从灵芝的深层发酵菌丝体中提取灵芝多糖的方法

摘要

本发明公开了一种从灵芝的深层发酵菌丝体中提取灵芝多糖的方法，将灵芝的深层发酵菌丝体与其重量2-4倍的纯净水混合，调整pH值至4后加温，当温度上升至40-50℃时加入由木瓜蛋白酶、果胶酶、纤维素酶组成的复合酶，一个小时后升温至60-70℃，此时用NaOH调整pH值至7-8，每分钟以8-10转搅拌，浸提2-4次，每次2-3小时，将2-4次浸提液合并过滤，减压浓缩至总体积30％，用乙醇沉淀浓缩液，过滤得上清液，上清液用超过滤分离装置脱盐，经反复加水稀释和超过滤操作，获得灵芝多糖浓缩液，浓缩液经冷冻干燥或喷雾干燥得灵芝多糖纯度达到97％以上的灵芝多糖粉末。该方法避免使用任何有机溶剂，无污染物质排放，适合大规模工业化生产。

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种从灵芝的深层发酵菌丝体 中提取灵芝多糖的方法。

背景技术

烟草白粉病是烟草生产中常见的一种真菌病害，具有发生和流行迅速， 危害严重等特性，它是由二孢白粉菌(Eryshe cichoracearum DC.)引起，该 病多为害成熟老叶，由下向上发展。严重时为害嫩茎，病茎上也布满白粉。 病叶烘烤后薄如纸，色暗锈褐色，丧失经济价值。

真菌多糖是是一类天然高分子化合物，它广泛存在于真菌的细胞壁中， 是由醛基和酮基通过糖苷键连接起来的高分子聚合物。真菌多糖具有丰富的 生物活性，无毒副作用，是目前最具开发前景的药物新资源。有效防治白粉 病的真菌多糖制备是满足生产需要的保障。对于提高烟叶质量，减少化学农 药使用，提高我国卷烟在国际卷烟市场中的竞争力，防止病害大流行造成的 烟叶损失，具有重要意义。

灵芝(Ganoderma Lucidum)为担子菌纲多孔菌科灵芝属真菌，又称瑞 草。灵芝多糖(Ganoderma lucidum Polysaccharide)是由多个单糖构成的大 分子葡聚糖，它广泛存在于灵芝的子实体和菌丝体中。

在真菌多糖的提取方面，目前国内外主要采用热水浸提法和溶剂提取 法。热水浸提法是一种常规的提取方法，其优点是提取条件温和，操作简单、 方便；但存在的缺点是多糖得率不高，因为当使用热水浸提时，热水在加热 的过程中不断地从罐内蒸出，这就要求在提取过程不停的补水、加热，以致 浪费了大量的溶剂和能源。溶剂提取法主要采取低浓度的草酸、草酸铵、盐 酸、氢氧化钠等溶剂提取。然而，酸对多糖有水解作用，且操作比较繁杂， 故多不采取酸提法。而盐对多糖的提取率提高不大。碱法的多糖得率比水提 取及酸提取高，但要注意碱浓度不能太高，以免多糖变性；而且碱法提取条 件剧烈，容易引起多糖变性，对多糖也有降解作用，且提取液粘稠，不宜过 滤。现有的从灵芝中提取真菌多糖的工艺方法，普遍所使用的设备基本上都 是无法密闭的蒸煮锅或罐，而且都是分批间歇操作。总之，这些方法普遍存 在着不能实现浸煮和浓缩的连续化操作，能源利用率低，溶剂用量大、损耗 大，生产周期长和生产效率低等缺点，且在某些情况下还可能造成环境污染； 难以满足国家GMP标准要求。本领域迫切需要改进灵芝多糖的提取技术， 以进一步提高灵芝多糖的提取率。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种从灵芝的深层发酵菌丝体中提取灵芝多糖 的方法，该方法提取效率高，过程简单，生产成本低，所获得的灵芝多糖纯 度高。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种从灵芝的深层发酵菌丝体中提取灵芝多糖的方法，其特征在于，按 照下列步骤实施：

1)取灵芝的深层发酵菌丝体为原料，常温下与原料重量2～4倍的纯净 水混合，调整溶液的pH值至4；

2)将溶液加温，当温度上升至40℃～50℃时加入由木瓜蛋白酶、果胶 酶、纤维素酶组成的复合酶，酶解反应1小时；

3)酶解反应完成后，将溶液升温至60℃～70℃，用NaOH调pH值至 7-8，以每分钟8-10转的转速搅拌，浸提2-4次，每次2-3小时，收集浸提 液；

4)将浸提液合并，过滤，减压浓缩至浸提液总体积30％，用乙醇沉淀 浓缩液，过滤，得上清液；上清液用膜分离装置脱盐，脱盐后经反复加水稀 释和超过滤操作，得灵芝多糖浓缩液；灵芝多糖浓缩液经冷冻干燥或喷雾干 燥得到纯度达到97％以上的灵芝多糖粉末。

所述的木瓜蛋白酶的用量为原料重量的2％～3％、果胶酶的用量为原 料重量的0.5％～1％、纤维素酶的用量为原料重量的1％～2％。

所述的膜分离装置采用截留分子量范围为10000的膜分离装置，操作的 室温为18℃～22℃，压力为0.02MPa～0.04MPa。

所述过滤使用的筛网为250目-400目的筛网。

本发明采用了适量的复合酶，为了提高灵芝活性成分提取率，仅靠单一 酶作用显然是难以实现，所以采用复合酶有针对性的对不同底物降解，才可 以达到既不破坏灵芝多糖生物活性又破坏菌丝体结构而充分释放多糖。它能 够提高灵芝多糖的浸出率，主要是因为该复合酶对菌类物质中的游离蛋白质 具有分解作用，使得菌类物质结构变松，降低了它们与多糖的结合力。因此， 它和现有技术中常用的水提方法相比提取率高；和传统的酸碱提取法相比， 不易破坏多糖的立体结构与活性。其工艺简单、产品制备效率高，质量好， 成本低。而且避免了使用任何有机溶剂，无污染物质排放，适合大规模工业 化生产。有很好的推广应用价值。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步的详细说明，需要说明的是，这些实 施例仅供本领域的技术人员充分理解本发明，本发明不限于这些实施例。

实施例1：

将100kg灵芝深层发酵的菌丝体粉碎，加入300水，调整溶液的pH值 至4后加温，温度上升至40℃时，加入木瓜蛋白酶2.5kg，果胶酶0.6kg， 纤维素酶1.5kg，酶解反应1小时；

酶解反应后升温至60℃，用NaOH调pH值至7，以每分钟8转的转速 搅拌，浸提2次，每次3小时，收集浸提液；

将2次浸提液合并用250目的筛网过滤，减压，浓缩至浸提液总体积 30％，用乙醇沉淀浓缩液，再用250目的筛网过滤得上清液；上清液用截留 分子量为10000的膜分离装置(膜分离装置的操作温度为18℃-22℃，压力 0.02Mpa)脱盐，脱盐后的上清液反复进行加水稀释和超过滤操作，每次超 过滤操作控制透过液的体积为60kg，并向透过液中加入60kg水稀释，再进 行超过滤操作，如此进行30次循环操作，收集最后1次的透过液，冷冻干 燥或喷雾干燥制得纯度达到97％的灵芝多糖粉末。

实施例2：

将100kg灵芝深层发酵的菌丝体粉碎，加入300kg水，调整溶液的pH 值至4后加温，温度上升至45℃时，加入木瓜蛋白酶2kg，果胶酶1kg，纤 维素酶2kg，酶解反应1小时；

酶解反应后升温至65℃，用NaOH调pH值至8，以每分钟8转的转速 搅拌，浸提4次，每次2小时，收集浸提液；

将4次浸提液合并，用250目筛网过滤，减压浓缩至浸提液总体积30 ％，用乙醇沉淀浓缩液，再用250目筛网过滤得上清液；上清液用截留分子 量为10000的膜分离装置(操作温度20℃左右，操作压力0.02Mpa)进行脱 盐，脱盐后的上清液反复进行加水稀释和超过滤操作，每次超过滤操作控制 透过液体积为70kg，并向透过液中加入70kg水稀释，再进行超过滤操作， 如此进行30次循环操作，收集最后1次透过液，冷冻干燥或喷雾干燥制得 纯度达到97％的灵芝多糖粉末。

实施例3：

将100kg灵芝深层发酵的菌丝体粉碎，加入300kg水，调整溶液的pH 值至4后加温，温度上升至50℃时，加入木瓜蛋白酶2kg，果胶酶1kg，纤 维素酶2kg，酶解反应1小时；

酶解反应后升温至65℃，用NaOH调pH值至7.5，以每分钟10转的转 速搅拌，浸提2次，每次3小时，收集浸提液；

将2次浸提液合并，用300目筛网过滤，减压浓缩至浸提液总体积30 ％，用乙醇沉淀浓缩液，再用300目筛网过滤得上清液；上清液用截留分子 量为10000的膜分离装置(膜分离装置的操作温度为18℃-22℃，压力0.02 Mpa)脱盐，脱盐后的上清液反复进行加水稀释和超过滤操作，每次超过滤 操作控制透过液的体积为90kg，并向透过液中加入90kg水稀释，再进行超 过滤操作，如此进行30次循环操作，收集最后1次的透过液，冷冻干燥或 喷雾干燥制得纯度达到97％的灵芝多糖粉末。

实施例4：

将100kg灵芝深层发酵的菌丝体粉碎，加入300水，调整溶液的pH值 至4后加温，温度上升至45℃时，加入木瓜蛋白酶2.5kg，果胶酶0.6kg， 纤维素酶1.5kg，酶解反应1小时；

酶解反应后升温至70℃，用NaOH调pH值至7.5，以每分钟10转的转 速搅拌，浸提4次，每次2小时，收集浸提液；

将4次浸提液合并过滤，减压浓缩至总体积30％时用乙醇沉淀，用400 目筛网过滤得上清液；上清液用截留分子量为10000的膜分离装置(膜分离 装置的操作温度为18℃-22℃，压力0.02Mpa)脱盐，脱盐后的上清液反复 进行加水稀释和超过滤操作，每次超过滤操作控制透过液的体积为80kg， 并向透过液中加入80kg水，再进行超过滤操作，如此进行30次循环操作， 收集最后1次的透过液，冷冻干燥或喷雾干燥制得纯度达到97％的灵芝多 糖粉末。