雷公藤红素对内皮前体细胞功能的改善作用

摘要

本发明涉及雷公藤红素对内皮前体细胞功能的改善作用。具体地，本发明提供了一种体外培养内皮前体细胞的方法，包括步骤：在雷公藤红素、或其药学上可接受的盐或酯、或其衍生物存在下，培养内皮前体细胞。该方法有助于克服内皮前体细胞(EPC)的功能障碍，提高EPC细胞的迁移能力以及形成血管样网络能力。

说明书

技术领域

本发明涉及医学和生物学领域，更具体地涉及雷公藤红素对内皮前体细胞 (EPC)功能的改善作用，尤其是雷公藤红素在促进EPC细胞的迁移能力以及形成 血管样网络能力的作用及其应用。

背景技术

干细胞分化为血管内皮的过程不仅发生于胚胎时期的，还发生在成人时 期。循环内皮前体细胞(EPCs)在这一分化过程中的作用已得到公认。

内皮前体细胞(EPCs)是一类高增殖力及具有分化为内皮细胞并形成新生 血管潜力，介于干细胞与成熟体细胞之间的中分化态细胞。EPCs可以从外周血 的单个核细胞成分或骨髓中分离采集，也可从血管壁及一些其他的组织器官采 集，如脐带血。

1997年，Asahara T等在世界上率先成功分离纯化了内皮前体细胞：一类 既具有内皮细胞特征，又具有前体细胞体征，能诱导成人血管新生的循环血细 胞(Asahara T，Murohara T，Sullivan A，et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis.Science，1997，275： 964-67)。

目前，EPCs得到了广泛的研究，其在维持血管内皮完整性、损伤内皮修复及 缺血区域再灌注等方面的作用已受到越来越多的关注。

一些研究证实了基于EPCs的细胞疗法对于血管病变动物模型的显著疗效。 例如，在EPCs植入后，患侧及对侧肢体血流及毛细血管密度显著增加，患肢直 截率也显著下降。EPCs能恢复慢性肾动脉病变猪模型的肾功能，缓解肾微血管 的重塑及纤维化。在急性心肌梗塞的动物模型(Kawamoto A，6won HC，Iwaguro H，等人，Therapeutic potential of ex vivo expanded endothelial progenitor cells for myocardial ischemia.Circulation 2001；103： 634-37)，体外扩增的EPCs能聚集在缺血区域，渗入心肌新生血管灶，并对左 心室功能的保护有益，表现为显著增加的左室容积，改善的局部室壁运动，显 著增加的毛细血管密度及更小的疤痕扩展范围。

虽然异体移植可提供一定数量的活力较高的EPCs，但是为了避免免疫排斥反 应不得不使用免疫抑制剂，这也会加重经济上的负担。此外，异体细胞的来源也是 很有限的。因此，有效的移植方式是自体移植。

人们发现，在自体移植中，为了有效应用EPCs，必需首先克服EPCs功能障碍 这一问题。Vasa M等在2001年首先发现循环EPCs的数量及功能与冠脉疾病的危 险因素呈负相关，并提出了EPCs功能障碍的概念(Chade AR，Zhu X，Lavi R，et al. Endothelial progenitor cells restore renal function in chronic experimental renovascular disease.Circulation 2009；119：547-57.)。

造成EPCs功能下降的机制仍未完全明确，目前一般认为：首先，细胞自身一 些酶蛋白的功能或表达受到抑制，妨碍了细胞信号的传递，影响了EPCs动员；其 次，EPCs输入对象(病人)内环境因素进一步阻碍EPCs的动员。

雷公藤红素(celastrol)是从中药植物雷公藤提取的单体化合物，具有较 强毒性，0.1～1.0mg/g可明显抑制刀豆素、植物血凝素、美洲商陆分裂原及大 肠杆菌脂多糖诱导的脾细胞、淋巴细胞增生反应。然而，研究认为雷公藤红素 具有一定的毒性，例如雷公藤红素对斑马鱼胚胎心脏有一定毒性(中国药理学 通报Chinese Pharmacological bulletin 2009 May；25：(5)：634-636)。

近年的研究表明，雷公藤红素是蛋白激酶抑制剂和拓扑酶抑制剂，可抑制 多种肿瘤细胞的生长，包括前列腺癌、神经胶质瘤等(中国专利申请CN 200810198485.4)。

此外，雷公藤红素可抑制HSP90(热休克蛋白90)导致的细胞发生热休克反 应，使HSP32、HSP70、HSP90等细胞保护分子升高，具有保护细胞的作用，因 此可用于抑制中枢神经系统细胞的老化和受伤，因此可用于预防和治疗神经损 伤类疾病，例如阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease)、帕金森症(中国专 利申请CN 200810133804.3)。

然而，迄今为止，尚没有雷公藤红素能够促进EPC细胞的迁移等方面的报 道。此外，本领域尚没有令人满意的克服内皮前体细胞功能障碍的有效方法。

因此，本领域迫切需要开发新的、有效克服内皮前体细胞功能障碍的方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种有效克服内皮前体细胞功能障碍的方法和/或 改善内皮前体细胞功能的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种体外培养内皮前体细胞的方法，包括步 骤：(a)在雷公藤红素、或其药学上可接受的盐或酯、或其衍生物存在下，培 养内皮前体细胞。

在另一优选例中，步骤(a)中雷公藤红素、或其药学上可接受的盐或酯、 或其衍生物的浓度为50-500nmol/l，较佳地100-400nmol/l。

在另一优选例中，步骤(a)中培养时间为0.5-10天。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤：(b)收获步骤(a)中的内皮前体细 胞，并与药学上可接受的载体混合。

在另一优选例中，所述的内皮前体细胞是人内皮前体细胞。

在另一优选例中，所述的雷公藤红素、或其药学上可接受的盐或酯、或其 衍生物选自下组：雷公藤红素、雷公藤红素甲酯、雷公藤红素丙酯、雷公藤红 素丙烯胺、双氢雷公藤红素、或其组合。

在本发明的第二方面，提供了一种雷公藤红素、或其药学上可接受的盐或 酯、或其衍生物的用途，它们被用于制备克服内皮前体细胞功能障碍的组合物。

在另一优选例中，所述的克服内皮前体细胞功能障碍包括：提高内皮前体 细胞的迁移能力、提高内皮前体细胞形成血管样网络的能力、加强与血管损伤 部位内皮细胞粘附能力、或其组合。

在另一优选例中，所述的组合物是药物组合物。

在本发明的第三方面，提供了一种内皮前体细胞，所述的内皮前体细胞经 雷公藤红素、或其药学上可接受的盐或酯、或其衍生物预处理的内皮前体细胞。

在另一优选例中，所述的预处理包括以下步骤：

(a)在雷公藤红素、或其药学上可接受的盐或酯、或其衍生物存在下，培 养内皮前体细胞1-10天；

(b)收获步骤(a)中的经预处理的内皮前体细胞。

在另一优选例中，步骤(a)中雷公藤红素、或其药学上可接受的盐或酯、 或其衍生物的浓度为50-500nmol/l。

在另一优选例中，所述的经预处理的内皮前体细胞具有以下特性：

(i)迁移能力：是指体外培养内皮前体细胞输入体内后，向损伤部位迁移、 并覆盖或修复损伤部位的能力；

(ii)形成血管样网络能力：是指体外培养内皮前体细胞输入体内后，在 损伤部位形成正常血管结构的能力。

在本发明的第四方面，提供了一种药物组合物，它包括(i)药学上可接受 的载体和(ii)本发明第三方面中所述的内皮前体细胞。

在本发明的第五方面，提供了本发明第三方面中所述的内皮前体细胞的用 途，它被(a)用于制备治疗选自下组的疾病的药物：急性心梗、血管狭窄或闭 塞、或者其组合，或者

(b)用于制备用于受损内皮内源性修复的药物。

在另一优选例中，所述的血管狭窄或闭塞包括动脉狭窄或动脉闭塞，以及 静脉狭窄或静脉闭塞(或阻塞)。

在另一优选例中，所述的动脉包括外周动脉、脑动脉或肾动脉等。

在另一优选例中，所述的内皮前体细胞或药物用于哺乳动物(如人)。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施 例)中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。 限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了EPCs集落形态。图中，箭头所指为EPCs集落，中央类圆形细 胞聚集，周围散布略成放射状排列梭形细胞；A和C，×100；B和D，×200。

图2显示了针对不同细胞标志物的荧光染色结果。图中，A：CD34-FITC染 色；B：CD31-PE染色；C：KDR-FITC染色；D：VE-cadherin-PE染色。细胞核 为DAPI染色。

图3显示了EPCs流式细胞检测结果。右侧白色峰区域为阴性对照细胞，M1 区域为目标抗原阳性细胞。

图4显示了雷公藤红素(Trip)对EPCs的增殖抑制率曲线。

图5显示了EPCs迁移率曲线。

图6显示了经处理的荧光染色图像，图中可见管状网络结构，并用于长度 分析。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现，雷公藤红素居然能够有效 地协助内皮前体细胞克服功能障碍，从而提高内皮前体细胞的迁移能力以及形 成血管样网络的能力。在此基础上完成了本发明。

基于本发明，本发明人提供了克服内皮细胞自身增生缓慢、加速血管损伤 部位快速修复技术，还提供了有效改善血管损伤部位的局部微环境及其相关措 施。

术语

如本文所用，术语“EPC”和“内皮前体细胞(endothelial progenitor cell)”可互换使用，指血管内皮细胞的前体细胞，可从骨髓动员到外周血参与 损伤血管的修复。EPC是一群具有游走特性，能进一步增殖分化的幼稚内皮细 胞，但缺乏成熟内皮细胞的特征性表型。该术语包括来源于哺乳动物(包括人) 的内皮前体细胞，尤其是来自患者自身的内皮前体细胞。

如本文所用，术语“雷公藤红素”或“Trip”指可从植物雷公藤中提取的 三萜酮化合物，其分子式为C29H3804，CAS号：34157-83-0。

应理解，在该术语不仅包括提取自雷公藤的雷公藤红素，也包括提取自其 他植物的雷公藤红素，以及人工合成的雷公藤红素。

此外，广义的“雷公藤红素”不仅包括雷公藤红素本身，还包括雷公藤红 素的药学上可接受的盐或酯、或其衍生物。例如，雷公藤红素3位羟基和20位 羟基就可通过酯化反应形成相应的酯。代表性的例子包括(但并不限于)：雷公 藤红素、雷公藤红素甲酯、雷公藤红素丙酯、雷公藤红素丙烯胺、双氢雷公藤 红素、或其组合。

如本文所用，术语“药学上可接受的盐或酯”可以是雷公藤红素的任何药 学上可以接受的盐或酯，例如与酸形成的酯，适合的酸包括(但不限于)盐酸、 氢溴酸、氢氟酸、硫酸、磷酸等无机酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、 琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、苯磺酸 等有机酸以及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。

如本文所用，对于内皮前体细胞而言，术语“功能障碍”指内皮前体细胞 不能正常表达内皮细胞的相关功能和形成正常的内皮细胞应该形成的结构。

如本文所用，术语“本发明的EPC细胞”指经雷公藤红素、或其药学上可 接受的盐或酯、或其衍生物预处理的、从而迁移等能力得到改善的EPC细胞。

克服功能障碍的方法

本发明提供了一种克服内皮前体细胞功能障碍或协助内皮前体细胞克服 功能障碍的方法，也就是用雷公藤红素、或其药学上可接受的盐或酯、或其衍 生物对内皮前体细胞进行预处理。经预处理后的EPC的迁移能力和形成血管的 能力有显著改善。

可用于本发明的分离EPC的方法没有特别限制，可以是任何常规的方法。 如CAC，CFU-EC(CFU-Hill)ECFC(Leukemia.2007；21：1141-1149)等。

可用于本发明的培养EPC的方法、培养基和条件等没有特别限制，可以是 任何常规的方法、培养基和条件。关键是在培养EPC时，在培养液中存在雷公 藤红素、或其药学上可接受的盐或酯、或其衍生物，以便EPC克服功能障碍。

在培养液或培养体系中，雷公藤红素、或其药学上可接受的盐或酯、或其 衍生物的浓度一般为10-1000nmol/l，较佳地50-500nmol/l，更佳地 100-400nmol/l。

本发明的实验结果表明，当雷公藤红素浓度＜400nmol/L时，MTT法检测 样本的570nm OD值与未加雷公藤红素的对照组无显著差异(P＞0.05)，浓度≥ 400nmol/L时，OD与对照组有显著差异(P＜0.05)。

在本发明的一个优选例中，以100-400nmol/L共4个浓度雷公藤红素孵育 后，EPCs的趋化迁移数以及在基质胶中形成的管状网络相对长度均超过对照组 (P＜0.01)。200nmol/L时的迁移细胞最多，并与100nmol/L组(P＜0.05)及400 nmol/L组(P＜0.01)之间存在差异。虽然200nmol/L时形成的管状网络也最长， 但与100nmol/L、300nmol/L及400nmol/L组间并无差异(P＞0.05)。

用雷公藤红素、或其药学上可接受的盐或酯、或其衍生物进行预处理(即 共同孵育)的时间没有特别限制，通常为0.5-20天，较佳地为1-20天，更佳地 为1-10天，最佳地为2-5天。

组合物、用途和施用方法

用本发明方法预处理或培养的EPC细胞具有更高的活力，因此更适合用于 治疗或辅助治疗需要修复受损内皮的疾病，尤其是心血管疾病。

根据现有技术，可用本发明的EPC细胞进行治疗的代表性的疾病例子包括 (但并不限于)：急性心梗、血管狭窄或闭塞、或者其组合，以及其他各种内皮 受损的病症。

在另一优选例中，所述的血管狭窄或闭塞包括动脉狭窄或动脉闭塞，以及 静脉狭窄或静脉闭塞(或阻塞)。

在另一优选例中，所述的动脉包括外周动脉、脑动脉或肾动脉等。代表性 的例子包括：细小动脉粥样硬化和微血栓造成狭窄闭塞。

在另一优选例中，所述的内皮前体细胞或药物用于哺乳动物(如人)。

本发明还提供了一种药物组合物，它包含安全、有效量范围内的本发明EPC 细胞以及药学上可以接受的赋形剂或载体。通常，本发明的药物组合物为液体 制剂，它含有1×10⁴-5×10⁶个EPC细胞/ml，较佳地2×10⁴-1×10⁶个EPC细胞/ml。

“药学上可以接受的赋形剂或载体”指的是：一种或多种相容性或液体或 凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相 容性”在此指的是组合物中各组份能与本发明的化合物以及它们之间相互掺 和，而不明显降低化合物的药效。药学上可以接受的赋形剂或载体部分例子有 多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、无热原水、碘哌醇等。

本发明EPC细胞可以单独给药，或者与其他药学上可接受的化合物联合给 药，其中包括(但并不限于)：细胞外信号调节激酶-2(ERK-2)、整合素连接激 酶(ILK)、激肽B2受体(B2R)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B(Akt)等。

施用本发明EPC细胞或本发明的药物组合物时，宜通过肠胃外(静脉内、肌 肉内或皮下)、局部给药。

当然，具体给药途径和剂量，可由熟练医师根据病人健康状况等因素来确定。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明方法可有效克服内皮前体细胞(EPC)的功能障碍，提高EPC细胞 的迁移能力以及形成血管样网络能力。

(b)本发明方法可有效应用于早期细小动脉血管损害的相关治疗。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议 的条件。除非另外说明，否则百分比和份数为重量百分比和重量份数。

实施例1EPC细胞的培养

材料：

成人静脉血，不少于20ml；

磷酸盐缓冲溶液(PBS)，不含钙和镁，pH 7.2；

Ficoll-Paque PLUS分离液(Ficoll，Amersham Biosciences，cat.no. 17-1440-03)，比重1.077；

FCS(胎牛血清，GIBCO，cat.no 16000-044)；

cEGM-2培养液(Lonza，cat.no.CC-3162)；

离心管(BD Falcon，15ml，50ml)；

方法：

20名健康成年人志愿者(男性，22-38岁)，在签署知情同意书后，分别从 前臂静脉抽取20ml静脉血，EDTA抗凝并收集在50ml的离心管中。所得血液于采 集后4小时内进行单核细胞(MNCs)的分离，基本步骤如下：

①1∶1以磷酸盐缓冲溶液(PBS)稀释；②用比重1.077的Ficoll-Paque液进 行密度梯度离心；③收集位于Histopaque液与最上层淡黄色血浆层之间的细胞 成分；④再次1∶1以PBS稀释，离心；⑤去除上层液体，反复加入适量含2％胎 牛血清(FCS)的PBS重悬细胞，洗涤离心，共3次；⑥最后所得MNCs以cEGM-2培 养液5ml重悬，细胞计数。

培养EPCs

材料：

新鲜分离的MNCs

纤维连接蛋白(SinoBiological，cat.no.10314-H08H)

cEGM-2培养液(Lonza，cat.no.CC-3162)

0.4％锥虫蓝溶液(Sigma，cat.no.T8154)

方法：

(1)将MNCs按照每孔5×10⁶个细胞的数量，加入以纤维连接蛋白(FN)包被的 6孔培养板，并每孔添加2ml的cEGM-2。37℃，5％CO₂，湿度大于95％的条件下培 养2天。

(2)收集每孔中的悬浮细胞，以一一对应的顺序移入5ml离心管，计数细胞。 再按照1×10⁶每孔的密度，将细胞转移到同样包被FN的24孔培养板，添加cEGM-2 至每孔含培养液1ml。37℃，5％CO₂，湿度大于95％的条件下培养3天。

(3)吸除悬浮细胞，PBS+2％FCS洗涤2次，加入1ml cEGM-2培养液。观察EPCs 集落形态并计数。

EPCs表型鉴定

材料：

cEGM-2培养液(Lonza，cat.no.CC-3162)

抗人CD31单抗(BD Pharmingen，cat.no.550389)

抗人CD34单抗(BD Pharmingen，cat.no.550760)

抗人KDR单抗(BD Pharmingen，cat.no.555307)

抗人VE-cadherin单抗(BD Pharmingen，cat.no.550988)

EPTC标记山羊抗小鼠IgG(碧云天，cat.no.A0568)

PE标记山羊抗小鼠IgG(ABD serotec，cat.no.101009)

(SinoBiological，cat.no.10314-H08H)

方法：

(1)免疫荧光检测：胰蛋白酶/EDTA消化EPCs，接种于包被纤维连接蛋白(FN) 的玻片上，37℃，5％CO₂，湿度大于95％的条件下培养24小时，完成细胞爬片； 固定EPCs，分别按序添加CD31、CD34、KDR、Ve-cadherin单抗及PE或FITC标记 二抗，于荧光显微镜下观察相应抗原表达。

(2)流式细胞检测：胰蛋白酶/EDTA消化EPCs，收集在15ml离心管，离心， 以PBS+2％FCS洗涤2次，细胞计数后，加入cEGM-2配成1×10⁶/ml的EPCs悬液，每 1×10⁶细胞为单位，分别按序添加CD31、CD34、KDR、Ve-cadherin单抗及PE或 FITC标记二抗，以未作一抗标记的细胞为阴性对照，进行流式细胞检测。

结果

1.MNCs分离及EPCs集落培养效果

全血经密度梯度离心后，离心管中出现几个不同层次的液体和细胞带。最 底层为红细胞层，紧贴其上有一层薄的灰白色粒细胞层，其上为Histopaque分 离液，最上层为稀释的血浆层，其中含有血小板，在血浆层和分离液之间的云 雾状白膜层为MNCs细胞层，20ml外周血分离得到MNCs数量为(1.92±0.16)× 10⁷。

本实施例采用的EPCs培养方法也称为CFU-Hill法，经5-7天的培养，可以 观察到典型的EPCs集落，其特征为中央由类圆形细胞聚集组成，外围环绕一些 放射状排列的梭形细胞(图1)。

所采集20份外周静脉血，获得EPCs集落数量为16.65±3.98。

2.EPCs的表型

(1)EPCs爬片免疫荧光检测：

采用鼠抗人一抗，加荧光标记的羊抗鼠二抗进行间接检测，结果如图2所 示。

(2)流式细胞检测结果：

以与免疫荧光检测同样的方式间接标记EPCs，但采用单标检测。

结果如下：检测5组EPCs样本，各抗原阳性率为CD31-89.24％±5.47， CD34-72.36％±8.26，KDR-63.71％±0.81，VE-钙粘蛋白 (VE-cadherin)(CD144)-36.19％±8.74。图3显示了其中一组EPCs的流式检测 结果。右侧白色峰区域为阴性对照细胞，M1区域为目标抗原阳性细胞。

上述结果表明，CFU-Hill法可以成功培养EPCs，所得细胞的表型证实了分 离的细胞是内皮前体细胞。

实施例2雷公藤红素对EPC的影响

1雷公藤红素的细胞毒性实验

材料：

雷公藤红素(泽朗医药，纯度98％)

纤维连接蛋白(SinoBiological，cat.no.10314-H08H)

cEGM-2培养液(Lonza，cat.no.CC-3162)

EBM-2(Lonza，cat.no.CC-3156)

0.4％锥虫蓝溶液(Sigma，cat.no.T8154)

24孔培养板(BD Falcon)

MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(碧云天，cat.no.C0009)

酶联免疫检测仪(南京华东电子，DG5031)

方法：

(1)EPCs按每孔5×10⁴接种于FN包被的24孔培养板，16小时后通过测定酸 性磷酸酶活性测定方法，排除细胞数量在均值±2倍标准差范围以外的培养孔。

(2)PBS+2％FCS清洗后，所有细胞用含无血清的EBM-2终止生长24h，随后换 成cEGM-2，使细胞再次进入生长状态，并随机分孔，给予不同浓度雷公藤红素， 在37℃，5％CO₂，湿度大于95％的条件下孵育24小时(每一浓度设5个复孔，并设 不加入雷公藤红素的阴性对照)，MTT法进行细胞活性检测。测定对EPCs无毒性 作用的雷公藤红素浓度范围。

2雷公藤红素对EPCs功能影响实验

材料：

雷公藤红素(泽朗医药，纯度98％)

纤维连接蛋白(SinoBiological，cat.no.10314-H08H)

cEGM-2培养液(Lonza，cat.no.CC-3162)

24孔培养板(BD Falcon)

胰蛋白酶/EDTA(Bioind)

博伊登室(Costar，Avon，France)，滤膜孔径8μM

EBM-2(Lonza，cat.no.CC-3156)

TNF-α(Biotrend)

基质胶Matrigel(BD Biosciences，cat.no.356234)

Qtracker 625细胞标记试剂盒(Invitrogen，cat.no.A10198)

方法：

EPCs预处理：MNCs培养至出现EPCs集落，消化得到的EPCs离心后，去除上 清液，BS+2％FCS洗涤2次，加入5ml cEGM-2重悬，在FN包被的25cm²培养瓶，37 ℃，5％CO₂，湿度大于95％的条件下孵育6小时；再按照上一步确定的非毒性浓度 范围，加入雷公藤红素孵育24小时(每一浓度5个样本)；消化EPCs，PBS+2％FCS 洗涤2次，所收集EPCs用于功能实验。

(1)趋化迁移能力实验

8μM孔径滤膜的改良博伊登室(Costar，Avon，France)，滤膜经含50ug FN/ml的PBS液4℃过夜后凉干；24孔板中预先加入含VEGF细胞因子的cEGM-2， 将博伊登室放入培养孔中；经雷公藤红素孵育的EPCs，用不含细胞因子、TNF-α 浓度为10ng/ml的EBM-2，调整到细胞含量为2×10⁵/ml，吸取200ul加入博伊登 室上部，37℃，5％CO₂，湿度大于95％的条件下孵育培养6h；去除滤膜上表面的 EPCs后，滤膜用1.1％甲醛固定，Giemsa染色。未添加雷公藤红素处理的EPCs 作为对照。使用市售的ImageJ软件记录穿行到滤膜下表面的细胞数，计算跨膜 移动的指数：滤膜下表面的细胞数/40000。

(2)管状网络形成实验

EPCs细胞计数，加入cEGM-2调整细胞含量到5000/50ul，添加Qtracker荧 光纳米晶体孵育10分钟；按照试剂盒说明，用基质胶(Matrigel，BD Biosciences) 包被96孔培养板，每孔30ul；随后每孔加入EPCs悬液100ul，使每孔细胞数为1 ×10⁴，并添加cEGM-2 100ul，最后加入TNF-调节浓度至10ng/ml模拟炎症环 境。未添加雷公藤红素处理的EPCs作为对照。倒置显微镜每2小时观察一次管 状网络至满12小时。根据观察结果计算最终形成的管状网络长度。

3.结果

(1)低浓度雷公藤红素不抑制EPCs增殖

雷公藤红素(Trip)从100至1000nmol/L，浓度每增加100nmol/L设1个实 验组，以未经雷公藤红素孵育的EPCs为对照组。

表1显示了MTT法测得的570nm光密度值(OD)。浓度＜400nmol/L时，样本 的OD与对照组无差异(P＞0.05)，浓度≥400nmol/L时，样本的OD与对照组有 显著差异(P＜0.05)。

表1.Trip孵育后MTT法EPCs活性检测

注：Trip-雷公藤红素，以下同；OD-光密度；

T1…T5-数字代表不同供体来源的EPCs样本；

*P＜0.05，§P＜0.01，t检验

参照对照组OD值，绘制抑制率曲线(图4)，结果雷公藤红素浓度在400 nmol/L以下时，抑制率不超过10％。因而，较高浓度雷公藤红素呈现出对EPCs 明显的增殖抑制作用，而低浓度则不抑制EPCs增殖；但结果也显示了雷公藤红 素在体外培养中并无促进EPCs增殖的作用。

参照以上细胞毒性实验的结果，本发明人选择了处于抑制率低于10％，与 对照组无差异的100-400nmol/L共4个浓度，作为孵育EPCs的标准，进行下一 步的细胞功能检测。

(2)趋化迁移能力实验

趋化迁移能力实验结果如图5和表2所示。

表2.Trip孵育后EPCs的趋化迁移

注：a1…a5-数字代表不同供体来源的EPCs样本；

§-P＜0.01，t检验

上述结果表明，雷公藤红素可提高EPCs趋化迁移能力。

(3)雷公藤红素促进EPC形成管状网络

管状网络形成实验的结果如图6和表3所示。

表3.Trip孵育后EPCs形成管状网络

注：L1…L5-数字代表不同供体来源的EPCs样本；

长度L为相对值，由ImageJ软件设定一个标准长度为参照计算出的比值；

*-与对照组相比P＜0.05，§-与对照组相比P＜0.001，t检验。

表明雷公藤红素可提高EPCs形成血管样网络的能力。

综上所述，低浓度(≤400nmol/L)的雷公藤红素对EPCs的增殖力及活性无 明显抑制，并且在100-400nmol/L雷公藤红素存在下，培养EPC孵育，有助于 EPC细胞克服功能障碍，提高EPCs趋化迁移及形成血管样网络的能力。

实施例3经雷公藤红素预处理的细胞制剂

按实施例1中所述方法分离EPC细胞。在300nmol/L雷公藤红素，在37℃， 5％CO₂，湿度大于95％的条件下孵育分离的EPC细胞16、24、36或48小时，分别取 约1×10⁷个EPC与100毫升生理盐水混合，制得经雷公藤红素预处理的细胞制剂。

对于胫前动脉狭窄闭塞段，在PTA治疗开通后，可将50-100毫升上述注射 剂通过动脉泵在1-2小时内缓慢注入。

实施例4雷公藤红素衍生物对EPC的影响

重复实施例2，不同点在于用300-800nmol/L的雷公藤红素甲酯替换雷公藤 红素。

结果：EPC与浓度为300-800nmol/L的雷公藤红素甲酯一起孵育后，有助于 EPC细胞克服功能障碍，提高EPCs趋化迁移及形成血管样网络的能力。

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