一株分泌表达瑞氏木霉外切葡聚糖酶I的重组酿酒酵母菌株及应用

摘要

本发明提供了一株分泌表达瑞氏木霉外切葡聚糖酶I Tr-Cel7A的重组酿酒酵母菌株，该菌株命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BSXC10，已于2011年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5657。本发明的重组酿酒酵母菌与仅表达Tr-Cel7A的常规酿酒酵母菌株BSXC01相比，产生的胞外Tr-Cel7A酶活提高了的2.56倍，与之前的文献报道相比，胞外Tr-Cel7A酶活提高了8.06倍。本发明的重组酿酒酵母菌株为CBP酵母研究提供了新思路，同时为利用酿酒酵母生产纤维素原料的化工产品提供了可能。

说明书

技术领域

本发明涉及一株分泌表达瑞氏木霉外切葡聚糖酶I Tr-Cel7A的重组酿酒酵母菌株及其 在CBP酵母研究和以纤维素为原料的化工产品生产中的应用。

背景技术

纤维素乙醇是有潜力的未来燃料，纤维素乙醇的生产需要纤维素水解微生物和糖发酵 微生物的协作。CBP(Consolidated bioprocessing)是将纤维素酶和半纤维素酶生产、纤维 素水解和乙醇发酵过程组合或部分组合，通过一种微生物完成。CBP过程有利于降低生物 转化过程的成本，越来越受到研究者的普遍关注。一个成功的CBP菌株不仅需要强有力的 乙醇发酵能力，还需要纤维素水解能力。作为传统的乙醇生产菌株，酿酒酵母被认为是良 好的CBP载体(Lynd LR et al.，Microbiol Mol Biol Rev 2002，66(3)：506-577.)。构建酿酒酵 母CBP菌株的主要策略是在酿酒酵母中高效分泌表达木质纤维素水解酶(Lynd et al.， Microbiol Mol Biol Rev 2002，66(3)：506-577)。

纤维素降解至少需要三种，内切葡聚糖酶(或称1，4-β-D-葡聚糖-葡聚糖水解酶，EC  32.1.4，通常用EG来代表)和外切葡聚糖酶(包括1，4-β-D-葡聚糖-纤维二糖水解酶，EC  32.1.91，用CBH来代表，和1，4-β-D-葡聚糖-葡萄糖水解酶，EC 3.2.1.74)和β-葡萄糖苷 酶(或称为纤维二糖酶，β-葡萄糖苷-葡萄糖水解酶，EC 3.2.1.21，常用BGL来代表) (Karl-Erik Eriksson et al.，In：Springer series in wood science.Berlin/Heidelberg，New York： Springer-Verlag；1990.)。内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶协同作用产生纤维二糖和一些纤维 寡糖，进而β-葡萄糖苷酶水解产生葡萄糖，其中，外切葡聚糖酶对降解微晶纤维素是必需 的。

丝状真菌瑞氏木霉Trichoderma reesei是最强大的纤维素酶生产菌株之一，瑞氏木霉纤 维素酶系统至少由两种外切葡聚糖酶、至少六种内切葡聚糖酶和两种β-葡萄糖苷酶组成， 其中Tr-Cel7A(CBH I)是瑞氏木霉产生的主要纤维素酶，可以水解固体纤维素，并占瑞 氏木霉所分泌纤维素酶的60％(Nidetzky B and Claeyssens M，Biotechnol Bioeng 1994， 44：961-966；J，1991，PhD Thesis，Uppsala University，Sweden)，据文献报道 Tr-Cel7A从纤维素的还原端连续水解纤维素链(Barr B Hsieh et al.，Biochemistry 1996，35(2)： 586-592；Divne C et al.，J Mol Biol 1998，275(2)：309-325；Nutt A et al.，Eur J Biochem 1998， 258(1)：200-206.)。Tr-Cel7A含有513个AA(Shoemaker S et al.，Biotechnology(N.Y.)1983， 1：691-696)，在催化结构域有10个二硫键，在底物结合结构域含有2个二硫键(Guochao  Wu et al.，World J Microbiol Biotechnol 2010，26：323-328.)，另外在催化结构域还含有4个 潜在的N-糖基化位点，蛋白质相对分子量偏大，结构相对比较复杂，这就为其在酿酒酵母 中异源表达增加了难度。

目前，在酿酒酵母中成功实现Tr-Cel7A异源分泌表达的报道不多，ME等 (ME et al.，Gene 1988，63(1)：103-112.)在酿酒酵母中实现了Tr-Cel7A的异源分泌 表达，但重组Tr-Cel7A被过度糖基化修饰；同样Den Haan R等(Den Haan R et al.，Enzyme  Microb Tech 2007，40：1291-1299.)在酿酒酵母中异源分泌表达的Tr-Cel7A也同样被过度糖 基化修饰，Tr-Cel7A酶活仅为10mU g^-1DW。在酿酒酵母中分泌表达异源白，除了过度糖 基化修饰外，蛋白质低分泌效率也同样是限制性因素，要获得良好的CBP酵母，需要提高 Tr-Cel7A的分泌表达量以及酶活性。

发明内容

针对现有技术不足，本发明要解决的问题是提供一株瑞氏木霉外切葡聚糖酶I Tr-Cel7A分泌表达水平较高的重组酿酒酵母菌株及其在CBP酵母研究和以纤维素为原料 的化工产品生产中的应用。

本发明所述的分泌表达瑞氏木霉外切葡聚糖酶I Tr-Cel7A的重组酿酒酵母菌株，其特 征在于：该菌株命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BSXC10，已于2011年12月 27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 5657。

上述的重组酿酒酵母菌株BSXC10，由如下方法制得：

(1)分泌表达载体的构建：以pJFE2为质粒载体构建重组质粒，获得包含外切葡聚 糖酶I基因Tr-cel7A的重组质粒pJCF；

(2)重组菌株构建：将步骤(1)中建立的重组质粒pJCF转化到酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)BSX010 CGMCC No.5748中，并通过筛选得到转化成功的转 化子，即为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BSXC 10菌株。

上述重组酿酒酵母菌株构建方法中：步骤(1)所述外切葡聚糖酶I基因Tr-cel7A来源 于瑞氏木霉Trichoderma reesei，并且包含自身信号肽序列，其序列如SEQ ID NO.1所示。

上述重组酿酒酵母菌株构建方法中：步骤(1)所述质粒载体为pJFE2(Peng B et al.， Metab Eng2012，14(1)：9-18.)，该质粒以YCplac33(Gietz and Akio，Gene 1988，74：527-534.) 为骨架，引入TEF1启动子-PGK1终止子和TDH1启动子-CYC1终止子。

上述重组酿酒酵母菌株构建方法中：步骤(2)所述转化方法优选采用醋酸锂转化法。

上述重组酿酒酵母菌株构建方法中：步骤(2)所述筛选得到转化成功的转化子的方式 优选为：用添加20g/L葡萄糖的含有200μg/ml G418的全合成营养缺陷型培养基SC-Ura 筛选正确的转化子。

上述分泌表达瑞氏木霉外切葡聚糖酶I Tr-Cel7A的重组酿酒酵母菌株，即酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)BSXC10CGMCC No.5657的菌学特征为：CEN.PK102-3A (Entian KD and Kotter P，Method Microbiol 1998，26：431-449.)derivative；MATα ura3-52  leu2-3112；vps10Δ，pmr1Δ，Sc-SSO1，Sc-PDI1，Tr-cel7A，该酵母菌株是单细胞真核微生物， 椭圆形，不运动，营养细胞为单倍体，固体或液体的全合成营养缺陷型培养基(SC-Ura， 该培养基是现有技术中已有的)并且添加200μg/ml G418的培养条件下为出芽生殖，液体 培养条件下以单细胞形式存在，固体培养时，呈菌落存在，菌落表面湿润、光滑，呈乳白 色。

本发明所述的重组酿酒酵母菌株在CBP酵母研究和以纤维素为原料的化工产品生产 中的应用。

本发明创造性地将瑞氏木霉来源的大分子量二硫键丰富的外切葡聚糖酶I Tr-Cel7A在 专用酿酒酵母菌株中实现分泌表达，经实验证实：该重组酿酒酵母菌株能够利用单一碳源 生产外切葡聚糖酶I Tr-Cel7A，在发酵48小时后，重组酿酒酵母菌株产生的胞外Tr-Cel7A 酶活达到90.57mU g^-1DW，与仅表达Tr-Cel7A的常规的酿酒酵母菌株BSXC01产生的胞 外Tr-Cel7A酶活相比，提高了的2.56倍，与之前的文献报道(Den Haan R et al.，Enzyme  Microb Tech 2007，40：1291-1299.)相比，胞外Tr-Cel7A酶活提高了8.06倍。该重组酿酒 酵母菌株为CBP酵母研究提供了新思路，同时为利用酿酒酵母生产纤维素原料的化工产品 提供了可能。

附图说明

本发明涉及的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BSX010，已于2012年02月08 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5748。

本发明涉及的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BSXC10，已于2011年12月27 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5657。

图1：PCR扩增带有筛选标记基因的Sc-VPS10基因的同源重组片段：Sc-VPS10基因 重组臂1-loxP-KanMX4-loxP-重组臂2。

其中1：Sc-VPS10基因重组臂1；2：Sc-VPS10基因重组臂2；3：Sc-VPS10基因重组 臂1-loxP-KanMX4-loxP-重组臂2；M：1kb DNA Ladder。

图2：PCR扩增带有筛选标记基因的Sc-PMR1基因的同源重组片段：Sc-PMR1基因重 组臂1-loxP-KanMX4-loxP-重组臂2。

其中1：Sc-PMR1基因重组臂1；2：Sc-PMR1基因重组臂2；3：Sc-PMR1基因重组臂 1-loxP-KanMX4-loxP-重组臂2；M：1kb DNA Ladder。

图3：PCR验证Sc-VPS10基因和Sc-PMR1基因被正确敲除的转化子。

其中1：以敲除Sc-VPS10基因的转化子为模板，用引物VPSL1和引物VPSL4，扩增 VPS10基因同源重组臂之间的基因片段；2：以敲除Sc-VPS10基因的转化子为模板，用引 物Kanlox-up和Kanlox-down，扩增G418抗性基因片段；3：以敲除Sc-PMR1基因的转化 子为模板，用引物PMRL1和引物PMRL4扩增PMR1基因同源重组臂之间的基因片段；4： 以敲除Sc-PMR1基因的转化子为模板，用引物Kanlox-up和Kanlox-down，扩增G418抗 性基因片段。

图4：PCR验证G418筛选标记被丢失的转化子。

其中1：以Sc-VPS10基因被敲除的转化子基因组为模板，用引物VPSL1和引物VPSL4， 扩增Sc-VPS10基因同源重组臂之间的基因片段；2：以Sc-VPS10基因被敲除的转化子基因 组为模板，用引物Kanlox-up和Kanlox-down，扩增G418抗性基因片段；3：以Sc-PMR1 基因被敲除的转化子基因组为模板，用引物PMRL1和引物PMRL4，扩增Sc-PMR1基因 同源重组臂之间的基因片段；4：以Sc-PMR1基因被敲除的转化子基因组为模板，用引物 Kanlox-up和Kanlox-down，扩增G418抗性基因片段。

图5：PCR扩增带有BamH I酶切位点的Sc-PDI1基因片段。

其中1：BamH I-PDI1基因片段；M：1kb DNALadder。

图6：PCR扩增带有BamH I酶切位点的Sc-SSO1基因片段。

其中M：1kb DNALadder；1：BamH I-SSO1基因片段。

图7：Bgl II酶切线性化pYMIKP。

其中M：1kb DNALadder；1：BglII酶切的pYMIKP。

图8：PCR扩增BamH I-PGK1p-PDI1-PGK1t基因片段以及BamH I酶切pYMIKP-SSO1。

其中1：BamH I-PGK1p-PDI1-PGK1t基因片段；M：1kb DNALadder；2：BamH I酶 切的pYMIKP-SSO1。

图9：过表达Sc-PDI1和Sc-SSO1基因使用的重组质粒pYMIKP-SSO1-PDI1构建过程。

图10：PCR验证Sc-PDI1基因是否整合到基因组上。

其中1：PDI1-PGKt基因片段；M：1kb DNA Ladder。

图11：PCR验证Sc-SSO1基因是否整合到基因组上。

其中1：SSO1-PGKt基因片段；M：1kb DNA Ladder。

图12：XbaI酶切Tr-cel7A。1：XbaI酶切的Tr-cel7A；M：1kb DNA Ladder。

图13：XbaI酶切pJFE2。1：XbaI酶切的pJFE2；M：1kb DNA Ladder。

图14：分泌表达Tr-cel7A基因使用的重组质粒pJCF。

图15：PCR验证重组细胞中含有Tr-cel7A基因。

其中1：Tr-cel7A；M：1kb DNALadder。

图16：重组酵母BSXC10产生的胞外Tr-Cel7A酶活测定。

其中：▲：BSXC00(pJFE2)；■：BSXC01(Tr-cel7A)；●：BSXC10(vps10Δ，pmr1Δ， Sc-SSO1，Sc-PDI1，Tr-cel7A)。

具体实施方式

实施例1：制备对分子量大且二硫键丰富的异源蛋白分泌能力提高的酿酒酵母菌株： 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)B SX010

〖1〗参与蛋白运输过程的蛋白质误分拣途径受体基因Sc-VPS10的敲除

方法如下：

(1)PCR扩增Sc-VPS10基因的重组臂：以酿酒酵母CEN.PK102-3A基因组为模板， 用引物VPSL1和引物VPSL2，扩增得到200bp的重组臂1(图1)，用引物VPSL3和引物 VPSL4，扩增得到200bp的重组臂2(图1)；

其中，上述VPSL1、VPSL2、VPSL3和VPSL4引物序列为：

VPSL1：5’-ACAGCATGATGCAACAGCT-3’

VPSL2：5’-TATTAAGGGTTGTCGACCTGCACTTCAGGGCTTTTCCA-3’

VPSL3：5’-TGATATCAGATCCACTAGTGTAGATAATTCCATATACTTTT-3’

VPSL4：5’-CCGTAACATATGATATATCC-3’

PCR反应体系如下：(引物浓度为10μM)

PCR反应条件：94℃预变性10分钟，94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延 伸1分钟，30个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。胶回收纯化浓缩Sc-VPS10基因的 重组臂1和重组臂2。

(2)PCR扩增带有筛选标记基因的同源重组片段：以步骤(1)得到的重组臂1和 重组臂2以及质粒pUG6(Güldener U et al.Nucleic Acids Res 1996，24(13)：2519-2524.)为 模板，用引物VPSL1和引物VPSL4，通过融合PCR扩增得到1984bp的两端带有重组臂 以及带有loxP位点的G418抗性的筛选标记基因片段：Sc-VPS10基因重组臂 1-loxP-KanMX4-loxP-重组臂2(图1)；

其中，上述VPSL1和VPSL4引物序列为：

VPSL1：5’-ACAGCATGATGCAACAGCT-3’

VPSL4：5’-CCGTAACATATGATATATCC-3’

PCR反应体系如下：(引物浓度为10μM)

PCR反应条件：94℃预变性10分钟，94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延 伸2分钟，30个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。胶回收纯化浓缩同源重组片段： Sc-VPS10基因重组臂1-loxP-KanMX4-loxP-重组臂2。

(3)同源重组片段转化敲除Sc-VPS10基因：转化25微升步骤(2)得到的基因片 段Sc-VPS10基因重组臂1-loxP-KanMX4-loxP-重组臂2转化酿酒酵母CEN.PK102-3A，通 过含200μg/ml G418的YPD(2％glucose)平板筛选转化子；

(4)PCR验证酿酒酵母转化子：提取步骤(3)所得转化子的基因组，以基因组为 模板，用引物VPSL1和引物VPSL4以及Kanlox-up和Kanlox-down，PCR扩增得到1984 bp的同源重组臂之间的基因片段和1584bp的G418抗性基因片段(图3)；

其中，上述Kanlox-up和Kanlox-down引物序列为：

Kanlox-up：5’-CAGGTCGACAACCCTTAAT-3’

Kanlox-down：5’-CACTAGTGGATCTGATATC-3’

PCR反应体系如下：(引物浓度为10μM)

PCR反应条件：94℃预变性10分钟，94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延 伸2分钟，30个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。

(5)Cre重组酶表达载体转化：转化25微升质粒pSH47(Güldener U et al.Nucleic  Acids Res 1996，24(13)：2519-2524.)到步骤(4)验证正确的重组转化子，用SC-Ura平板 筛选转化子；

(6)Cre重组酶诱导表达：将步骤(5)所得重组子在液体YPD中培养过夜，收集 菌体，用无菌水洗涤两次，将菌体接入YPG培养基(2％galactose)培养步骤(5)所得转 化子2h诱导表达Cre重组酶，将诱导培养液涂布于YPD平板分离单菌落；

(7)筛选G418抗性筛选标记去除菌落：将步骤(6)所得单菌落分别点于无G418  YPD平板和含200μg/ml G418YPD平板，在YPD平板上生长并且在含G418YPD平板上 不生长的转化子即为G418抗性筛选标记去除菌落；

(8)PCR验证Cre-loxP重组的重组子：提取步骤(7)所得G418抗性筛选标记去 除菌落的基因组，以基因组DNA为模板，用引物VPSL1和引物VPSL4，PCR扩增得到 400bp的片段(图4)，用引物Kanlox-up和Kanlox-down，PCR不能扩增到G418抗性基 因，验证后得到正确发生Cre-loxP重组的重组子；

PCR反应体系如下：(引物浓度为10μM)

PCR反应条件：94℃预变性10分钟，94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延 伸2分钟，30个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。

(9)5-FOA丢失质粒pSH47：将步骤(8)所得重组子在液体YPD中转接培养过夜， 划线于5-FOA培养基平板筛选去除质粒pSH47，最终得到酿酒酵母菌株BSX002。

〖2〗位于高尔基体膜上P-型Ca²⁺/Mn²⁺ATPase基因Sc-PMR1的敲除

方法如下：

(1)PCR扩增Sc-PMR1基因的重组臂：以酿酒酵母CEN.PK102-3A基因组为模板， 用引物PMRL1和引物PMRL2，扩增得到200bp的重组臂1(图2)，用引物PMRL3和引 物PMRL4，扩增得到200bp的重组臂2(图2)；

其中，上述VPSL1、VPSL2、VPSL3和VPSL4引物序列为：

PMRL1：5’-TGTTCCCTAGGCCATCGT-3’

PMRL2：5’-TATTAAGGGTTGTCGACCTGACACTTAAGCTTACGTCTG-3’

PMRL3：5’-TGATATCAGATCCACTAGTGTCGTTTTTCCTTCCTTCCC-3’

PMRL4：5’-TCTAGTCCGGAAAAAGAAG-3’

PCR反应体系如下：(引物浓度为10μM)

PCR反应条件：94℃预变性10分钟，94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延 伸1分钟，30个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。胶回收纯化浓缩Sc-PMR1基因的 重组臂1和重组臂2。

(2)PCR扩增带有筛选标记基因的同源重组片段：以步骤(1)得到的重组臂1和 重组臂2以及质粒pUG6为模板，用引物PMRL1和引物PMRL4，通过融合PCR扩增得 到1984bp的两端带有重组臂以及带有loxP位点的G418抗性的筛选标记基因片段： Sc-PMR1基因重组臂1-loxP-KanMX4-loxP-重组臂2(图2)；

其中，上述PMRL1和PMRL4引物序列为：

PMRL1：5’-TGTTCCCTAGGCCATCGT-3’

PMRL4：5’-TCTAGTCCGGAAAAAGAAG-3’

PCR反应体系如下：(引物浓度为10μM)

PCR反应条件：94℃预变性10分钟，94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延 伸2分钟，30个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。胶回收纯化浓缩同源重组片段： Sc-PMR1基因重组臂1-loxP-KanMX4-loxP-重组臂2。

(3)同源重组片段转化酿酒酵母以敲除Sc-PMR1基因：转化25微升步骤(2)得 到的基因片段Sc-PMR1基因重组臂1-loxP-KanMX4-loxP-重组臂2到实施例1所得酿酒酵 母BSX002中，通过含200μg/ml G418的YPD(2％glucose)平板筛选转化子；

(4)PCR验证酿酒酵母转化子：提取步骤(3)所得转化子的基因组，以基因组为 模板，用引物PMRL1和引物PMRL4以及Kanlox-up和Kanlox-down，PCR扩增得到1984 bp的同源重组臂之间的基因片段和1584bp的G418抗性基因片段(图3)；

其中，上述Kanlox-up和Kanlox-down引物序列为：

Kanlox-up：5’-CAGGTCGACAACCCTTAAT-3’

Kanlox-down：5’-CACTAGTGGATCTGATATC-3’

PCR反应体系如下：(引物浓度为10μM)

PCR反应条件：94℃预变性10分钟，94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延 伸2分钟，30个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。

(5)Cre重组酶表达载体转化：转化25微升质粒pSH47到步骤(4)验证正确的重 组转化子，用SC-Ura平板筛选转化子；

(6)Cre重组酶诱导表达：将步骤(5)所得重组子在液体YPD中培养过夜，收集 菌体，用无菌水洗涤两次，将菌体接入YPG培养基(2％galactose)培养步骤(5)所得转 化子2h诱导表达Cre重组酶，将诱导培养液涂布于YPD平板分离单菌落；

(7)筛选G418抗性筛选标记去除菌落：将步骤(6)所得单菌落分别点于无G418  YPD平板和含200μg/ml G418YPD平板，在YPD平板上生长并且在含G418YPD平板上 不生长的转化子即为G418抗性筛选标记去除菌落；

(8)PCR验证Cre-loxP重组的重组子：提取步骤(7)所得G418抗性筛选标记去 除菌落的基因组，以基因组DNA为模板，用引物PMRL1和引物PMRL4，PCR扩增得到 400bp左右的片段(图4)，用引物Kanlox-up和Kanlox-down，PCR不能扩增到G418抗 性基因，验证后得到正确发生Cre-loxP重组的重组子；

PCR反应体系如下：(引物浓度为10μM)

PCR反应条件：94℃预变性10分钟，94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延 伸2分钟，30个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。

(9)5-FOA丢失质粒pSH47：将步骤(8)所得重组子在液体YPD中转接培养过夜， 划线于5-FOA培养基平板筛选去除质粒pSH47，最终得到酿酒酵母菌株BSX006。

〖3〗参与蛋白质折叠过程的二硫键异构酶基因Sc-PDI1和参与蛋白质运输过程的 质膜t-SNARE基因Sc-SSO1的过表达

方法如下：

(1)PCR扩增Sc-PDI1基因和Sc-SSO1基因：以酿酒酵母CEN.PK102-3A基因组为 模板，用引物BPDIF和BPDIR，扩增BamH I-PDI1基因片段(图5)，用引物BSSOF和 BSSOR，扩增BamH I-SSO1基因片段(图6)；

其中，上述BPDIF、BPDIR、BSSOF和BSSOR引物序列为：

BPDIF：5’-CGCGGATCCATGAAGTTTTCTGCTGGTGCC-3’

BPDIR：5’-CGCGGATCCTTACAATTCATCGTGAATGGC-3’

BSSOF：5’-CGCGGATCCATGAGTTATAATAATCCGTAC-3’

BSSOR：5’-CGCGGATCCTTAACGCGTTTTGACAACGGC-3’

PCR反应体系如下：(引物浓度为10μM)

PCR反应条件：98℃预变性5分钟，98℃变性10秒，56℃退火15秒，72℃延伸 2分钟，30个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。胶回收纯化浓缩BamH I-PDI1基因片 段和BamH I-SSO1基因片段。

(2)重组质粒pYMIKP-PDI1和pYMIKP-SSO1的构建：将步骤(1)所得BamH  I-PDI1基因片段和BamH I-SSO1基因片段通过BamH I酶切，将空质粒pYMIKP(Liu et al.， Journal of Shandong University(Natural Science)2005，40(3)：105-109.)通过Bgl II酶切(图 7)，利用PCR产物回收试剂盒纯化酶切产物，然后利用利用T4连接酶连接，16℃反应12 小时，得到重组质粒pYMIKP-PDI1和pYMIKP-SSO1；

(3)PCR扩增带有EcoR I的PGK1p-PDI1-PGK1t基因片段：以步骤(2)所得重组 质粒pYMIKP-PDI1为模板，用引物BPGKF和BPGKR，扩增BamH I-PGK1p-PDI1-PGK1t 基因片段(图8)；

其中，上述BPGKF和BPGKR引物序列为：

BPGKR：5’-CCGGAATTCTCTAACTGATCTATCCAAAAC-3’

BPGKR：5’-CCGGAATTCTAACGAACGCAGAATTTTCGA-3’

PCR反应体系如下：(引物浓度为10μM)

PCR反应条件：98℃预变性5分钟，98℃变性10秒，56℃退火15秒，72℃延 伸3分钟30秒，30个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。胶回收纯化浓缩BamH  I-PGK1p-PDI1-PGK1t基因片段。

(4)重组质粒pYMIKP-SSO1-PDI1的构建：将步骤(3)所得的PGK1p-PDI1-PGK1t 基因片段通过BamH I酶切，将步骤(2)所得的质粒pYMIKP-SSO1通过BamH I酶切(图 8)，利用PCR产物回收试剂盒纯化酶切产物，然后利用利用T4连接酶连接，16℃反应12 小时，得到重组质粒pYMIKP-SSO1-PDI1(图9)；

(5)重组质粒转化酿酒酵母：用Apa I将步骤(4)所得重组质粒pYMIKP-SSO1-PDI1 酶切线性化，然后转化25微升酶切线性化的pYMIKP-SSO1-PDI1到实施例2的步骤(9) 所得菌株BSX006中，用含200μg/ml G418 YPD平板筛选转化子；

(6)PCR验证酿酒酵母转化子：提取步骤(5)所得转化子基因组，以基因组为模 板，分别用引物BPDIF和EPGKR，PCR扩增PDI1-PGKt基因片段(图10)，用BSSOF 和BPGKR，PCR扩增SSO1-PGKt基因片段(图11)，验证Sc-PDI1基因和Sc-SSO1基因 是否整合到基因组上；

PCR反应体系如下：(引物浓度为10μM)

PCR反应条件：94℃预变性10分钟，94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延 伸2分钟，30个循环后72℃延伸10分钟，4℃保存。

(7)复筛转化子：将步骤(6)验证正确的转化子在含10,000μg/ml G418YPD平板 上复筛，以提高质粒的拷贝数(Wang et al.，Biotechnol Lett 2004，26，885-890.)，最后获得重 组酿酒酵母菌株BSX010。

上述重组酿酒酵母菌株BSX010是一株对分子量大且二硫键丰富的异源蛋白分泌能力 提高的酿酒酵母菌株，该菌株命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BSX010，已于 2012年02月08日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC No.5748。

上述重组酿酒酵母菌株BSX010的菌学特征为：CEN.PK102-3A derivative；MATα  ura3-52 leu2-3112；vps10Δ，pmr1Δ，Sc-SSO1，Sc-PDI1，该酵母菌株是单细胞真核微生物，椭 圆形，不运动，营养细胞为单倍体，在固体或液体的复合培养基(YPD，该培养基是现有 技术中已有的)并且添加200μg/ml G418的培养条件下为出芽生殖，液体培养条件下以单 细胞形式存在，固体培养时，呈菌落存在，菌落表面湿润、光滑，呈乳白色。

实施例2：Tr-Cel7A在酿酒酵母中分泌表达

方法如下：

(1)构建分泌表达载体pJCF

①带有Flag标签的Tr-cel7A基因片段通过全基因合成获得(图12)；

②重组质粒pJCF的构建：将步骤①所得带有Flag标签的Tr-cel7A基因片段(核苷酸 如SEQ ID NO.1所示)通过Xba I，将空质粒pJFE2(Peng et al.，Metab Eng 2012，14(1)： 9-18.)用Xba I酶切(图13)，用PCR产物回收试剂盒纯化酶切产物，CIAP处理Xba I 酶切的pJFE2，然后利用T4连接酶连接，16℃反应12小时，得到重组质粒pJCF(图14)；

(2)重组菌株构建：

①重组质粒转化酿酒酵母：分别转化25微升(1)部分步骤②所得具有外切葡聚糖酶 I基因的重组质粒pJCF到出发酿酒酵母菌株CEN.PK102-3A和实施例3的步骤(7)所得 重组酿酒酵母菌株BSX010中，用含SC-Ura平板筛选转化子；

②从步骤①所得重组转化子中，采用试剂盒提取质粒pJCF，以提取的质粒为模板， 用引物XcelF和XcelR扩增Tr-cel7A(图15)，PCR验证正确后，分别获得表达有Tr-Cel7A 的常规菌株BSXC01和待检测菌株BSXC10；

上述待检测菌株BSXC10命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BSXC10，已于 2011年12月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC No.5657；

上述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)BSXC10 CGMCC No.5657的菌学特征为： CEN.PK102-3A(Entian KD and Kotter P，Method Microbiol 1998，26：431-449.)derivative； MATα ura3-52 leu2-3112；vps10Δ，pmr1Δ，Sc-SSO1，Sc-PDI1，Tr-cel7A，该酵母菌株是单细胞 真核微生物，椭圆形，不运动，营养细胞为单倍体，固体或液体的全合成营养缺陷型培养 基(SC-Ura，该培养基是现有技术中已有的)并且添加200μg/ml G418的培养条件下为出 芽生殖，液体培养条件下以单细胞形式存在，固体培养时，呈菌落存在，菌落表面湿润、 光滑，呈乳白色；

(3)菌株培养：将常规菌株BSXC01和待检测菌株BSXC10分别接到在添加2％的葡 萄糖以及200μg/ml G418的Sc-Ura完全合成培养基中，初始OD₆₀₀＝1.0左右，30℃培养48 h，每隔12h取样；

(4)测定胞外分泌的Tr-Cel7A酶活：酶活测定方法参照文献(Deshpande MV et al.， Anal Biochem 1984，138(2)：481-487；Wood TM and Bhat KM，Methods in Enzymology 1988， 160：87-112；Wu B et al.，Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai)2006，38(6)：372-378.)。收集 常规菌株BSXC01和待检测菌株BSXC10的菌液，离心取100微升上清，与50微升Tr-Cel7A 专一性底物底物pNPC(pH5.0，乙酸钠缓冲液配制)混匀，于50℃温浴12h后，用150 微升10％Na₂CO₃终止反应，于405nm处测定吸光值，测定胞外Tr-Cel7A酶活。在50℃， pH 5.0条件下，每分钟水解底物pNPC产生出pNP的微摩尔数，定义为1个酶活力单位。

结果：外切葡聚糖酶I Tr-Cel7A在酿酒酵母中得到活性表达；与仅表达Tr-Cel7A的常 规酿酒酵母菌株BSXC01相比，重组酿酒酵母菌株BSXC10产生的胞外Tr-Cel7A酶活提 高了2.56倍(图16)。

本实验Tr-cel7A基因全长(GenBank：E00389)由上海博尚生物公司实施合成。本实 验所使用的大肠杆菌DH5α感受态细胞以及Taq酶均购于北京全式金生物技术有限公司； 所使用的高保真PrimeSTARHS DNA Polymerase、限制性核酸内切酶、CIAP酶以及T4 DNA连接酶均购于宝生物(大连)有限公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒以及酶切 产物纯化试剂盒均购于OMEGA bio-tek(USA)。相应的实验操作按产品说明书进行。

本实验所用培养基如下：

大肠杆菌培养使用LB培养基，每L含蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g；固体 培养基含琼脂20g；115℃灭菌30分钟；添加氨苄青霉素至100μg/ml用于进行抗性筛选。

YPD为一种培养酵母所用的丰富培养基，每L含蛋白胨20g，酵母膏10g，葡萄糖 20g；固体培养基含琼脂20g。

SC-Ura3-葡萄糖基本培养基(1升)配制如下：YNB(酵母基础氮源，无氨基酸)6.7g/L， 0.77g/L省却尿密啶的混合物，20g/L葡萄糖；固体培养基含琼脂20g/L。

5-FOA培养基(1升)配制如下：6.7g/LYNB(酵母基础氮源，无氨基酸)，0.77g/L省 却尿密啶的混合物，50mg/L尿嘧啶，20g/L葡萄糖，1g/L 5-FOA(5-氟乳清酸)，500ml 蒸馏水，用NaOH调pH至6.0-7.0，用0.2μm孔径滤膜过滤除菌；4％的琼脂115℃灭菌 30分钟；使用时将两部分1/1混合铺倒平板。