聚半乳糖醛酸硫酸酯在制备抗幽门螺旋杆菌药物中的应用

摘要

本发明公开了聚半乳糖醛酸硫酸酯在制备抗幽门螺旋杆菌药物中的应用。体外结合实验证实，聚半乳糖醛酸硫酸酯与幽门螺旋杆菌具有显著的亲和作用，可提高幽门螺旋杆菌清除率，用于制备抗幽门螺旋杆菌药物或作为抗幽门螺旋杆菌药物的增效剂或作为抗幽门螺旋杆菌药物制剂的辅料。在有效剂量下，聚半乳糖醛酸硫酸酯未见明显毒副反应。

说明书

技术领域

本发明涉及聚半乳糖醛酸硫酸酯的新用途。

背景技术

幽门螺旋杆菌是胃炎、消化道溃疡、以及胃癌的元凶。其中消化道溃疡主要发生在胃到十二指肠段，80%的胃溃疡患者感染了幽门螺旋杆菌，而十二指肠溃疡患者则有95%感染了幽门螺旋杆菌。根除幽门螺旋杆菌，能有效治疗消化道溃疡并预防溃疡的复发，另有最新研究表明，根除幽门螺旋杆菌可以预防胃癌。参考文献[1]和[2]。[1] Walsh J H, Peterson W L. The treatment of Helicobacter pylori infection in the management of peptic ulcer disease. New England Journal of Medicine, 1995, 333(15): 984–991. [2] Rauws E A, Tytgat G N. Cure of duodenal ulcer associated with eradication of Helicobacter pylori. Lancet, 1990, 335(8700): 1233-1235.

现今根除幽门螺旋杆菌的主要方法为以质子泵抑制剂为基础的三联疗法，即在应用质子泵抑制剂的基础上联用两种抗生素（克拉霉素与阿莫西林或甲硝唑），但应用三联疗法治疗时也存在一些问题。一方面，随着细菌耐药性的增加，三联疗法对幽门螺旋杆菌的清除率从最初的大于90%下降到75%-80%，治愈率也下降到80%以下；另一方面，治疗周期一般在一周以上，而抗生素的长期使用亦会导致二重感染。因此寻找新的治疗方案成为当务之急。参考文献[3]。[3] Gisbert J P, Maria P J. Treatment of Helicobacter pylori infection: The past and the future. European journal of internal medicine, 2010, 21(5): 357-359.

多糖硫酸酯因其具有抗病毒、抗肿瘤、抗凝血、抗氧化等生物活性而日益受到关注。研究发现，幽门螺旋杆菌表面蛋白对多糖硫酸酯有很高的亲和力，而多糖硫酸酯本身还可以抑制幽门螺旋杆菌与消化道黏蛋白以及胃癌细胞的结合，这将妨碍幽门螺旋杆菌在体内的定植与感染。进一步的研究证明，半乳糖硫酸酯较其他糖基硫酸酯有更高的幽门螺旋杆菌亲和力。参考文献[4-8]。[4] Ascencio F, Fransson L A, Wadstrom T. Affinity of the pathogen Helicobacter pylori for the N-sulphated glycosaminoglycan heparan sulphate. Journal of medical microbiology, 1993, 38(4): 240-244. [5] Saitoh T, Natomi H, Zhao W L, et al. Identification of glycolipid receptors for Helicobacter pylori by TLC-immunostaining. FEBS letters, 1991, 282(2): 385-387. [6] Shibata H, Iimuro M, Uchiya N, et al. Preventive Effects of Cladosiphon Fucoidan Against Helicobacter pylori Infection in Mongolian gerbils. Helicobacter, 2003, 8(2): 59-65. [7] Wadstrom T, Hirmo S, Novak H, et al. Sulfatides Inhibit Binding of Helicobacter pylori to the Gastric Cancer Kato III Cell Line. Current Microbiology, 1997, 34(5): 267-272. [8] Veerman E C, Bank C M, Namavar F, et al. Sulfated glycans on oral mucin as receptors for Helicobacter pylori. Glycobiology, 1997, 7(6): 737-743.

聚半乳糖醛酸由α-1,4糖苷键连接的D-半乳糖醛酸构成，其中部分羧基被甲酯化，硫酸酯化后2,3位羟基生成硫酸酯，具有幽门螺旋杆菌亲和力，可用于抗幽门螺旋杆菌感染药物的制备，以达到减少抗生素的用量，提高幽门螺旋杆菌清除率的目的。根据我们的文献检索，到目前为止，未见聚半乳糖醛酸硫酸酯用于治疗幽门螺旋杆菌的研究报道。

发明内容

本发明的目的在于提供聚半乳糖醛酸硫酸酯在制备抗幽门螺旋杆菌药物中的应用，通过提高幽门螺旋杆菌的清除率，为幽门螺旋杆菌导致的消化道溃疡或癌症提供新的治疗手段。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明发现聚半乳糖醛酸硫酸酯能用于制备抗幽门螺旋杆菌药物，能作为抗幽门螺旋杆菌药物的增效剂，能作为制备抗幽门螺旋杆菌药物制剂的赋形剂或辅料。能作为疗幽门螺旋杆菌阳性的胃或十二指肠溃疡药物，能作为治疗幽门螺旋杆菌阳性的胃或十二指肠癌药物。

上述聚半乳糖醛酸硫酸酯的特征为含有以下结构：

其中，R₁ 为-COOH，COO^-或-COOCH₃；R₂为H，SO₃^–或SO₃H。

聚半乳糖醛酸硫酸酯的合成：原料选用聚半乳糖醛酸，其中半乳糖醛酸含量大于74%，甲酯化程度大于6%，酯化试剂为三氧化硫吡啶，反应介质可以是N,N-2-甲基甲酰胺（DMF）或吡啶，亦可是其他叔胺。反应在氮气保护下，70℃-90℃进行1-4小时。反应产物调节pH后经醇沉，或不经醇沉直接透析。透析产物经冷冻干燥或者真空干燥，即得到聚半乳糖醛酸硫酸酯，并进行结构鉴定及取代度的测定。

本发明涉及一种ELISA检测幽门螺旋杆菌与聚半乳糖醛酸硫酸酯亲和作用的方法。幽门螺旋杆菌临床分离菌株置于含有5%牛血清的布氏肉汤中，微需氧条件下（85%N₂、10%CO₂、5%O₂）37℃培养48 h。离心收获细菌，PBS洗涤两次，重悬于PBS中（OD₆₃₀=0.1），-80℃保存。将0.04-30 μg/mL聚半乳糖醛酸硫酸酯溶于0.1%的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）中，100 μL/孔加入到氨基化的酶标板中，37℃过夜，每孔用150 μL含0.05%Tween-20的PBS洗涤三次，150 μL含3%BSA的PBS于37℃封闭1 h，洗涤三次。加入幽门螺旋杆菌悬液，混匀后37℃作用1 h，洗涤三次。加入稀释过的酶标抗体，50 μL/孔，37℃作用1 h，洗涤三次。以空白校零，450 nm处测量OD值。结果显示，且随着包被浓度提高，OD值增大，说明幽门螺旋杆菌对聚半乳糖醛酸硫酸酯具有亲和作用，且亲和作用呈聚半乳糖醛酸硫酸酯浓度依赖性。

本发明涉及聚半乳糖醛酸硫酸酯的急性毒性考察。选取20只健康成年小鼠，雌雄各半，禁食24 h后，按照15000 mg/kg聚半乳糖醛酸硫酸酯灌胃，连续观察14天。14天中20只动物生长情况正常，未发现任何中毒表现，无死亡。表明聚半乳糖醛酸硫酸酯对小鼠口服的最大非致死量大于15000 mg/kg。根据毒性分级标准，可以认为聚半乳糖醛酸硫酸酯是微毒或无毒的，人体在一般口服剂量下是安全的。 

附图说明

图1为聚半乳糖醛酸及聚半乳糖醛酸硫酸酯红外图谱。A 聚半乳糖醛酸，B 聚半乳糖醛酸硫酸酯。由红外图谱可以看出，3300~3500 cm^-1为羧酸–OH的缔合伸缩振动，1746 cm^-1为羧酸C=O的伸缩振动；生成硫酸酯钠盐后，1615 cm^-1生成–COO₂–不对称伸缩振动峰，在1241 cm^-1出现一个新峰，为S＝O的特征峰。835 cm^-1处为C–O–S特征峰，但该峰和α–糖苷键的特征峰（835 cm^-1）相互叠加，不易观察。综合取代度信息，可以推断，聚半乳糖醛酸硫酸酯已经合成。

图2为聚半乳糖醛酸硫酸酯与幽门螺旋杆菌的亲和试验聚半乳糖醛酸硫酸酯溶液浓度依次为0.04，0.12，0.37，1.1，3.3，10，30 μg/mL，按照实例3中所述方法，加入幽门螺旋杆菌并显色后，于450 nm处测量OD值。可以看出在1.1 μg/mL之前，随着聚半乳糖醛酸硫酸酯浓度的提高，OD值增加，表明幽门螺旋杆菌吸附量增加；1.1 μg/mL之后，聚半乳糖醛酸硫酸酯包被浓度增加，OD值无显著增加，表明幽门螺旋杆菌吸附达到饱和。该实验证明幽门螺旋杆菌可以和聚半乳糖醛酸硫酸酯发生亲和作用，且亲和作用呈聚半乳糖醛酸硫酸酯浓度依赖性。

具体实施方式

下面通过具体实施例进一步解释本发明，但是本发明不仅限于实例中。

实例1 聚半乳糖醛酸硫酸酯的合成

1、合成方法I

100 mg 聚半乳糖醛酸用2 mL 干燥DMF浸泡过夜。按照聚半乳糖醛酸：三氧化硫-吡啶1:4称取三氧化硫吡啶，按照三氧化硫吡啶：吡啶1:1加入量取吡啶，溶解于2.5 mL DMF，转移至充满氮气的三颈烧瓶，加入浸泡好的聚半乳糖醛酸后，将反应于氮气保护下90℃搅拌反应4 h。反应结束后冰浴冷却至室温，加入25 mL去离子水，2 M NaOH 调节pH至6-7。去离子水中透析四天（MWCO:3500 Da），冷冻干燥即得到聚半乳糖醛酸硫酸酯。参考文献[9]。[9] Vogl H, Paper D H, Franz G. Preparation of a sulfated linear (1,4)-β-D-galactan with variable degrees of sulfation. Carbohydrate Polymers, 2000, 41(2): 185-190.

2、合成方法II

500 mg 聚半乳糖醛酸用10 mL 干燥DMF 充分浸泡，1.25 g三氧化硫-吡啶溶于25 mLDMF，加入630 μL吡啶，转移至三颈烧瓶。加入聚半乳糖醛酸后，搅拌下90℃反应4 h。冷却至室温，加入125 mL去离子水搅拌下用 2 M NaOH 调节pH至8-9。乙醇沉淀后，复溶于去离子水中，pH8的碱性水中透析（2 d, MWCO:3500 Da），蒸馏水透析一天。冷冻干燥即得到聚半乳糖醛酸硫酸酯。 

实例2 聚半乳糖醛酸硫酸酯取代度（DS）的检测

标准曲线的绘制：取50 mL平底烧杯10个，分别加入硫酸盐标准使用液0，0.10，0.20，0.60，1.00，1.50，2.00，3.00，4.00，5.00 mL，用水补足至9 mL，将配好标准系列溶液的烧杯，逐个放在磁力搅拌器上，搅拌10 s，迅速加入2 mL氯化钡-明胶溶液，同时用秒表准确计时，搅拌2.0 min。立刻于420 nm波长处，用10 mm吸收池，以水作参比测吸光度。用吸光度对相应硫酸盐含量绘制标准曲线。得回归方程y = 0.01412 x + 0.31563，R2 = 0.99921，表明硫酸基浓度在1.82-27.27 μg·mL^-1时线性良好，符合朗伯比尔定律。

聚半乳糖醛酸硫酸酯取代度（DS）的检测：取干燥好的10 mg聚半乳糖醛酸硫酸酯于10 mL试管中，加入10 mL 0.1 M 盐酸，封管后100℃水浴5 h，4000 rpm离心10 min，吸取2.00 mL过滤液，加去离子水 7.00 mL，按照标准曲线测定法方测定硫酸根含量，以等量聚半乳糖醛酸的水解液作对照。多批聚半乳糖醛酸硫酸酯的DS为0.12-0.14。

实例3 聚半乳糖醛酸硫酸酯与幽门螺旋杆菌的亲和试验

幽门螺旋杆菌临床分离菌株置于含有5%牛血清的布氏肉汤中，微需氧条件下（85% N₂、10% CO₂、5% O₂）37℃培养48 h。离心收获细菌，PBS洗涤两次，重悬于PBS中（OD₆₃₀=0.1），-80℃保存。将0.04，0.12，0.37，1.1，3.3，10，30 μg/mL聚半乳糖醛酸硫酸酯溶于0.1 %的EDC中，加入到氨基化的酶标板中，100 μL/孔，37℃过夜，每孔用150 μL含0.05% Tween-20的PBS洗涤三次。每孔添加150 μL含3% BSA的PBS，置37℃封闭1 h，洗涤三次。加入幽门螺旋杆菌悬液，混匀后37℃作用1 h，洗涤三次。加入稀释过的酶标抗体，50 μL/孔，37℃作用1 h，洗涤三次。以空白校零，450 nm处测量OD值。OD值与聚半乳糖醛酸硫酸酯包被浓度成明显浓度依赖关系。参考文献[10]。[10] Zielen S, Broker M, Stmad N, et al. Simple determination of polysaccharide specific antibodies by means of chemically modified ELISA plates. Journal of Immunological Methods, 1996, 193 (1): 1-7.

 实例4 聚半乳糖醛酸硫酸酯急性毒性试验

实验选取20只健康成年小鼠，雌雄各半，禁食24 h后，按照15000 mg/kg聚半乳糖醛酸硫酸酯灌胃后，连续观察14 d。14 d中20只动物生长情况正常，未发现任何中毒表现，无死亡。表明聚半乳糖醛酸硫酸酯对小鼠口服的最大非致死剂量大于15000 mg/kg。根据毒性分级标准，可以认为聚半乳糖醛酸硫酸酯是微毒或无毒的，人体在一般口服剂量下是安全的。