋白质上样缓冲液、凝胶载样缓冲液为北京庄盟生物技术公司产品；封闭奶粉购自普利莱基因有限公司；α-乳糖、氨水为国药集团化学试剂有限公司产品；其余试剂同实施例1。

1.3实验仪器 

同实施例1.

2 方法

实施过程同实施例1，首先在摇瓶条件下探讨乳糖诱导工程菌E.coli BL₂₁(DE3)/pET32a(hIGF-1)在LB培养基中表达hIGF-1的可行性及一般规律；继而在获得适合工程菌生长的发酵培养基后先后在摇瓶与5L自控式发酵罐进行工程菌E.coli BL₂₁(DE3)/pET32a(hIGF-1)的高密度发酵培养，以乳糖为诱导剂诱导hIGF-1表达，研究不同培养条件及诱导条件对工程菌生长和hIGF-1表达的影响，优化诱导条件实现乳糖在工程菌E.coli BL₂₁(DE3)/pET32a(hIGF-1)高密度发酵表达hIGF-1的应用。

检测方法及检测指标同实施例1。 

3 结果 

3.1 乳糖诱导工程菌E.coli BL₂₁(DE3)/pET32a(hIGF-1)在LB培养基表达hIGF-1

①诱导产物分子量及免疫原性鉴定

经乳糖诱导，工程菌E.coli BL₂₁(DE3)/pET32a(hIGF-1)能表达分子量在30Kd左右的蛋白质（如图10A、图10B、图11A、图11B、图12A、图12B所示），和目的产物hIGF-1融合蛋白的理论推算值相符，未加乳糖的阴性对照组的相应位置则未看到该蛋白条带。转膜后使用兔抗人IGF-1多克隆抗体为一抗，羊抗兔IgG为二抗进行反应，免疫印迹分析结果如附图13所示，在乳糖诱导组可见特异性抗原抗体复合物条带，对照物则无，提示表达的融合蛋白具有hIGF-1抗原活性。

②乳糖浓度对hIGF-1表达的影响 

hIGF-1在E.coli BL₂₁(DE3)/pET32a(hIGF-1)中的表达量随着乳糖终浓度的不同而改变，如图10A、图10B所示，当乳糖终浓度为0.8%时乳糖诱导表达获得的hIGF-1融合蛋白产量占总蛋白的比值最大（69.5%）。

③诱导起始生长量对hIGF-1表达的影响 

如图11A、图11B所示，摇瓶条件下在工程菌在LB培养基中生长2.5小时加入诱导剂乳糖可得到hIGF-1最大表达（相对表达量70.1%）。

④诱导时长对对hIGF-1表达的影响 

如图12A、图12B所示，诱导4h时hIGF-1相对表达量达到高峰（37.0%）。

3.2 乳糖诱导工程菌E.coli BL₂₁(DE3)/pET32a(hIGF-1)高密度发酵表达hIGF-1 

①乳糖诱导工程菌在发酵培养基中摇瓶表达hIGF-1

利用碳氮源正交试验获得适合重组工程菌E.coli BL₂₁(DE3)/pET32a(hIGF-1)生长的发酵培养基后，使用乳糖诱导其在发酵培养基中表达hIGF-1。如图14A、图14B所示，乳糖终浓度为1%时诱导结果最好，重组hIGF-1蛋白表达率为27.12%。

②发酵培养基中诱导起始生长量对hIGF-1表达的影响 

根据发酵培养基中工程菌E.coli BL₂₁(DE3)/pET32a(hIGF-1)的生长曲线，重组工程菌在发酵培养基中生长约8小时进入对数生长中期时加入乳糖诱导hIGF-1表达效果最佳，如图15A、图15B所示，诱导5小时后菌体生长OD₆₀₀值为7.22，hIGF-1相对生长量为27.31%。

③高密度发酵中乳糖浓度对工程菌生长及hIGF-1表达的影响 

在5L发酵罐水平，使用乳糖诱导工程菌E.coli BL₂₁(DE3)/pET32a(hIGF-1)表达hIGF-1，其对工程菌生长及hIGF-1表达的影响如图16A、图16B所示，可知随着乳糖浓度的增加,菌体密度的增长速度有下降趋势，但hIGF-1相对表达量先升高后降低，综合考虑菌体生长和hIGF-1的表达，确定终浓度3%为工程菌E.coli BL₂₁(DE3)/pET32a(hIGF-1)高密度发酵表达hIGF-1的最佳乳糖诱导浓度，其诱导结果如附图17，诱导6小时候hIGF-1相对表达量约为36.61%。

综上，使用乳糖能够诱导重组工程菌E.coli BL₂₁(DE3)/pET32a(hIGF-1)高密度发酵表达hIGF-1，在优化的发酵培养基、培养条件及诱导条件下，菌体生长密度OD₆₀₀值达35.23，hIGF-1相对表达量约为36.61%。 

实施例1、2仅为乳糖在不同工程菌菌株中作为诱导剂诱导hIGF-1的高密度发酵表达应用的较佳实施例，并非对本发明做任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与调整或是使用其他如β-乳糖等形式存在的乳糖进行诱导表达，均仍属于本发明技术方案的范围内。