新城疫病毒高粘膜免疫水平弱毒疫苗株NDV/LX及反向遗传构建系统

摘要

本发明涉及分子生物学技术和免疫学技术，公开了一株新城疫病毒弱毒株NDV/LX及它的全基因组序列。所述新城疫病毒弱毒疫苗株NDV/LX的保藏号为CGMCC NO：3843；全基因组序列如SEQIDNO.37所示。研究表明，NDV/LX具有良好的免疫原性，能在呼吸道和消化道很好的复制，诱导产生高滴度的特异抗体和粘膜免疫应答。以常用疫苗株LaSota和QV4为对照，系统研究了NDV/LX株感染SPF鸡后在呼吸道和肠道的分布、全身体液免疫和局部粘膜免疫以及免疫鸡对流行强毒的保护效力。

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术和免疫学技术，筛选一株能同时在消化道和呼吸道产生高水 平粘膜免疫的基因I型新城疫病毒弱毒株NDV/LX，用于制造疫苗。

背景技术

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)是严重危害世界养禽业的重要传染性病原 体之一，可以感染多种禽类，常导致养禽业产生巨大的经济损失[Alexander，D.J.2001.Gordon Memorial Lecture.Newcastle disease.Br Poult Sci 42：5-22.]。该病毒属于副粘病毒科、副粘病毒 亚科、禽腮腺炎病毒属(Avulavirus)的成员[Mayo，M.A.2002.Virus taxonomy-Houston 2002. Arch Virol 147：1071-1076.]。新城疫病毒有囊膜，基因组为单股、负链、不分节段的RNA病毒， 基因组结构模式为：3′-NP-P-M-F-HN-L-5′，依次编码6种结构蛋白：核衣壳蛋白(NP)、磷 蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)和大分子蛋白(L)即核蛋 白(NP)，P，M，F，HN和L蛋白。

根据对鸡的毒力，NDV毒株可以为强毒(Velogenic)、中等毒力(mesogenic)和弱毒 (Lentogen)。已开展广泛的试验来阐明病毒致病性的分子决定因素[Huang Z，Krishnamurthy S，Panda A，Samal SK.Newcastle disease virus V protein is associated with viral pathogenesis and functions as an alpha interferon antagonist.Journal of virology 2003 Aug；77(16)：8676-85.]。大部 分研究是关于F和HN蛋白对致病性的作用，研究结果一致认为F蛋白裂解位点处的氨基酸序 列是病毒毒力的主要决定因素[Seal BS.Nucleotide and predicted amino acid sequence analysis of the fusion protein and hemagglutinin-neuraminidase protein genes among Newcastle disease virus isolates.Phylogenetic relationships among the Paramyxovirinae based on attachment glycoprotein sequences.Funct Integr Genomics 2004Oct；4(4)：246-57.]。NDV毒力差异的分子基 础主要决定于F0蛋白的蛋白酶裂解位点的氨基酸序列，强毒的裂解位点有聚碱性氨基酸序 列，其模式基序为112GR/K-R-Q-K/R-R-F117；弱毒的裂解位点则缺少聚碱性氨基酸序列，其 模式基序为112-E/G-R/K-Q-E/G-R-L117。

自1926年发现新城疫(ND)以来，ND已发生了四次大的流行，而且每一次流行都有 不同基因型的毒株出现，尤其是90年代之后出现了新的基因VII型NDV，给我国的养禽业 造成了巨大的经济损失。在控制疫病的过程中，使用疫苗是最有效最经济的方法，新城疫的 疫苗已使用了几十年，由于ND疫苗的广泛使用，此病已基本上得到了较好的控制，但是临 床上非典型ND的发生十分普遍，ND仍然成为威胁养禽业的主要疾病之一，也就是说，常 规的疫苗对于NDV强毒的攻击并不能提供理想的保护。从近十年来的ND流行特点来看， 临床上所分离到的NDV毒株大多数属于基因VII型[Liu，X.F.，H.Q.Wan，X.X.Ni，Y.T.Wu， and W.B.Liu.Pathotypical and genotypical characterization of strain of Newcastle disease isolated from outbreaks in chicken and goose flocks in some regions of China during 1985-2001.Archives ofVirology，2003，148(7)：1387-1403.]，而常规的ND疫苗株的基因型主要为I和II型(如V4、 La Sota等)，因此，在遗传距离上当前NDV分离株与常规ND疫苗株相差较远。

在我国，ND已成为地方流行性疾病，很难扑灭和根除，对商业鸡群进行疫苗免疫是防 控新城疫最重要的措施之一。ND疫苗有活疫苗和灭活疫苗之分，活疫苗使用方便，价格便 宜，并能产生坚强的免疫力。ND活疫苗不仅能刺激产生体液免疫和细胞免疫，而且能诱导 产生呼吸道和消化道粘膜免疫[Senne，D.A.，D.J.King，and D.R.Kapczynski.2004.Control of Newcastle disease by vaccination.Dev Biol(Basel)119：165-170.]。因为呼吸道和消化道粘膜是 NDV感染宿主的门户，所以坚强的粘膜免疫在免疫保护中起着十分重要的作用[Erf，G.F. 2004.Cell-mediated immunity in poultry.Poultry science 83：580-590.]。大多数商业化NDV弱毒 疫苗都能诱导产生针对NDV的特异抗体，但是血清中产生的NDV特异抗体并不足以保护动 物抵抗NDV强毒的侵袭感染[Reynolds，D.L.，and A.D.Maraqa.2000.Protective immunity against Newcastle disease：the role of antibodies specific to Newcastle disease virus polypeptides. Avian Dis 44：138-144.])。研究表明以呼吸道和肠道分泌性IgA抗体为代表的粘膜免疫在保护 免疫鸡群抵抗ND的感染中起到重要作用[Barbour，E.K.，M.Kallas，and M.T.Farran.2001. Immune response to Newcastle disease virus in broilers：a useful model for the assessment of detoxification of ervil seeds.Rev Sci Tech 20：785-790.]。粘膜中分泌性IgA抗体的产生与疫苗 株病毒在粘膜上皮细胞中的复制密切相关。但是不同的疫苗病毒在肠道和呼吸道中刺激粘膜 产生免疫应答的能力有很大的差异。例如常用的疫苗株La Sota是嗜呼吸道型病毒能刺激产 生较高水平的呼吸道粘膜免疫，但刺激产生肠道粘膜免疫的能力很差。相反常用疫苗株QV4 是嗜肠道病毒，具有较强诱导粘膜免疫的能力，但是诱导呼吸道粘膜免疫的能力差[Brown，C. C.，D.J.King，and B.S.Seal.1999.Comparison of pathology-based techniques for detection of viscerotropic velogenic Newcastle disease virus in chickens.J Comp Pathol 120：383-389.]。而从美 国火鸡肠道中分离的VG/GA毒株，能在呼吸道和消化道中很好的复制，同时诱导产生坚强 的呼吸道和消化道粘膜免疫应答，因此它具有比单诱导肠道粘膜免疫的疫苗株QV4和单诱 导呼吸道粘膜免疫的疫苗株La Sota更大的优越性[Perozo，F.，P.Villegas，R.Dolz，C.L.Afonso， and L.B.Purvis.2008.The VG/GA strain of Newcastle disease virus：mucosal immunity， protection against lethal challenge and molecular analysis.Avian Pathol 37：237-245.]。

NDV/LX株是我们从健康鸡群中分离到的一株NDV弱毒。初步研究表明，NDV/LX具 有良好的免疫原性，能在呼吸道和消化道很好的复制，诱导产生高滴度的特异抗体和粘膜免 疫应答。NDV/LX病毒的ICPI值为0.12，MDT为110h，按照OIE标准测得HA效价10.5log2。 攻毒用毒株为基因VII型强毒分离株JS-5-05-Go分离自发病鸭群，其F和HN基因序列号分 别为EU044798、EU044816，其ICPI和MDT分别是1.91和46小时，HA效价平均为8log2。

发明内容

本发明的第一个目的在于发明一种新城疫病毒高粘膜免疫水平弱毒疫苗株NDV/LX及 反向遗传构建系统，从而解决当前所用疫苗株不能同时在消化道和呼吸道产生黏膜免疫的问 题。

本发明基因I型弱毒疫苗株NDV/LX，于2010年5月19日保藏于中国微生物菌种保藏 管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC NO：3843。

本发明中NDV/LX株是我们从健康家禽群中分离到一批NDV弱毒。将这些毒株分别以 10⁶EID₅₀免疫SPF鸡，在免疫后1、4、7、11、15、21天，每组扑杀3只鸡，获取鸡气管和 小肠冲洗物以及胆汁。试验的对照组分别为常用疫苗株La Sota、QV4免疫组和PBS免疫空 白对照组。经过黏膜抗体水平比较，获得具有良好的免疫原性的NDV/LX株，能在呼吸道和 消化道很好的复制，诱导产生高滴度的特异抗体和粘膜免疫应答。

本发明的第二个目的在于测定基因I型弱毒疫苗株NDV/LX全基因组序列，其全基因组 序列如SEQ ID NO.37所示。NDV/LX毒株既能在肠道上皮细胞又能在呼吸道上皮细胞中复 制的原因仍然是未知的。据报道L蛋白、F蛋白或HN蛋白等结构蛋白的变化是组织嗜性和 毒力的主要决定因素。HN和F蛋白可能决定病毒的独特吸附和融合，这将使嗜肠道的病毒 能优先进入小肠细胞；而L蛋白的变异将允许嗜肠道毒株在小肠高水平复制，却抑制呼吸道 型毒株在小肠的复制。对该毒株进行全基因组测序和反向遗传构建，分析该毒株既能在肠道 上皮细胞又能在呼吸道上皮细胞中复制的分子机制，通过反向遗传构建全长克隆使对其基因 组修饰成为可能。

本发明的第三个目的在于构建基因I型弱毒疫苗株NDV/LX的全长克隆。

本发明的构建方法如下：

1)基因I型新城疫病毒株NDV/LX株的筛选，对从健康家禽肠道分离到一批新城疫病 毒弱毒株进行生物学特性和免疫原性分析，测定血清中抗新城疫病毒的效价以及消化道和呼 吸道粘膜免疫水平。

2)NDV/LX株基因组序列测定，新城疫病毒NDV/LX株由扬州大学农业部畜禽传染病 学重点开放实验室构建、保存。

设计7对引物扩增基因组序列，引物如下：

3)NDV/LX株基因组的修饰，设计8对引物用于扩增NDV/LX株基因组全长序列，每 个片段大小约2000bp左右，引物序列如下：

用8对引物分别构建阳性质粒P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7和P8，构建基因I型NDV/LX 株病毒全基因组克隆prLX。

4)NDV/LX株病毒全长克隆的拯救，将质粒prLX与表达NDV Lo Sota毒株NP、P和L 基因的pCI-NP、pCI-P和pCI-L三个真核表达质粒共转染BSR-T7/5细胞，转染18h后加入 终浓度为10％的SPF鸡胚尿囊液，转染60h后将转染样品接种9～11日龄SPF鸡胚，获得基 因I型毒株NDV/LX的感染性克隆NDV/LX

5)RT-PCR检测NDV/LX株组织分布特性

用NDV通用引物通过RT-PCR扩增病毒的F基因。引物序列如下：

FT1：：5’-CGTAGAAAAAACACGGGTAGAAGA-3’(SEQ ID NO.33)

FT2：：5’-CAGGTAGGTRGCACGCATATTATT-3’(SEQ ID NO.34)。

6)基因I型新城疫病毒株NDV/LX株的免疫效力的测定，140只1日龄SPF鸡分成4 组，通过滴鼻/点眼接种10⁶EID50/0.1mL(PBS稀释)疫苗株病毒，对照组同样用0.1mLPBS 滴鼻/点眼。取血清测定其体液免疫水平，获取鸡气管和小肠冲洗物以及胆汁，用于测定粘膜 免疫水平。攻毒后采集喉头和泄殖腔棉拭子，测定其强毒攻击后的排毒水平。

本发明中NDV/LX株是我们从健康鸭群中分离到的一株NDV弱毒。研究表明，NDV/LX 具有良好的免疫原性，能在呼吸道和消化道很好的复制，诱导产生高滴度的特异抗体和粘膜 免疫应答。以常用疫苗株La Sota和QV4为对照，系统研究了NDV/LX株感染SPF鸡后在 呼吸道和肠道的分布、全身体液免疫和局部粘膜免疫以及免疫鸡对流行强毒的保护效力。

附图说明

图1NDV/LX株全长克隆prLX构建模式图。

图2NDV/LX感染性克隆RT-PCR产物测序鉴定结果。

图3新城疫病毒免疫后血清ELISA效价

图4新城疫病毒免疫鸡IgA抗体水平(OD650).

具体实施方式

步骤一：NDV/LX株的获得

从健康家禽肠道分离到一批新城疫病毒弱毒株，对其生物学特性：血凝价、ICPI、EID50 进行分析，在这些弱毒株中筛选出血凝价高、复制能力强的疫苗候选株；并对候选株进行免 疫原性分析，免疫2周龄SPF鸡，免疫后测定血清中抗新城疫病毒的效价以及消化道和呼吸 道粘膜免疫水平，最终获得能在呼吸道和消化道很好的复制，诱导产生高滴度的特异抗体和 粘膜免疫应答的新城疫弱毒株NDV/LX(基因I型新城疫病毒弱毒NDV/LX株)。

通过EID50测定，获得10^8.7EID50/0.1mL NDV/LX病毒，ICPI值为0.12，MDT为110h。

本发明基因I型新城疫病毒弱毒NDV/LX株，于2010年5月19日保藏于中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC NO：3843。

步骤二：NDV/LX株基因组测序及其修饰

1、NDV/LX株基因组测序

设计7对引物用于扩增NDV/LX株基因组全长序列，7对引物序列分别为以下引物对： SEQ ID NO.3/NO.4((1-2242nt)、SEQ ID NO.5/NO.6(2211-4518nt)、SEQ ID NO.7/ NO.8(4285-6344nt)、SEQ ID NO.9/NO.10(6173-8604nt)、SEQ ID NO.11/NO.12(8366-10393 nt)、SEQ ID NO.13/NO.14(10317-12572nt)、SEQ ID NO.15/NO.16(12507-15186nt)。

NDV/LX毒株鸡胚尿囊液用上海生物工程技术服务有限公司的RNA抽提试剂盒提取 RNA。取以上抽提的病毒基因组RNA经RT-PCR，获得目的片段，PCR产物经电泳鉴定， 并用Agrose Gel DNA Extraction Kit回收，与pGEM-T载体(美国promega公司产品)连 接，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，经EcoR I酶切鉴定，将PCR产物和与pGEM-T 载体连接的产物同时送上海联合基因科技有限公司测序。获得的序列通过DNAstar软件拼 接获得NDV/LX株基因组全长序列，其基因组长度为：15186bp，序列如SEQ ID NO.37所 示。

2、NDV/LX株基因组的修饰

设计8对引物用于扩增NDV/LX株基因组全长序列，并进行测序，每个片段大小约2000bp 左右，引物序列如下：

用8对引物分别构建阳性质粒P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7和P8，利用目的片段两端 添加的酶切位点酶切，将质粒P8中目的基因片段克隆到TVT7R(0.0)载体(由美国Alabama 大学L.Andrew Ball教授惠赠)中，构建质粒T8。质粒P1目的片段两端添加的酶切位点将 基因片段克隆到T8载体中，构建质粒T18。质粒P5、P6和P7相互连接构建质粒P567，Spe I和mluI酶切胶回收567片段，并与T18连接，构建质粒T3-2。利用质粒P2、P3、P4经目 的片段两端添加的酶切位点，将三个片段在pCR2.1 T载体中依次相连，进而构建了质粒P234， 利用SacII和Spe I酶切胶回收234片段，与T3-2连接，构建基因I型NDV/LX株病毒全基 因组克隆prLX。

步骤三：NDV/LX的拯救

生物材料准备：

质粒：La Sota株的pCI-NP、pCI-P、pCI-L真核表达质粒[胡顺林，孙庆，吴艳涛，刘秀梵.用 反向遗传技术致弱基因VIId型鹅源新城疫病毒ZJ1株.微生物学报，2007，47(2)：197-200.]由扬州大学农 业部畜禽传染病学重点开放实验室构建、保存。

1、共转染

将La Sota株pCI-NP、pCI-P和pCI-L 3个真核表达质粒与含有NDV/LX基因组cDNA全 长的转录载体(prLX)共转染BSR-T7/5细胞，转染方法同上，60h后将转染样品用封口膜 (parafilm)封好，转移到-70℃低温冰箱反复冻融2次，然后将转染细胞轻轻刮下，与细胞 上清充分混合后接种9～11日龄SPF鸡胚，每个样品接种3枚，0.4mL/枚，37℃孵育。定时 照胚，弃去24h内死亡胚。取出24h后死亡胚置于4℃充分冷却，待鸡胚血管收缩后收集尿 囊液。

2、HA和HI的测定

收集的尿囊液均按OIE标准进行HA测定，所用的红细胞为新鲜制备的1％鸡红细胞。 HA和HI试验中均以NDV/LX母本毒株为阳性对照做同样检测。HA和HI检测均为阳性的 尿囊液样品用无菌PBS作10^-4稀释后继续接种SPF鸡胚，每个稀释度接种3枚，0.2mL/枚， 按上述方法培养后收集尿囊液同样做HA和HI检测。

3、RT-PCR验证获救病毒

将HA和HI检测均为阳性的尿囊液在SPF鸡胚上传两代后，收集尿囊液抽提病毒的RNA， 用于RT-PCR反应，用引物M1和M2扩增NDV/LX M基因区域长度约为1.0kb的片段，M 基因ORF内的966位核苷酸有一个G→A的突变(图2)，从而证明病毒的基因组源于转录 载体prLX。

引物序列为：

M1：5’-ACAAGACACAGGGGACGGGAAGAAG-3’(SEQ ID NO.35)

M2：5’-AGTTGAAGGGATTGTATTTGGCA-3’(SEQ ID NO.36)

步骤四：RT-PCR检测NDV/LX株组织分布特性

为了证实NDV/LX在鸡体呼吸道和肠道的复制情况，通过RT-PCR评估病毒在NDV/LX免 疫组SPF鸡(14日龄免疫)组织中分布，并与La Sota、QV4免疫组相比较，结果见表1。NDV/LX 在气管和肺中的存在是暂时的，仅能在接种后4天和7天检测到。早在感染后24小时，NDV/LX 的核酸就能在十二指肠检测到，而且直到接种后15天仍能检测到；在接种后4到15天可在盲 肠扁桃体中检测到病毒RNA。接种后1到11天在呼吸器官中用RT-PCR可扩增出病毒，证实La Sota毒株的嗜呼吸道特性。

步骤五：NDV/LX株和疫苗株的免疫效力试验

100只1日龄SPF鸡分成4组，每组25只饲养于生物安全3级隔离器中，在14日龄通 过滴鼻/点眼接种10⁶ EID50/0.1mL(PBS稀释)NDV/LX、La Sota和QV4，对照组同样用 0.1mL PBS滴鼻/点眼。

在免疫后7、14、21、28天，每组随机选择8只鸡采血，血清样品进行ELISA(IDEXX) 试验测定血清中抗体水平。

每只试验鸡于免疫后4周接种10⁶ELD50/0.1mL的新城疫VII型强毒I4株。攻毒后连 续观察7天，统计发病和死亡情况，并于攻毒后第4d采集气管与泄殖腔棉拭样品用于病毒 的分离。

表1.RT-PCR检测病毒在组织中分布

^a表示接种后天数.

^b缩写代表：T.气管；L，肺；I.十二指肠；Ct.盲肠扁桃体；+.RT-PCR阳性-.RT-PCR阴性.

NDV/LX、La Sota和QV4免疫组鸡均未发病，而攻毒对照组鸡在攻毒后5d全部死亡(见 表2)。

表2免疫效力试验结果

虽然三种疫苗的免疫保护率均达到100％，但在病毒分离率上，各免疫组的情况却不相 同，NDV/LX免疫组鸡的病毒分离率明显低于QV4和La Sota免疫组(见表3)，另外，攻毒 对照组鸡喉气管和泄殖腔的病毒分离率均为10/10。

NDV/LX、La Sota和V4免疫组不同时间点采集的样品的ELISA结果，NDV/LX、QV4 与La Sota免疫组的IgG水平呈现逐渐上升的趋势(见图3)，在IgG水平上没有明显的差异， 但是与非免疫组的抗体水平在统计学上有明显差异(P＜0.05)。

气管、十二指肠冲洗物和胆汁中IgA抗体水平分别见图4。气管冲洗物中IgA抗体水平 代表呼吸道粘膜免疫应答，表明NDV/LX与La Sota能够诱导产生NDV特异性IgA，两者的 IgA抗体水平不同，NDV/LX比La Sota免疫组IgA抗体水平略高，但差异不明显(P＞0.05)， 但两者与QV4免疫组的差异显著(P＜0.05)。QV4与NDV/LX免疫组肠道冲洗物中都产生 了NDV特异的IgA抗体，而且NDV/LX免疫组的抗体水平略高于QV4免疫组，但差异不 明显(P＞0.05)，而两者都明显高于La Sota免疫组(P＜0.05)。NDV/LX和QV4免疫组胆汁 中的IgA抗体水平显著高于La Sota免疫组(P＜0.05)，而NDV/LX免疫组IgA抗体水平与 QV4免疫组没有显著的差异(P＜0.05)。

表3攻毒后第4d病毒分离结果

                         SEQUENCE LISTING

 

<110>  扬州大学

 <120>  新城疫病毒高粘膜免疫水平弱毒疫苗株NDV/LX及反向遗传构建系统

 <130> 

 <160>  37   

 <170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  1

ttagaaaaaa cacgggtaga agat                                            24

  

<210>  2

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  2

aggtagaacg gatgttgtga a                                               21

  

<210>  3

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  3

agacgcacgg gtagaaggtg tga                                             23

  

<210>  4

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列 

<400>  4

aacggcagag agttgcttgc tcc                                             23

  

<210>  5

<211>  22

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  5

ttcaggaccg gagcaagcaa ct                                              22

  

<210>  6

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  6

gatccagaat cttctacccg tgt                                             23

  

<210>  7

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  7

tacccaacgc gctgtcgcag tga                                             23

  

<210>  8

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  8

ggcctctctt accgttctac ccgt                                            24

  

<210>  9

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  9

tactccagat cagatgagag ccacta                                          26

  

<210>  10

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  10

gcccttccga gttttatcat tctct                                           25

 

 <210>  11

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  11

gataatacgg gtaggacatg gcg                                             23

  

<210>  12

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  12

gaagaagtga ggtaggccca tca                                             23

  

<210>  13

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  13

ccgtcttaac tggagatatc agaca                                           25

  

<210>  14

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  14

tgaagatagc taagtcaagt ctcgc                                           25

  

<210>  15

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  15

cagtttatgt atgatcctag ccc                                             23

  

<210>  16

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  16

cctaacagag atttggtgaa tgac                                            24

  

<210>  17

<211>  36

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  17

cgtctcgtat agggaccaaa cagagaatcc gtaagg                               36

  

<210>  18

<211>  34

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  18

tgactagttg tgttcgcgtc tgtgacctgg tttc                                 34

  

<210>  19

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  19

ggcatcatca acgtctgact caacaacagg                                      30

  

<210>  20

<211>  31

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  20

cgtctcggtc tacctccaca tcaatagtga c                                    31

  

<210>  21

<211>  31

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  21

gaagactaga cccgaagagc ccgttggtca a                                    31

  

<210>  22

<211>  32

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  22

cgtctcgtcg agatatcaag attgcctgtc ac                                   32

  

<210>  23

<211>  32

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  23

acgtcgactg agcttgggaa tgtcaacaac tc                                   32

  

<210>  24

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  24

cagttgactc aaccggctag acctggcttc                                      30

  

<210>  25

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  25

gcattgccga aatatccaat accctc                                          26

  

<210>  26

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  26

gactctaaga actctatcaa gagacggt                                        28

  

<210>  27

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  27

tacgacccta tcaccaatct gagcat                                          26

  

<210>  28

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  28

cctcattatc ctctgtatgc acgcca                                          26

  

<210>  29

<211>  29

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  29

tggaaatgga gattgggcca gtctgtgta                                       29

  

<210>  30

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  30

ccacgcgtcg agtgcaagag actaatagtt                                      30

  

<210>  31

<211>  31

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  31

tcactagtca atcacgacgg gtcacaccaa c                                    31

  

<210>  32

<211>  34

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  32

cgtctctacc caccaaacaa agatttggtg aatg                                 34

  

<210>  33

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  33

cgtagaaaaa acacgggtag aaga                                            24

  

<210>  34

<211>  24

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  34

caggtaggtr gcacgcatat tatt                                            24

  

<210>  35

<211>  25

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  35

acaagacaca ggggacggga agaag                                           25

  

<210>  36

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

 <400>  36

agttgaaggg attgtatttg gca                                             23

  

<210>  37

<211>  15186

<212>  DNA

<213>  新城疫病毒（Newcastle disease virus)

 <400>  37

accaaacaga gaatccgtaa ggtacgatag aaggcgaagg agcaatcgaa gtcgtacggg     60

 tagaaggtgt gaatctcgag tgcgagcccg aagctcaaac tcgagagagc cttctgccaa    120

 aatgtcttct gtattcgatg agtacgagca gctcctcgcg gctcagactc gccccaatgg    180

 agctcatggc ggaggagaga aggggagcac cttaaaggta gaagtcccgg tattcactct    240

 caacagtgat gacccagaag atagatggaa ctttgcagtg ttttgtcttc ggattgctgt    300

 tagcgaggat gccaacaaac cacttaggca aggtgctctc atatctctct tatgttccca    360

 ctctcaagtg atgaggaacc atgttgccct tgcggggaaa cagaatgagg ccacactggc    420

 tgttcttgag atcgatggtt ttaccaacgg cgtgccccag ttcaacaaca ggagtggagt    480

 gtctgaagag agagcacaga gatttatgat gatagcaggg tctctccctc gggcatgcag    540

 caacggtacc ccgttcgtca cagctggggt tgaagatgat gcaccagaag acattactga    600

 taccctggag aggatcctct ctatccaggc tcaagtatgg gtcacggtgg caaaggccat    660

 gactgcatat gagacagcag atgagtcaga aacaagaaga atcaataagt acatgcagca    720

 aggcagggtc cagaagaagt acatcctcca ccccgtatgc aggagcgcaa tccaactcac    780

 aatcagacag tctctggcgg tccgcatctt tttggttagc gagcttaaga gaggccgcaa    840

 cacggcaggt gggacctcca cctattacaa cttggtgggg gatgtagact catacatcag    900

 gaacactggg ctaactgcat tcttcctgac acttaaatat ggaattaaca ccaagacatc    960

 agcccttgca cttagcagcc tctcaggcga tatccagaaa atgaagcagc tcatgcgctt   1020

 gtatcggatg aaaggagata atgcgccgta catgacattg ctcggtgaca gtgaccagat   1080

 gagctttgca cctgccgagt atgcacaact ttactccttt gccatgggta tggcatcagt   1140

 cctagataaa ggaactagca aataccaatt tgccagggac tttatgagca catcattctg   1200

 gagacttgga gtagagtacg ctcaggctca aggaagtagc atcaatgagg atatggccgc   1260

 cgagctaaag ctaaccccag cagcaaggag aggcctggca gctgctgccc aaagagtgtc   1320

 tgaggagacc agcagcatgg acatgcccac ccaacaagcc ggggtcctca ctggactcag   1380

 cgacggaggc tcccaagccc cccaaggtgc actgaacaga tcacaagggc aaccggacac   1440

 cggggatggg gagacccaat ttctggatct gatgagagcg gtggcaaata gcatgagaga   1500

 agcgccaaac tctgcgcagg gcacccctca accggggcct cccccaaccc ctgggccctc   1560

 tcaagacaat gacaccgact gggggtactg accgacagca cccagtttgc ttctatgagg   1620

 tcatcccaat tcctctgccc acaccccacc cctcaatccg caatcccgca tggccaaacc   1680

 cacaaacgaa cccccctgtc tccctcctct cccccagccc tacaacccca cctgcccagg   1740

 gcaacatagg tacaatgcga cccactaata atcaatacag ggccaaagaa attagaaaaa   1800

 agtacgggta gaagggagac attcagagat cagggcgagt cacccgggtc tctgctctcc   1860

 cttctaccta gtggattagg atggagatgg ccacctttac agatgcggag atcgacgagc   1920

 tatttgagac cagtggaact gtcattgaca gcataattac ggcccaggga aaaccagtag   1980

 agactgttgg aaggagtgca atcccacaag gcaaaactaa ggctttgagc gcagcatggg   2040

 agaagcatgg gagcatccag tcaccagcca gccaagacac ccctgatcga caggacagat   2100

 cagataaaca actgtccaca cccgagcaag cgagtccaaa cgacagcccc ccagccacat   2160

 ccactgacca gcctcccact caggctgcag atgaggccgg cgatacacag ctcaagaccg   2220

 gagcaagcca ctctctgctg tcgatgcttg ataaactcag caataggtca tctaatgcta   2280

 aaaagggccc agggtcgagc cctcaagaaa ggcatcatca acgtctgact caacaacagg   2340

 ggagtcaaca aagccgcgga aacagccaag agagaccgca gaaccaggcc aaggccatcc   2400

 ctggaaacca ggtcacagac gcgaacacag catatcatgg acaatgggag gagtcacaac   2460

 tatcagctgg tgcaacccat catgctctcc gatcagagca gagccaagac aatactcctg   2520

 cacctgtgga tcatgtccag ctacctgtcg actttgtgca ggcgatgatg tctatgatgg   2580

 aggcgatatc acagagggta agtaaagttg actatcagct ggaccttgtc ttgaaacaga   2640

 catcttctat ccccatgatg cggtctgaaa tccagcagct gaaaacgtct gttgcggtca   2700

 tggaagccaa tttgggcatg atgaagatcc tggaccctgg ttgtgccaac gtttcatctc   2760

 taagtgatct acgggcagtt gcccgatccc acccggtttt aatttctggc cccggagacc   2820

 catctcctta tgtgacccaa gggggcgaaa tggcactcaa taaactttcg caaccggtgc   2880

 aacacccctc tgaattgatt aaacccgcca cggcaagcgg gcctgatata ggagtggaga   2940

 aagacactgt ccgtgcattg atcatgtcac gccctatgca tccgagctct tcagctaggc   3000

 tcttgagcaa actggacgca gccggatcga ttgaggaaat cagaaaaatc aagcgccttg   3060

 cactgaatgg ctaatcacca ccgcaacccg cagcagatcc ctgtccaccc agcaccacac   3120

 ggtatctgca ccaagctcct ctctgcaaac ccaaggtcca acaccccgag cgacaaccct   3180

 gtcctgcttc ctctgcccca ctaaatgatc gcgcagctgc aatcaattca gctatattaa   3240

 ggattaagaa aaaatacggg tagaatcgga gtgccccgat tgtgccaaga tggactcatc   3300

 taggacaatc gggctgtact ttgattctac ccttccttct agcaacctgc tagcattccc   3360

 gatagtccta caagacacag gggacgggaa gaagcaaatc gccccgcaat acaggatcca   3420

 gcgtcttgac tcgtggacag acagcaaaga agactcggta ttcatcacca cctatggatt   3480

 catctttcag gttgggaatg aagaagccac tgtcggcatg atcaatgata atcccaagcg   3540

 cgagttactt tccactgcca tgctatgcct agggagtgta ccaaatgtcg gagatcttgt   3600

 tgagctggca agggcctgcc tcactatggt ggtaacatgc aagaagagtg caactaacac   3660

 cgagagaatg gtcttctcag tagtgcaggc accccaggtg ctgcaaagct gtagggttgt   3720

 ggcaaacaaa tactcgtcgg tgaatgcagt caagcacgtg aaagcaccag agaagattcc   3780

 tgggagcgga accctagagt acgaagtgaa ctttgtctct ctgaccgtgg tgccaagaaa   3840

 ggacgtctac aagataccaa ctgcagcact taaggtctct ggctcaagtc tgtacaatct   3900

 tgcgctcaat gtcactattg atgtggaggt agacccgaag agcccgttgg tcaaatccct   3960

 ttccaagtcc gacagtgggt actatgctaa tctcttctta catattgggc ttatgtccac   4020

 tgtagataag aaggggaaga aagtgacatt tgacaagctg gaaaggaaga taaggagact   4080

 tgatctatct gtagggctta gtgacgtgct cggaccttcc gtgcttgtaa aggcgagagg   4140

 tgcacggact aagctgctgg cacctttctt ctctagcagt gggacagcct gctatcccat   4200

 agcaaatgcc tctcctcagg tggccaagat actctggagc caaaccgcgt acctgcggag   4260

 tgtaaaagtc attatccaag cgggcaccca gcgtgctgtc gcagtgaccg ccgaccacga   4320

 ggttacctct actaagctgg agaaggggca taccattgcc aaatacaatc ccttcaagaa   4380

 ataggctgca tctctgagat tgcactccgc ccatcttccc ggatcaccat gacactaaat   4440

 aatgatctgt cttgattact tatagttagt tcgcctgtct atcaaattag aaaaaacacg   4500

 ggtagaagat tctggatccc ggttggcgcc ttcaaggtgc aagatgggca ccagatcttc   4560

 taccaggatc ccagtacctc tcatgctgac cgtccgagtc atgttggcac tgagttgcgt   4620

 ctgtccgacc agcgctcttg atggcaggcc tcttgcagct gcagggattg tggtaacagg   4680

 agacaaagca gtcaacatat acacctcatc tcagacaggg tcaatcataa tcaagttact   4740

 cccaaatatg cccaaggata aagaggcgtg tgcaaaagcc ccgttggagg catacaacag   4800

 gacattgact actttgctca ccccccttgg tgattctatc cgtaggatac aagagtctgt   4860

 gaccacgtcc ggaggaggga aacagggacg tcttataggc gccattatcg gtggtgtagc   4920

 tctcggggtt gcaaccgctg cacagataac agcagcctcg gctctgatac aagccaatca   4980

 aaatgctgcc aacatactcc ggctaaaaga gagcattgct gcaaccaatg aggctgtgca   5040

 cgaggtcact aatggattat cacaactagc agtggcagtt gggaagatgc agcaatttgt   5100

 taatgaccag tttaataaaa cagctcagga attggactgt ataaaaatta cacagcaggt   5160

 tggtgtagaa ctcaacctgt acctaactga attgactaca gtattcgggc cacaaatcac   5220

 ttcccctgcc ttaactcagc tgactatcca ggcgctttac aatctagctg gtgggaatat   5280

 ggattacttg ttgactaagt taggtgtggg gaacaaccaa ctcagctcat taattagtag   5340

 tggcctgatc accggcaacc ctattctgta cgactcacag actcaactct tgggtataca   5400

 ggtaacccta ccctcagtcg ggaacctaaa taatatgcgt gccacctacc tggaaacctt   5460

 gtctgtaagt acaaccaaag gatttgcctc agcacttgtc ccaaaagtag tgacacaggt   5520

 cggttccgtg atagaagagc ttgacacctc gtactgtata gagaccgatt tggatctata   5580

 ttgtacaaga atagtgacat tccctatgtc tcctggtatt tattcctgtt tgagtggcaa   5640

 tacatctgct tgcatgtact caaagactga aggcgcactc actacgccgt atatgaccct   5700

 caaaggctca gttattgcta actgtaagat gacaacatgt agatgtgcag accccccggg   5760

 tatcatatcg caaaattatg gagaagctgt gtctctaata gataggcaat catgcaatat   5820

 cttatcctta gacgggataa ctttgaggct cagtggggaa tttgatgcaa cttatcaaaa   5880

 gaatatctca atacaagatt ctcaagtaat agtgacaggc aatcttgata tctcgactga   5940

 gcttgggaat gtcaacaact cgataagtaa tgctttggat aagttagagg aaagcaacag   6000

 caaactagat aaggtcaatg tcaaactgac cagcacatcc gctcttatta cctatatcgt   6060

 tttaactgtc atatctcttg tatgtggtat acttagcctg gttctagcat gctacctgat   6120

 gtacaagcaa aaggcgcaac agaagacctt gttgtggctt gggaataata ccctagacca   6180

 gatgagggcc actacaaaaa tgtgaatgcg gatgagaggc agaaacatcc ccaatagcag   6240

 tttgtgtgta aagtctgaca gcctgttaat tagaagaatt aagaaaaaac taccggatgt   6300

 agatgaccaa agggcgatat acgggtagaa cggtcgggga ggccgtccct caatcgggag   6360

 ccgggcctca caacatccgt tctaccgcat caccaatagc agttttcagt catggaccgc   6420

 gcagttagcc aagttgcgct agagaatgat gaaagagagg caaagaatac atggcgcttg   6480

 gtattccgga tcgcaatcct actctcaacg gtggtgacct tagccatctc tgcagccgcc   6540

 cttgcatata gcatggaggc cagcacacct agcgatcttg taggcatacc gactgcgatc   6600

 tctagagcag aggaaaagat tacatctgca ctcggttcca atcaagatgt agtagatagg   6660

 atatataagc aggtggccct cgaatctcca ctggcattgc taaacaccga atctacaatt   6720

 atgaacgcaa taacgtctct ctcttatcga atcaatgggg ccgcaaatag cagcggatgt   6780

 ggagcaccca ttcatgatcc agattatatt ggaggaatag gtaaagaact tattgtagat   6840

 gatgctagcg acgtcacatc atactatccc tctgcgttcc aagaacacct gaactttatc   6900

 ccggcgccta ctacaggatc aggttgcact cggataccct catttgacat gagcgctacc   6960

 cactactgtt atactcacaa tgtgatatta tctggctgca gagatcactc gcactcacat   7020

 caatatttag cacttggtgt gcttcggaca tctgcaacag ggagggtatt cttttccact   7080

 ctgcgttcca tcaatctgga tgacacccaa aatcggaagt cttgcagtgt gagtgcaacc   7140

 cccttgggtt gtgatatgct gtgctctaaa gtcacagaga ctgaagaaga ggattataac   7200

 tcagctatcc ccacgtcgat ggtacatgga aggttagggt tcgacggcca ataccacgag   7260

 aaggacctag atgtcacaac actattcgag gactgggtgg caaactaccc aggagtaggg   7320

 ggcgggtctt ttattgacaa ccgcgtatgg ttcccagttt acggagggct aaaacccaat   7380

 tcgcccagtg acaccgcaca agaagggaaa tatgtaatat acaagcgata caatgacaca   7440

 tgtccagatg agcaagatta tcagattcaa atggctaagt cttcatataa gcctgggcgg   7500

 tttggaggga aacgcgtaca gcaggccatc ttatctatca aagtgtcaac atccttgggc   7560

 gaggacccgg tactgactgt accgcccaac acagtaacac tcatgggggc cgaaggcaga   7620

 gttctcacag tagggacatc tcatttcctt tatcagcgag ggtcatcata cttctcccct   7680

 gccctactat atcctatgat agtcagcaac aaaacagcca ctcttcatag tccttataca   7740

 ttcaatgcct tcactcgacc aggtagtgtc ccttgccagg cttcagcaag atgccctaac   7800

 tcatgtgtta ccggagtcta tactgatcca tatcccttgg tcttctatag gaaccacacc   7860

 ttgcgagggg tattcgggac gatgcttgat gataaacaag caagactcaa ccctgtatct   7920

 gcagtatttg acagcatatc ccgcagtcgc ataacccggg tgagttcaag cagcaccaag   7980

 gcagcataca caacatcaac atgttttaaa gttgtaaaga ccaataaaac ctattgtctc   8040

 agcattgccg aaatatccaa taccctcttc ggggaattca gaatcgtccc tttactagtt   8100

 gagattctca aggatgatgg ggttagagaa gccaggtcta gccggttgag tcaactgcga   8160

 gagggttgga aagatgacat tgtatcacct atcttttgcg acgccaagaa tcaaactgaa   8220

 taccggcgcg agctcgagtc ctacgctgcc agttggccat aatcagctag tgctaatgtg   8280

 attagattaa gtcttgtcgg tagtcacttg attaagaaaa aatgtgggtg gtagcgggat   8340

 ataaggcaaa acaactcaag gaggatagca cgggtaggac atggcgagct ccggtcccga   8400

 gagggcggag catcagatta tcctaccaga gtcacacctg tcttcaccat tagtcaagca   8460

 caaactactc tattactgga aattaactgg gctaccactc cctgacgagt gtgacttcga   8520

 ccacctcatt ctcagccgac aatggaagaa aatacttgaa tcggcctccc ctgacactga   8580

 gagaatgata aaacttggaa gggcagtgca ccagactctc aaccacaatt ccaagataac   8640

 cggagtactc catcccaggt gtttagaaga attggctagt attgaggttc ctgactcaac   8700

 caacaagttt cggaagatcg agaagaaaat ccaaattcac aacacaaggt atggagaact   8760

 gttcacaaga ctgtgcacgc atgtagagaa gaaattgttg ggatcatctt ggtctaataa   8820

 tgtcccccgg tcagaagagt tcaacagcat ccgtacagat ccggcattct ggtttcactc   8880

 aaaatggtcc acaactaagt ttgcatggct ccatataaaa cagattcaaa ggcatctgat   8940

 tgtggcagca agaacaaggt ccgcagccaa caaattggtg acgctgaccc ataaggtagg   9000

 ccaagtcttt gttactcctg agcttgtcat tgtgacacat acagatgaga acaagttcac   9060

 gtgtcttacc caggaacttg tgttgatgta tgcagatatg atggagggca gagatatggt   9120

 caacataata tcatccacgg cggcacatct caggagccta tcagagaaaa ttgatgacat   9180

 tctgcggtta gtagatgccc tggcaaaaga tctgggtaat caagtctacg atgttgtagc   9240

 actcatggag ggatttgcat acggcgccgt ccagctgctt gagccgtcag gtacattcgc   9300

 aggggatttc ttcgcattca acctgcagga gctcaaagac actttgatcg gcctccttcc   9360

 taaggatata gcagaatctg tgactcacgc aatagccact gtattctctg gcttagaaca   9420

 aaatcaagcg gctgagatgc tgtgcctgtt gcgtctatgg ggccacccat tacttgagtc   9480

 ccgtattgcg gcaaaagcag taaggagcca aatgtgcgca ccaaaaatgg tagactttga   9540

 tatgatcctc caggtattgt ctttctttaa aggaacaatt atcaacggat acagaaagaa   9600

 gaatgcaggt gtttggccac gtgtcaaagt agatacgata tacgggaagg tcattgggca   9660

 gctacacgct gattcagcgg agatttcaca cgatatcatg ttgagagagt acaagagttt   9720

 atctgcgctt gaattcgagc catgtataga atacgaccct atcaccaatc tgagcatgtt   9780

 tctaaaagac aaggcgatcg cacacccgaa agacaactgg ctcgccgcgt ttaggcgaaa   9840

 ccttctctct gaggaccaga agaaacatgt aaaggaggca acctctacta accgtctctt   9900

 gatagagttc ttagagtcaa atgattttga tccatataag gagatggaat atctgacgac   9960

 ccttgagtac caaagagatg acaatgtggc agtatcatac tcgctcaagg agaaggaagt  10020

 gaaggttaat gggcggattt ttgctaagct aacaaagaaa ttaaggaact gtcaagtgat  10080

 ggcggaaggg atcttagctg accagattgc acctttcttt caagggaatg gggtcattca  10140

 ggatagcata tctttaacca agagtatgct agcgatgagt caattgtctt tcaacagcaa  10200

 taagaaacgt atcactgact gcaaagaaag agtagcctca aaccgcaatc acgatcaaaa  10260

 gagcaagaat cgtcggagag ttgccacttt tataacgact gacctgcaaa agtactgtct  10320

 taattggaga tatcagacaa tcaaactgtt cgctcatgcc atcaatcagc tgatgggctt  10380

 acctcacttc ttcgaatgga ttcatctaag actaatggat actacgatgt ttgtaggaga  10440

 ccctttcaat cccccaagtg acccaactga ctgtgatctc tcaagagtcc caaatgatga  10500

 catatatatt gtcagtgcta gagggggtat tgagggatta tgtcagaagc tatggacaat  10560

 gatctcaatt gctgcaatcc aacttgctgc agcaagatca cattgtcgcg tcgcctgtat  10620

 ggtacagggt gacaatcaag taatagctgt aacgagagag gtaaggtcag atgactcccc  10680

 ggaaatggtg ttaacacaat tgcatcaagc cagtgataat ttcttcaagg aattgattca  10740

 tgttaatcat ttgattggcc ataatttgaa ggatcgtgaa acaatcagat cagacacatt  10800

 cttcatatac agcaaacgaa tattcaaaga tggagcaata ctcagtcaag tcctcaaaaa  10860

 ttcatctaaa ttagtgctaa tatcaggcga ccttagtgaa aacaccgtaa tgtcctgtgc  10920

 caacattgca tctactatag cacggctgtg cgagaacggg cttccaaagg atttctgtta  10980

 ttacttaaac tacctgatga gttgcgtgca gacatacttt gattctgagt tttccatcac  11040

 taacagctcg caccccgatt ctaaccagtc gtggattgaa gacatctctt ttgtgcactc  11100

 atatgtcctg acccctgccc agctaggggg actgagcaac ctccaatact caaggctcta  11160

 cacgaggaac atcggtgacc cgggaactac tgcttttgca gagatcaagc gattagaagc  11220

 agtggggtta ctaagtccta gtattatgac taacatctta actaggccgc ctggaaatgg  11280

 agattgggcc agtctgtgta acgaccctta ctctttcaat tttgagactg tcgcgagtcc  11340

 aaatattgtc cttaagaaac atacacaaag agtcctattt gaaacttgtt caaatccctt  11400

 attatctggc gtgcatacag aggataatga ggcagaagag aaggcgttgg ctgaattttt  11460

 actcaatcaa gaagtaattc atccacgtgt cgcacatgct atcatggaag caagctctat  11520

 aggtaggagg aagcagattc aagggcttgt tgacacaaca aacaccgtaa tcaagattgc  11580

 attgactagg aggccacttg gcatcaagag gctgatgcgg atagttaact actcgagcat  11640

 gcatgcaatg ctgtttagag acgatgtttt ctcatctaac aggtctaacc accccttagt  11700

 ttcctctaat atgtgttctc tgacgctagc agactatgca cggaatagaa gctggtcacc  11760

 attgacgggg ggtagaaaga tactgggtgt atctaatcct gatactatag aacttgtaga  11820

 gggtgagatc cttagcgtca gcggaggatg cacaagatgt gacagcggag atgaacaatt  11880

 cacttggttc catcttccga gcaatataga actgaccgat gacaccagca agaatcctcc  11940

 gatgagagtg ccgtacctcg ggtcaaagac tcaagagagg agggccgcct cgcttgcgaa  12000

 aatagctcat atgtcaccac atgtgaaagc tgctctaagg gcatcatccg tgttgatctg  12060

 ggcttatgga gacaacgaag taaattggac tgctgctctt aaaattgcaa gatctcggtg  12120

 caatataaac tcagagtatc ttcgactatt gtccccctta cccacagctg ggaatctcca  12180

 acatagactg gatgacggca taactcagat gacattcacc cctgcatctc tctacagggt  12240

 gtcaccttat attcacatat ccaatgattc tcaaaggtta ttcacggaag aaggagtcaa  12300

 agagggaaat gtagtttatc agcaaatcat gctcttgggt ttatctctaa tcgaatcact  12360

 cttcccgatg acgacaacca ggacatacga tgagatcaca ttgcacctcc acagtaaatt  12420

 tagctgctgt atcagggaag caccggttgc agttcctttc gagttactcg ggatggcacc  12480

 agaactaagg acagtgacct caaataagtt tatgtatgat cctagtcctg tatcggaggg  12540

 tgactttgcg agacttgact tagctatctt taagagttat gagcttaatc tagaatcata  12600

 tcccacaata gagctaatga acattctttc aatatccagc gggaagttaa tcggccagtc  12660

 tgtggtttct tatgatgaag atacctccat aaagaatgac gccataatag tgtatgacaa  12720

 cacccggaat tggatcagcg aagctcagaa ttcagatgtg gtccgcctat tcgagtatgc  12780

 agcacttgaa gtgcttctcg actgttctta tcagctctac tatctgagag taagaggcct  12840

 agacaatatc gtgttgtata tgagtgactt atataagaat atgccaggaa ttctactttc  12900

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 atgtgcaagg cacgggaatt ccttatactt ggcagaagga agcggagcca ttatgagtct  13740

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 tttggt                                                             15186