Ⅰ类新城疫病毒NP和P基因分子流行病学研究及NDV08-004株反向遗传操作系统的建立

摘要

本研究通过对2008～2010年分离到的60株Ⅰ类新城疫病毒分离株的NP和P蛋白基因进行分子流行病学分析，基本掌握了我国目前Ⅰ类新城疫病毒的分子特征。通过构建Ⅰ类新城疫病毒代表株NDV08-004全长感染性cDNA克隆，并成功拯救出重组病毒，为Ⅰ类新城疫病毒的致病机理和相关蛋白的功能研究奠定了基础。
　　 1．Ⅰ类新城疫病毒NP基因分子特征的研究
　　 本研究对2008～2010年分离到的60株Ⅰ类新城疫病毒的NP基因进行了分子特征和遗传进化关系分析，结果表明所有Ⅰ类新城疫病毒分离株完整NP基因的长度均为1746bp，编码区长度为1470nt，可编码489个氨基酸。通过多序列比对，发现Ⅰ类NDV在NP蛋白基因上的特征性位点，如：D460E和S468T。同源性分析结果显示，Ⅰ类与Ⅱ类NDV的NP蛋白氨基酸同源性在88.0％～92.7％之间，核苷酸同源性在75.2％～79.5％之间。遗传进化树分析表明60株Ⅰ类NDV分离株可分为两个不同的亚型，两个亚型之间NP蛋白氨基酸差异在2.7％～4.1％之间，核苷酸差异在4.6％～7.9％之间。
　　 2Ⅰ类新城疫病毒P基因分子特征的研究
　　 通过对60株Ⅰ类NDV分离株P基因的扩增和分子遗传进化关系分析，结果表明所有的分离株P基因长度均为1463bp，编码区长度为1200nt，可编码399个氨基酸。通过多序列比对，发现Ⅰ类NDV在P蛋白基因上的特征性位点，如：E64D、G67D、N75Q、N81Q、E106D、F187Y、I245V、K304R、A311S、D340E、I354V、S374A。与Ⅱ类NDV相比，所有Ⅰ类NDV均在P基因的编码区插入12nt。同源性分析结果显示，Ⅰ类毒株与Ⅱ类毒株P蛋白的氨基酸同源性在64.5％～72.8％之间，核苷酸同源性在66.3％～72.2％之间。遗传进化分析表明60株Ⅰ类NDV可分为两个不同的亚型，两个亚型之间P蛋白氨基酸的差异在5.7％～9.7％之间，核苷酸差异在5.5％～7.8％之间。
　　 3．Ⅰ类新城疫病毒拯救体系的建立
　　 3.1全长cDNA克隆以及辅助质粒pCI-L的构建
　　 通过设计7对特异性引物，将NDV08-004的基因组分为的7个不同的片段分别克隆至pGEM-Teasy载体，然后利用相应的单酶切位点将7个片段依次亚克隆到LT-pOLTV5转录载体中，成功构建了含NDV08-004全基因组cDNA的转录载体NDV08-004-po，其中7022位C-T的突变可作为拯救病毒的“分子标签”。采用同样的单酶切位点构建了表达L蛋白基因的辅助质粒pCI-L。
　　 3.2NDV08-004的拯救
　　 采用构建的三个辅助质粒（pCI-NP、pCI-P和pCI-L）与基因组NDV08-004-po按照一定比例共转染BSRT7/5细胞，通过将转染细胞及其上清接种SPF鸡胚，结果成功拯救出了具有血凝性的r-NDV08-004，初代血凝价为21og2，传代后血凝价达到71og2以上。通过对分子标签的测序验证证明了病毒的拯救。NDV08-004株的成功拯救为开展Ⅰ类新城疫病毒的致病机制及新型疫苗的研究奠定了基础。