重组大肠杆菌高密度发酵表达类人胶原蛋白过程代谢通量分析及优化

摘要

本研究考察了Escherichia coli BL 21菌株生产类人胶原蛋白的培养过程。通过代谢流分析的手段，讨论了不同生长时期，不同比生长速率下代谢流分布的状况以及能量和还原力的产生和分布状况，确定了诱导前和诱导后最适合细胞生长和产物表达的培养条件，结果表明： 1．在诱导前的补料培养阶段，比生长速率为0.16 h<'-1>时，纽胞进入PP途径(R<,1>)的通量最高，用于细胞合成的通量也最大。同时当细胞比生长速率由0.16 h<,-1>增到0.25 h<,1>时，异柠檬酸生成(R<,14>)的通量只增加了0.87％和1.04％；而乙酸生成途径(OA)的通量却增长了110％和25％，可以认为是控制碳流进入TCA循环的柠檬酸合成酶在比生长速率为0.16 h<,-1>时就已经接近于饱和状态。从而确定诱导前较小的比生长速率有利于细胞的生长。 2．当升温诱导后，比生长速率为0.05 h<,-1>时，流向PP途径的通量最高，且在此种培养条件下，无论是流向细胞合成或是目标产物的前体通量都是最大。另外，当比生长速率由0.05调整到0.07 h<,-1>时，从乙酰辅酶A流向异柠檬酸的通量只增大了7％，而从乙酰辅酶A流向乙酸的通量增加了29％，由此可以说明当比生长速率达到0.05 h<,-1>后柠檬酸合成酶就基本上达到了饱和状态。这就进一步证明了μ=0.05 h<,-1>在4种条件下最有利于细胞和目标产物的合成。 3．诱导前，用于细胞合成的 ATP 消耗速率在3种培养条件下远远低于m<,ATP>，这说明随着比生长速率的增加，细胞将合成的大量ATP用于维持代谢等，但ATP产生速率的增加对细胞合成的贡献却不大。 4．诱导后随着补糖速率和比生长速率的增加，用于生长无关的ATP消耗速率依次增加，m<,ATP>从μ=0.02 h<'-1>到，μ=0.04h<'-1>增加了21.3％；而从,μ=0.04 h<'-1>到，μ=0.05h<'-1>增加了9.6％；最后从μ=0.05 h<'-1>到μ=0.07 h<-1>增加了37.3％，并且维持代谢和无效循环等消耗了产生的大部分ATP，这对于细胞生长来说是不经济的。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章综述

第二章试验材料与方法

1菌种

2试剂

2.1种子培养基

2.2发酵培养基和补料培养基

2.3主要试剂

3主要仪器和设备

4实验方法

4.1种子培养

4.2补料-分批培养

5分析方法

5.1细胞生长

5.2细胞浓度

5.3葡萄糖浓度

5.4乙酸含量

5.5 NH2-R的测定

5.6类人胶原蛋白表达量

5.7总蛋白含量的测定

5.8类人胶原蛋白定性及定量分析

参考文献

第三章不同比生长速率下大肠杆菌高密度发酵表达类人胶原蛋白过程代谢通量分析

1代谢分析网络的确定

1.1代谢网络的选择原则

1.2碳源初级代谢网络的确定

2代谢通量的分析方法

3大肠杆菌生长期的代谢通量分析

3.1细胞元素组成及结构大分子单体的需求

3.2生物合成前体流量的计算

3.3诱导前不同比生长速率下代谢通量分布分析

3.4诱导后不同比生长速率下代谢通量分布分析

4讨论

5本章小结

参考文献：

第四章大肠杆菌高密度发酵过程中能量、还原力的衡算

1胞内能量及还原力的计算方法

2所采用的公式及假设

3大肠杆菌生长与产物表达期能量与还原力的分布分析

3.1诱导前不同比生长速率下能量/还原力的分布

3.2诱导后不同比生长速率下能量/还原力的分布

4讨论

5本章小结

参考文献

致谢