一株生产纤维素降解酶的绿色木霉及其在城市绿化废弃物降解中的应用

摘要

本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种绿色木霉菌；另外本发明还涉及该绿色木霉菌的应用。一株高产纤维素酶的绿色木霉菌株，该菌株为木霉属中的绿色木霉

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种绿色木霉菌；另外本发明还涉及该绿色木霉菌的应用。 

背景技术

纤维素是自然界中存量最大的一类可再生资源，以秸秆为例，全世界每年产农作物秸秆约1000～2000亿吨，然而仅有几亿吨纤维素被人类利用。我国是一个农业大国，据粗略统计，我国每年产生农作物秸秆约7亿吨。由于纤维素中存在许多高能氢键，因此其水解、利用较困难，大部分的纤维素类物质都被弃置。大量的纤维素只有一小部分用于纺织、饲料和造纸等方面；绝大多数用作燃料或通过微生物的自然分解回到自然界的碳循环中。这些农用废弃物资源不仅没有得到充分利用，其焚烧又对环境造成了污染。因此合理开发和科学利用这一丰厚的天然资源已成为研究开发的一个重点领域。 

虽然秸秆等农用废弃物的利用收到普遍重视，城市绿化废弃物的生物转化还没有得到足够的关注。近几年来随着城市化的规模逐步扩大，以及城市绿化的不断发展，城市绿化废弃物已经成为城市垃圾的重要组成部分，据报道，南京市每天可产400吨左右的落叶，青岛市每天要产生600多吨落叶。如何处理这些绿化废弃物，并且不污染环境等问题亟待解决。枯叶等绿化废弃物多被运到垃圾场焚烧或者埋掉，而垃圾焚烧后会产生大量浮尘和致癌物质，严重影响环境卫生和居民健康。 

另一方面，落叶和草坪草含有丰富的纤维素成分，可作为可再生资源用于生物能源的生产，解决我国生物能源生产资源短缺的问题。有学者分别研究了木霉对落叶的降解和曲霉对枯草的降解，但二者研究的只是物料的降解，存在降解时间长，还原糖低等问题，另外，也没有考虑降解菌在降解落叶和草坪草后的处理，以及原料的预处理技术。利用高温湿解草坪草的技术也有报道，但该工艺需要特殊的设备，加热温度高达480℃，耗能较多，而生物处理条件温和，更容易操作。 

绿色木霉菌是近年来逐渐受到普遍关注的可用于治理废弃农作物污染及纤维素酶高产菌株的木酶菌，该属细菌可降解多种农用废弃物，包括玉米芯、玉米秸秆、稻草等，但国内对绿色木霉的研究还不够深入，对其应用研究也较少。 

发明内容

本发明的目的是提供一株生产纤维素降解酶的绿色木霉，该菌株可在微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、玉米秸秆等纤维素为唯一碳源的培养基中生长，所产生的发酵液具有降解纤维素的能力。本发明的另一目的是一株生产纤维素降解酶的绿色木霉在城市绿化废弃物降解中的应用，开发高效处理城市绿化废弃物的工艺，一方面减少环境污染和垃圾处理负担，另一方面提高处理效率，并获得高含量的还原糖。 

    本发明一株高产纤维素酶的绿色木霉菌株，该菌株为木霉属中的绿色木霉Trichoderma viride，编号M20，2011年4月2日保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC No.4732。 

所述的绿色木霉菌M20属于半知菌门，丝孢目，2009年于山西秸秆土壤堆积下面土壤中分离，提取绿色木霉菌M20基因组DNA，以ITS通用引物（正向引物ITS1: 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，反向引物ITS4: 5’-CCTCCGCTTATTGATATGC-3’）进行PCR扩增，对序列进行Blastn同源比对，其与Trichoderma viride (GenBank登录号：GU325689.1)具有较高的相似性(99%)，因此命名为绿色木霉菌。 

所述M20的ITS序列：5’-AGGAATACGAGCATTTCAGCTCCCAAACCCAATGTGAACCATACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGGACCAACCAAACTCTTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGACCTCGGGAGCCCCTAAGACGGGATCCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAAAGCGGGAGGAA-3’。 

所述绿色木霉菌培养方法：平板活化，M20在PDA平板上生长，PDA平板配制方法：200g马铃薯去皮，切成块，煮沸30分钟，后用纱布过滤取滤汁，然后加1%葡萄糖，2%琼脂，然后定容至1升，培养温度和时间：30℃，3～5天； 

孢子刚刚长出时，用1000μL的枪头尾圆端取4块菌落接种于种子培养基中，进入种子培养；

其中种子培养基：玉米粉（40目）3g 豆饼粉 1.5g  MgSO₄·7H₂O  0.05g  K₂HPO₄  0.2g，水 100ml,  pH 自然，每瓶250ml的瓶子装培养基50毫升；

M20种子培养时间 2天，摇床转速 150rpm，摇床温度 30℃。

液体产酶培养：利用前述无机盐产酶培养基，种子培养2天后，取种子液1～2ml于发酵培养基中，摇床转速为150rpm，摇床温度 30℃，初始发酵培养基pH 6.0为最佳。 

所述绿色木霉菌M20发酵液在落叶、草坪草等城市绿化废弃物降解中的应用。 

所述绿色木霉菌M20作为纤维素生产菌的应用，利用M20水解落叶和草坪草获得还原糖的方法具体为：A, 菌种种子制备；B, 纤维素酶液体深层发酵；C, 落叶及草坪草预处理及水解；D, 还原糖的获得。 

本发明绿色木霉菌M20的菌落在固体培养基上为圆形，菌落开始为白色，经过3～5天菌落从中心处生长出绿色孢子，经过一周左右菌落完全变成绿色，与文献报道的类似。该菌株可在微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、玉米秸秆、玉米芯等纤维素为唯一碳源的培养基中生长，在以木聚糖为唯一碳源的平板上也生长良好。 

本发明有关分离自山西秸秆堆积处土壤样品的一株绿色木霉菌，其对落叶和草坪草具有较好的水解能力，显示了其利用废弃落叶及绿化垃圾等生产单细胞蛋白和燃料乙醇，解决当前人类面临的能源和资源短缺，以及绿化废弃物焚烧带来的环境污染等一系列棘手问题的重要应用。 

附图说明

 图1是M20在不同浓度微晶纤维素中纤维素酶活力图；

图2是未用稀酸处理过树叶酶解结果图；

图3是稀酸处理过的树叶酶解结果图；

图4是未用稀酸处理过的草坪草酶解结果图；

图5是用稀酸处理过的草坪草酶解结果图。

具体实施方式：

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明并不局限于具体实施例。

实施例1： 

绿色木霉菌M20属于半知菌门，丝孢目，2009年于山西秸秆土壤堆积下面土壤中分离，该菌株在PDA固体培养基上生长良好，培养温度30 ℃，培养3-5天可获得成熟绿色孢子。PDA平板配制方法：200g马铃薯去皮，切成块，煮沸30分钟，后用纱布过滤取滤汁，然后加1%葡萄糖，2%琼脂，然后定容至1升，pH自然。

提取绿色木霉菌M20基因组DNA，以ITS通用引物（正向引物ITS1: 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，反向引物ITS4: 5’-CCTCCGCTTATTGATATGC-3’）进行PCR扩增，对序列进行Blastn同源比对，其与Trichoderma viride具有较高的相似性(99%)，因此命名为绿色木霉菌。Trichoderma viride，编号M20，2011年4月2日保藏于中国普通微生物菌种保藏中心，保藏号为CGMCC N0.4732。 

绿色木霉菌M20可以0.1～2%的微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、落叶、草坪草、玉米秸秆等为唯一碳源生长，因此可用于降解城市绿化废弃物。 

实施例2： 

绿色木霉菌M20在不添加任何无机盐情况下，在2%落叶和草坪草的培养基中生长，并促进落叶和草坪草分解，因此可有效用于城市绿化废弃物的处理。

实施例3： 

绿色木霉菌M20在无机盐产酶培养基中进行液体深层发酵，培养基成分为：0.05% (NH₄)₂SO₄, 0.05% L-天冬氨酸, 0.1% KH₂PO₄ , 0.05% KCl, 0.041% MgSO₄ 7H₂0, 0.01% CaCl₂, 0.05% 酵母粉, 0.1%~4% 纤维素，其中纤维素包括微晶纤维素、稻草粉、玉米芯粉、秸秆粉、麸等。M20以微晶纤维素诱导所产生的纤维素酶活力最高。以0.1，0.2， 0.3，0.4，0.5，1, 1.5，2, 2.5, 3, 3.5 ，4 %微晶纤维素为唯一碳源生长，可产生纤维素酶，其中除0.5%与1%微晶纤维素组测得纤维素酶滤纸酶活较大以外，其他实验组均比较小。较低的微晶纤维素需要量可以降低产纤维素酶的成本。纤维素酶测定方法：准确称取Whatman 滤纸(Cat No. 1001 110) 50mg （规格为1×6cm），将其卷曲成一团放入25ml 的比色管中，加入8000rpm离心5min 的发酵液上清液 0.5 ml 至25ml 比色管中，再加入pH 为4.8 的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液1ml 将滤纸团浸没，50℃ 水浴1h , 立即加入3ml DNS 煮沸 5min，540nm 处测吸光度，算出还原糖含量。酶活单位定义为每分钟生成1.0 μmol葡萄糖（以还原糖计）所需的酶量为1单位，用IU·ml^-1 表示。

表1为不同碳源下纤维素酶活力比较，图1为不同浓度微晶纤维素下纤维素酶活力的比较，可见微晶纤维素是最佳碳源，秸秆粉为比较好的天然底物。 

表1 M20在不同纤维素为唯一碳源的培养基中产生的纤维素酶活力 

纤维素微晶纤维素稻草粉玉米芯粉秸秆粉麸皮相对酶活（%）1006123611

实施例 4：

M20进行液体深层发酵进行纤维素酶生产，菌种种子制备具体路线如下：

1，平板活化，M20在PDA平板上生长，PDA平板配制方法：200g马铃薯去皮，切成块，煮沸30分钟，后用纱布过滤取滤汁，然后加1%葡萄糖，2%琼脂，然后定容至1升。培养温度和时间：30℃，3～5天。

2，孢子刚刚长出时，用1000μL的枪头尾圆端取4块菌落接种于种子培养基中，进入种子培养。 

种子培养基：玉米粉（40目）3g 豆饼粉 1.5g  MgSO₄·7H₂O  0.05g  K₂HPO₄  0.2g，水 100ml,  pH 自然。每瓶250ml的瓶子装培养基50毫升。 

M20种子培养时间 2天，摇床转速 150rpm，摇床温度 30℃。 

3，液体产酶培养： 

   种子培养2天后，取种子液1～2ml于发酵培养基中，发酵产酶培养基配方：(NH₄)2SO4 0.5g, 蛋白胨 0.5g, KH₂PO₄  1g, KCl 0.5g, MgSO₄.7H₂0 0.5g, CaCl₂, 0.1g, 酵母粉0.5g，微晶纤维素 5g，水 1000 ml, pH 6.0，，摇床转速为150rpm，摇床温度 30℃，培养7天。

实施例 5： 

M20的发酵液对落叶与草坪草的降解及产还原糖效果，具体为：

A, 菌种种子制备：采用实施例4制备的种子； 

B, 纤维素酶液体深层发酵；纤维素酶来源：M20 发酵生产。条件：摇瓶装液量400ml/1000ml 摇床转速150rpm 温度 30℃，培养基初始pH 6， 发酵7d 后离心取上清液，4℃冰箱中保藏。

C, 落叶及草坪草预处理及水解；底物：落叶、草坪草粉碎过40目筛，利用0.7%稀硫酸，121℃处理1h，固液比为1：12。取未处理的落叶和草坪草为对照。 

D, 还原糖的获得：底物与酶液的比例为1：60，水解后每隔2小时取样，测量还原糖浓度。 

还原糖测定方法为DNS法。DNS的配方如下： 

甲液：溶解6.9g结晶酚于15.2 mL 10%的NaOH 中，用蒸馏水稀释至69 mL，再加入6.9g NaHSO_3。

乙液：称取255g 酒石酸钾钠，加到300 mL 10% NaOH中，再加入880 mL  1% 

3,5—二硝基水杨酸溶液。

将甲乙液相混即得到黄色DNS试剂，贮存于棕色试剂瓶中。在常温下，放置 

7～10天后使用，半年内有效。

取1 mL 水解液加入到25 mL刻度试管中，再加1.5 mL DNS试剂，摇匀，沸水浴5 min，而后立即用凉水冷却，加蒸馏水定容到25 mL。摇匀后取200 μL在酶标仪上测定540 nm处吸光度，根据标准曲线及稀释倍数计算出样品中总还原糖浓度。 

4. 水解温度为50℃。 

落叶和草坪草利用纤维素酶发酵液水解不同时间的结果如图2-图5。 

底物与酶液的比例为1：20处理的实验组，对比树叶与草坪草水解前后的干重，计算降解率，降解率为干重减轻的量与原干重的比值，结果如下： 

用稀酸处理过树叶12小时酶作用后降解率：2%；

未用稀酸处理过树叶12小时酶作用后降解率：1.7%；

用稀酸处理过草坪草12小时酶作用后降解率：2.6%；

未用稀酸处理过树叶12小时酶作用后降解率：1.9%。

可见，落叶和草坪草不经过稀酸处理也可以达到较高的降解率，因此M20发酵液中的纤维素酶可用于城市绿化废弃物的降解。 

本发明公开的工艺还原糖产量最高可达到4.35 g/L，水解液适度浓缩后，可用于培养酵母生产单细胞蛋白作为饲料，所得到的还原糖也可以作为燃料乙醇发酵的原料。此外，处理后的城市绿化废弃物残渣可作为有机肥，提高附加值。